Basit öğe kaydını göster

dc.contributor.advisorAerts Kaya, Fatima S. F.
dc.contributor.authorErol Duyar, Özgür Doğuş
dc.date.accessioned2024-02-20T06:46:03Z
dc.date.issued2024-02-09
dc.date.submitted2024-01-09
dc.identifier.citationVancouvertr_TR
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/11655/34716
dc.descriptionTÜBÜTAK 219S615 THD-2022-19940tr_TR
dc.description.abstractEROL DUYAR, Ö.D. Optimization and Risk Assessment of RAB27A-/- Gene Therapy Alternatives using Current Molecular Techniques and Technologies. Hacettepe University Graduate School of Health Sciences Stem Cell Doctor of Philosophy Thesis, Ankara, 2024. Griscelli Syndrome Type 2 (GS-2) is caused by a mutation in RAB27A which plays a role in exocytosis and membrane trafficking, resulting in immune deficiency. Here, we investigated 1) the efficacy of CRISPR/Cas9 gene editing of RAB27A using GS-2 MSCs and iPSC lines; 2) the efficacy of LV vectors to transduce MSCs and express RAB27A under the control of the SFFV, PGK and UCOE promoters, and 3) potential risks related to overexpression of RAB27A in immune deficient mice. We designed CRISPR/Cas9 constructs that target mutations in RAB27A and tested the gene correction efficacy on GS-2 MSC and iPSC lines. We generated a new GS-2 iPSC line and optimized cell culture/cryopreservation. Although editing of RAB27A using CRISPR/Cas9 is possible, survival of the stem cells was low. Transduction of GS-2 MSCs with LV vectors showed the highest RAB27A expression with SFFV, followed by PGK and UCOE. RAB27A+ MSCs and HSCs were transplanted into immune deficient mice but did not cause tumor formation. However, RAB27A overexpression may affect stem cell function. In conclusion, we compared the efficiency of gene editing using CRISPR/Cas9 with gene addition using LV vectors for the development of gene therapy for GS-2. Although gene editing results in acceptable levels of repair, the technology results in low cell viability. LV gene transfer was easy and robust, but high expression of RAB27A affected stem cell function. Thus, both methods can be developed into gene therapy for GS-2, but optimization of the procedures, increasing cell viability and fine-tuning of expression levels may be necessary before these therapies are ready for clinical use. Keywords: Griscelli Syndrome Type 2, CRISPR/Cas9, lentivirus, stem cells. (*) This study was supported by grants from the Scientific and Technological Research Council of Turkish Government TÜBİTAK no: 219S675 and Hacettepe University Scientific Research Projects Coordination Unit grant no: TUK-2019-17760 and THD-2022-19940.tr_TR
dc.language.isoentr_TR
dc.publisherSağlık Bilimleri Enstitüsütr_TR
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/embargoedAccesstr_TR
dc.subjectGriscelli Syndrome Type 2tr_TR
dc.subjectCRISPR/Cas9
dc.subjectlentivirus
dc.subjectstem cells
dc.subject.lcshBiyokimya. Hücre biyolojisi. Hücre genetiğitr_TR
dc.titleOptimization and Risk Assessment of RAB27A-/- Gene Therapy Alternatives Using Current Molecular Techniques and Technologiestr_TR
dc.title.alternativeGüncel Moleküler Teknikler ve Teknolojiler Kullanılarak RAB27A-/- Gen Tedavi Alternatiflerinin Optimizasyonu ve Risk Değerlendirilmesitr_TR
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesistr_TR
dc.description.ozetEROL DUYAR, Ö.D. Güncel Moleküler Teknikler ve Teknolojiler Kullanılarak RAB27A-/- Gen Tedavi Alternatiflerinin Optimizasyonu ve Risk Değerlendirilmesi. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Kök Hücre Doktora Tezi, Ankara, 2024. Griscelli Sendromu Tip 2 (GS-2), ekzositoz ve membran trafiğinde rol oynayan RAB27A geninde meydana gelen mutasyonların neden olduğu bir immün yetersizliktir. Bu tez kapsamında 1) GS-2 MKH'leri ve uPKH hatlarını kullanarak RAB27A'nın CRISPR/Cas9 gen düzenlemesinin etkinliğini; 2) LV vektörlerinin SFFV, PGK ve UCOE promoterlerinin kontrolünde MKH'lere aktarım ve RAB27A ekspresyon etkinliğini ve 3) immun yetmezlikli farelerde RAB27A'nın aşırı ifadesine bağlı potansiyel riskleri araştırılmıştır. RAB27A'daki mutasyonları hedef alan CRISPR/Cas9 elemanları tasarlanmış ve GS-2 MKH ve uPKH hatlarında gen düzeltme etkinliği test edilmiştir. Yeni bir GS-2 uPKH hattı oluşturulmuştur ve hücre kültürü/dondurma yöntemi optimize edilmiştir. RAB27A'nın CRISPR/Cas9 yöntemi ile düzeltilmesi mümkün olmasına rağmen kök hücrelerin hayatta kalım oranı düşük olarak bulunmuştur. GS-2 MKH’lere LV transdüksiyonu yapıldığında en yüksek ifadeyi SFFV’nin sağladığı ardından PGK ve UCOE’nun takip ettiği gösterilmiştir. RAB27A+ MKH’ler ve HKH'ler, immun yetmezlikli farelere nakledilmiştir ancak tümör oluşumuna neden olmamıştır. Ancak RAB27A'nın aşırı ifadesinin kök hücre fonksiyonunu etkilediği gösterilmiştir. Sonuç olarak, GS-2 gen tedavisinin geliştirilmesinde CRISPR/Cas9 ile gen düzenleme ve LV vektörü ile gen ekleme karşılaştırılmıştır. Gen düzenleme yeterli düzeyde onarım yapmasına rağmen CRISPR aktarım teknolojisi hücre canlılığının düşürmektedir. LV gen aktarımı kolay ve etkindir ancak RAB27A'nın yüksek ifadesi kök hücre fonksiyonu etkilemektedir. Bu nedenle, her iki yöntem de GS-2 için gen tedavisine yönelik olarak geliştirilebilir, ancak bu tedaviler klinik kullanıma hazır olmadan önce yöntemlerin optimizasyonu, hücre canlılığının arttırılması ve ifade seviyelerinin tam olarak ayarlanması gerekli olabilir. Anahtar Kelimeler: Griscelli Sendromu Tip 2, CRISPR/Cas9, lentivirüs, kök hücreler (*) Bu çalışma, Türkiye Cumhuriyeti Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu TÜBİTAK no: 219S675 ve Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi hibe no: TUK-2019-17760 ve THD-2022-19940 ile desteklenmiştir.tr_TR
dc.contributor.departmentKök Hücre Bilimleritr_TR
dc.embargo.terms6 aytr_TR
dc.embargo.lift2024-08-24T06:46:03Z
dc.fundingTÜBİTAKtr_TR
dc.subtypepresentationtr_TR


Bu öğenin dosyaları:

Bu öğe aşağıdaki koleksiyon(lar)da görünmektedir.

Basit öğe kaydını göster