Show simple item record

dc.contributor.advisorKARATAŞ KURŞUN, Hülya
dc.contributor.authorUZAY, Burak
dc.date.accessioned2019-10-02T13:53:32Z
dc.date.issued2019
dc.date.submitted2019-09-23
dc.identifier.citationUzay B. Farede Optogenetik Yolla Tetiklenen Kortikal Yayılan Depresyonun Subkortikal Yayılım Mekanizmalarının İncelenmesi, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Temel Nörolojik Bilimler (Neuroscience) Programı, Doktora Tezi, Ankara, 2019tr_TR
dc.identifier.urihttp://openaccess.hacettepe.edu.tr:8080/xmlui/handle/11655/9164
dc.descriptionBu çalışma Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi (TSA-2017-14206) tarafından desteklenmektedir.tr_TR
dc.description.abstractUzay B. Investigation of the Subcortical Spreading Mechanisms of the Optogenetically Induced Cortical Spreading Depression in Mice, Hacettepe University Graduate School of Health Sciences Basic Neurological Sciences (Neuroscience) Program, Doctor of Philosophy Thesis, Ankara, 2019.Migraine is a neurological disorder characterized by severe headache attacks. Cortical spreading depression (CSD) is known to be the electrophysiological correlate of migraine aura. CSD results in opening of pannexin-1 megachannels that release ATP in the cortex and triggers parenchymal neurogenic inflammation that precedes meningeal inflammation which is thought to cause migraine headache. Symptoms suggesting subcortical dysfunction are observed during migraine attacks and subcortical structures are known to be affected. It is known that CSD spreads to the subcortical structures, whose mechanisms are yet not completely elucidated. In our study, the effects of purinergic P2X7 receptors on the subcortical spread of CSD and the response of subcortical structures following CSD were investigated using a potent and selective P2X7R antagonist. Experiments were performed in male C57BL6 transgenic mice of the Thy1-ChR2 genotype by inducing CSD optogenetically. Optogenetic CSD threshold was 17.9 mJ, values were accumulated below 30 mJ threshold, and there was no difference between heterozygous and homozygous mice. P2X7R antagonism had no effect on the CSD threshold. In the hypothalamic electrophysiological recordings that were done while triggering CSD, a direct current shift was observed at a mean amplitude of 0.8 mV with a mean delay of 51 seconds. P2X7R antagonism had no effect on this direct current shift. In subcortical structures that were investigated (thalamus, hypothalamus, striatum, hippocampus) and in cortex, expression of P2X7R receptor was increased after CSD, NF-kappa B-p65 was translocated to the nucleus in the astrocytes and c-fos positivity was increased in the hypothalamus. These effects could all be reversed by P2X7R antagonism. In order to investigate neurogenic inflammation in the cortex following CSD in an in vivo setup, an adeno-associated virus (AAV) carrying ‘NF-κB-RE-EGFP’ construct was injected intracortically, CSD was induced by using 1 M KCl-soaked cotton balls and the cortex was imaged by confocal microscope. The preliminary results showed an increase in the signal that was not observed under P2X7R antagonism. In conclusion, P2X7 receptors play an important role in neuronal activation in the hypothalamus after CSD, in the neurogenic inflammation in the cortex and subcortical structures; however, it may not have a direct role in the electrophysiological spread of CSD to subcortical structures. P2X7 receptors may be used as a target in the prophylaxis and treatment of migraine.tr_TR
