KİSTİK FİBROZ HASTALARINDA PSEUDOMONAS AERUGİNOSA: ANTİBİYOTİK TOLERANSI, HİPERMUTASYON, BİYOFİLM VE PULSED FİELD (DARBELİ ALAN) JEL ELEKTROFOREZİ (PFGE)/ MULTİLOKUS SEKANS TİPLENDİRMESİ (MLST) YÖNTEMLERİ İLE HASTALAR ARASI BULAŞIN GENOMİK ANALİZİ

GÜRPINAR TOSUN, Ö. Kistik Fibroz Hastalarında Pseudomonas aeruginosa: Antibiyotik Toleransı, Hipermutasyon, Biyofilm ve Pulsed Field (Darbeli Alan) Jel Elektroforezi (PFGE)/ Multilokus Sekans Tiplendirmesi (MLST) Yöntemleri ile Hastalar Arası Bulaşın Genomik Analizi, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Mikrobiyoloji Programı Doktora Tezi, Ankara, 2026. Kistik fibroz (KF), mukosilier klirensin bozulması sonucu kronik ve tekrarlayan solunum yolu enfeksiyonları ile seyreden, morbidite ve mortalitenin akciğer tutulumu ile belirlendiği genetik bir hastalıktır. Kistik fibroz hastalarında özellikle Pseudomonas aeruginosa ile gelişen kronik kolonizasyon ve enfeksiyonlar; biyofilm oluşumu, antibiyotik toleransı, hipermutatör fenotiplerin ortaya çıkışı ve klonal yayılım gibi mekanizmalar aracılığıyla tedaviye dirençli, persistan enfeksiyonlara yol açmakta ve hastalığın prognozunu olumsuz yönde etkilemektedir. Bu çalışmada, KF hastalarından izole edilen P. aeruginosa izolatlarının antimikrobiyal duyarlılık profilleri, direnç mekanizmaları ve moleküler epidemiyolojik özelliklerinin ayrıntılı olarak incelenmesi, olası çapraz bulaşın ortaya konulması ve tedavi stratejilerinin geliştirilmesine katkıda bulunulması amaçlanmıştır. Ocak 2021-Mayıs 2023 tarihleri arasında Hacettepe Üniversitesi İhsan Doğramacı Çocuk Hastanesi Göğüs Hastalıkları Polikliniğinde takip edilmekte olan KF hastalarından hem hastalık hem de rutin hastane ziyaretleri sırasında alınan solunum yolu örneklerinde üreyen P. aeruginosa izolatları çalışmaya dahil edilmiştir. Hastalar ve klinik örneklere ait demografik özellikler, risk faktörleri, KF polikliniğine başvuru tarihi, birlikte muayene olduğu hastalar ile temas öyküsü gibi bilgiler her hasta için hazırlanan hasta bilgi formuna hastayı takip eden Göğüs Hastalıkları hekimi tarafından ileriye dönük olarak doldurularak kayıt altına alınmıştır. İki yıl süreyle takip edilen KF hastalarının solunum yolu örneklerinde üreyen tüm P. aeruginosa (s=151) klinik izolatlarının tür tanımlaması MALDI-TOF MS ile yapılarak konvansiyonel yöntemler ile doğrulanmıştır. Toplam 151 izolata tobramisin, meropenem, seftazidim, levofloksasin ve kolistin için sıvı mikrodilüsyon yöntemi, piperasilin-tazobaktam için gradiyent şerit test uygulanmıştır. Çalışmaya dahil edilen tüm izolatlarda antibiyotik toleransı ve hipermutatör izolatların varlığı fenotipik testler uygulanarak incelenmiştir. Hipermutasyon genleri (mutL ve mutS) ile antibiyotik direnç genleri (blaNDM, blaKPC, blaVIM ve blaIMP) polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile incelenmiştir. Biyofilm yapımı kristal-viyole mikrotitrasyon-plak yöntemi ile incelenirken, siprofloksasin, tobramisin ve sarımsak özütünün antibiyofilm etkinliği Calgary cihazı ile değerlendirilmiştir. Kistik fibroz hastalarında üreyen P.aeruginosa izolatlarının epidemiyolojik açıdan izlemi ve birbirleri ile olan klonal ilişkilerinin tespiti amacıyla izolatlar pulsed field jel elektroforezi (PFGE) yöntemi ile moleküler olarak tiplendirilmiştir. PFGE yöntemi ile tiplendirilen izolatlar içerisinde farklı paterne sahip olan suşlar birbirleri ile olan klonal ilişkilerinin tespiti amacıyla multilokus sekans tiplendirmesi (MLST) ile değerlendirilmiştir. Sıvı mikrodilüsyon sonuçlarına göre; tobramisin direnci %11,2, seftazidim direnci %6,6, levofloksasin direnci %5,3, kolistin direnci %3,3 ve meropenem direnci %1,9 olarak bulunmuştur. Gradiyent test sonucuna göre piperasilin + tazobaktam direnci %1,9’dur. Tüm P. aeruginosa izolatlarının 30 (%19,9)’unda tolerans testinin pozitif olduğu belirlenmiştir. Fenotipik testler ile 151 izolattan 10 (%6,6)’unun hipermutatör olduğu tespit edilmiştir. Çalışmaya dahil edilen 151 P. aeruginosa izolatının 16 (%10,6)’sında blaVIM, saptanırken, hiçbir izolatta blaKPC, blaIMP ve blaNDM direnç genleri saptanmamıştır. Tüm izolatların, 142’sinde (%94) mutL, 140’ında (%92,7) mutS hipermutasyon genleri saptanmıştır. Çalışmaya dahil edilen 151 izolatın 108’inde (%71,5) biyofilm oluşumu kantitatif olarak gösterilmiştir. İzolatlarımızın %16’sında sarımsak özütü (dialil sülfür) ile siprofloksasinin kombine kullanımının, %22,3’ünde ise sarımsak özütü ile tobramisinin kombine kullanılmasının etkili olduğu saptanmıştır. PFGE yöntemi ile analiz edilen 100 izolatın sekizinde bant profili elde edilememiştir. PFGE yöntemi ile bant profili belirlenen 92 izolatın 75’inin MLST ile sekans tipi elde edilmiştir. MLST yöntemi ile en sık belirlenen sekans tipi ST1029’dur.