dc.description.tableofcontentsONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER VE KISALTMALAR xiii ŞEKİLLER DİZİNİ xiv TABLOLAR DİZİNİ xviii 1. GİRİŞ 1 2.GENEL BİLGİLER 4 2.1. Migren 4 2.1.1. Migrenin Klinik Özellikleri 4 2.1.2. Migren ve Trigeminovasküler Sistem 5 2.1.3. Migren ve KYD 7 2.1.4. Migren, KYD ve Nörojenik İnflamasyon 8 2.1.5. Migren ve Hipotalamus 11 2.2. Kortikal Yayılan Depresyon 12 2.2.1. Kortikal Yayılan Depresyonun in vivo Modelleri ve Optogenetik Yol ile Tetiklenmesi 12 2.2.2. Kortikal Yayılan Depresyonun Subkortikal Dokularda Yayılımı 14 2.3. Pürinerjik Sistem 16 2.3.1. Pürinerjik Sistemin Üyeleri 17 2.3.2 P2X7 Kanallarının İnflamasyondaki Rolü 18 2.3.3. P2X7 Kanalları ile KYD Arasındaki İlişki 19 2.4 Nükleer Faktör-Kappa B 20 3. GEREÇ VE YÖNTEM 24 3.1. Deney Hayvanları ve Barınma Koşulları 24 3.2. Anestezi ve Yaşamsal Bulguların Takibi 24 3.3. Cerrahi İşlemler 26 3.3.1. Optogenetik KYD Eşiği Belirlenmesinde Uygulanan Cerrahi 26 3.3.2. İntrakortikal AAV Enjeksiyonu 26 3.3.3. İn vivo NFkB Görüntülemesi için Yapılan Cerrahi 27 3.4. Optogenetik Uyarımın Yapıldığı Thy1-ChR2 Transgenik Hayvanların Genotiplenmesi 28 3.5. Elektrofizyoloji Deneyleri 29 3.5.1. Optogenetik KYD Eşiğinin Belirlenmesi 29 3.5.2. Optogenetik Yolla KYD İndüklenmesi için Optimize Protokolün Oluşturulması 30 3.5.3. KYD’nin Subkortikal Yayılımının İncelenmesi 31 3.6. AAV Üretimi 32 3.6.1. Plazmid Klonlaması 32 3.6.2. E. Coli-DL21 Kompetan Hale Getirilmesi 32 3.6.3. Transformasyon ile Plazmidlerin E.Coli Tarafından Üretiminin Sağlanması 32 3.6.4. Saflaştırılan Plazmidlerin Restiriksiyon Enzimleri ile Kesilerek (RFLP) Doğrulanması 36 3.6.5. HEK293T Hücre Kültürü 37 3.6.6. Üçlü Ko-Transfeksiyon Yöntemiyle AAV Üretimi 37 3.6.7. İodixanol Gradiyanti ile Virüsün Saflaştırılması 37 3.6.8. Virüsün Titre Edilmesi 38 3.7. Farmakolojik Ajanların Uygulanması 39 3.8. İmmünoflöresan Boyamalar 39 3.8.1 İndirekt İmmünoflöresan 40 3.8.2 İmmünosinyal Hibrdizasyon Zincir Reaksiyonu (isHCR) 41 3.9. Western Blotlama 42 3.10. Elde Edilen Görüntülerin Analizi 43 3.11. İstatistiksel Yöntemler 44 4. BULGULAR 47 4.1. Optogenetik Yolla Tetiklenen KYD Eşiğinin Belirlenmesi ve Eşik Protokolünün Optimize Edilmesi 47 4.2. Optogenetik Yolla Tetiklenen KYD Eşiğinin Heterozigot ve Homozigot Hayvanlar Arasındaki Farkı 49 4.3. P2X7R Antagonizminin Optogenetik Yolla Tetiklenen KYD Eşiğine Olan Etkisinin Belirlenmesi 50 4.4. Hipotalamik elektrofizyolojik kayıt ile KYD’nin subkortikal yayılımının gösterilmesi 52 4.5. P2X7R Antagonizminin KYD’nin subkortikal yayılımına olan etkisinin belirlenmesi 53 4.6. Optogenetik yolla tetiklenen KYD sonrası P2X7R Antagonisti verilmiş ve verilmemiş gruplarda kortikal ve subkortikal yapılardaki astrositlerdeki NFkB-p65 translokasyonunun incelenmesi 55 4.7. Optogenetik yolla tetiklenen KYD sonrası P2X7R Antagonisti verilmiş ve verilmemiş gruplarda kortikal ve subkortikal yapılardaki P2X7 Reseptörünün incelenmesi 66 4.8. Optogenetik yolla tetiklenen KYD’nin kortikal ve subkortikal yapılarda P2X7 reseptörünün etki ettiği hücre alt tiplendirmesinin yapılması 76 4.9.P2X7R Antagonizminin optogenetik yolla tetiklenen KYD sonrası hipotalamik c-fos ifadesine olan etkisinin incelenmesi 78 4.10. Optogenetik yolla tetiklenen KYD sonrası, P2X7R antagonisti verilmiş ve verilmemiş gruplarda kortikal ve subkortikal yapılarda P2X7 reseptörü ifadesinin western blotlama incelenmesi 80 4.11. AAV Üretiminde Kullanılan Plazmidlerin Rekombinasyon Olmadan Klonlandığının Sanger Sekanslamayla Gösterilmesi 83 4.12. İntrakortikal AAV enjekte edilmiş hayvanlarda in vivo NF-κB görüntülemesi 86 5.TARTIŞMA 90 5.1. Optogenetik Yolla KYD İndüklenmesi 90 5.2. KYD’nin Subkortikal Yayılımı 92 5.3. KYD ve Pürinerjik P2X7 reseptörleri 96 5.3.1 P2X7 Antagonizması ve KYD’nin Subkortikal Yayılımı 98 5.3.2 KYD’nin P2X7 Reseptörlerine Olan Etkisi 98 5.4. KYD ve Nöroinflamasyon 101 6.SONUÇ VE ÖNERİLER 104 7.KAYNAKLAR 106 8.EKLER EK-1: Tez Çalışması ile İlgili Etik Kurul İzinleri EK-1: Tez Çalışması Orjinallik Raporu 9. ÖZGEÇMİŞtr_TR
dc.language.isoturtr_TR
dc.publisherNörolojik Bilimler ve Psikiyatri Enstitüsütr_TR
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccesstr_TR
dc.subjectKortikal Yayılan Depresyontr_TR
dc.subjectNöroinflamasyontr_TR
dc.subjectMigrentr_TR
dc.subjectSubkortikal Yayılımtr_TR
dc.subjectP2X7Rtr_TR
dc.titleFarede Optogenetik Yolla Tetiklenen Kortikal Yayılan Depresyonun Subkortikal Yayılım Mekanizmalarının İncelenmesitr_TR
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesistr_TR
dc.description.ozetUzay B. Farede Optogenetik Yolla Tetiklenen Kortikal Yayılan Depresyonun Subkortikal Yayılım Mekanizmalarının İncelenmesi, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Temel Nörolojik Bilimler (Neuroscience) Programı, Doktora Tezi, Ankara, 2019.Migren tekrarlayıcı, şiddetli baş ağrısı ataklarıyla kendini gösteren nörolojik bir bozukluktur. Kortikal yayılan depresyonun (KYD), migren aurasının elektrofizyolojik karşılığı olduğu bilinmektedir. KYD kortekste hücre dışına ATP salıveren panneksin-1 megakanallarını açmakta ve parankimal nörojenik inflamasyonu tetiklemektedir. Bu inflamasyonu izleyen meningeal inflamasyonun migren baş ağrısına neden olduğu düşünülmektedir. Migrenin atağı sırasında subkortikal disfonksiyonu düşündüren semptomlar görülmekte, subkortikal yapılar etkilenmektedir. KYD’nin subkortikal yapılara yayıldığı gözlenmiş ancak buna neden olan mekanizmalar aydınlatılamamıştır. Çalışmamızda pürinerjik P2X7 reseptörlerinin KYD’nin subkortikal yayılımına ve KYD sonrası subkortikal yapılarda gerçekleşen yanıta olan etkileri potent ve selektif bir P2X7R antagonisti kullanılarak incelenmiştir. Deneyler, Thy1-ChR2 genotipindeki C57BL6 erkek transgenik farelerde optogenetik yolla KYD tetiklenerek gerçekleştirilmiştir. Optogenetik KYD eşiğinin ortalama 17,9 mJ olduğu, elde edilen eşik değerlerinin 30 mJ altında toplandığı, heterozigot ve homozigot fareler arasında bir fark olmadığı görülmüştür. P2X7R antagonizmasının eşik değerlerine ve KYD parametrelerine etkisi olmamıştır. KYD tetiklenirken alınan hipotalamik elektrofizyolojik kayıtlarda, KYD kaydından ortalama 51 saniye sonra, ortalama 0,8 mV amplitüdünde bir direkt akım kayması gözlenmiştir. P2X7R antagonizmasının bu direkt akım kaymasına etkisi olmamıştır. Deneylerden sonra elde edilen beyin dokularında; incelenen subkortikal yapılarda (talamus, hipotalamus, striatum, hipokampus) ve kortekste KYD sonrasında P2X7 reseptörü ifadesinde artış olduğu, astrositlerde NF-kappa B’nin p65 alt ünitesinin çekirdeğe göç ettiği ve hipotalamusta c-fos pozitifliğinin arttığı gözlenmiştir. Bu etkiler P2X7R antagonizmasıyla engellenebilmiştir. KYD sonrası kortekste gelişen nörojenik inflamasyonun in vivo incelenebilmesi amacıyla intrakortikal ‘NF-κB-RE-EGFP’ plazmidi içeren adeno-asosiye virüs (AAV) enjeksiyonu yapılmış, 1 M KCl kullanılarak KYD indüklenmiş ve konfokal mikroskopta kayıt alınmıştır. Bu deney sonucu elde edilen ön bulgularda sinyal gücünde artış gözlenmiştir. P2X7R antagonizması altında bu artış gözlenmemiştir. Sonuçta P2X7 reseptörlerinin; KYD sonrası hipotalamustaki nöronal aktivasyonda, kortekste ve subkortikal yapılardaki nörojenik inflamasyonda önemli bir rolü vardır; ancak KYD’nin subkortikal yapılara elektrofizyolojik yayılımında direkt rolü olmayabilir. P2X7 reseptörleri migren profilaksisinde ve tedavisinde hedef molekül olarak kullanılabilir.tr_TR
dc.contributor.departmentNörolojik ve Psikiyatrik Temel Bilimlertr_TR
dc.embargo.terms6 aytr_TR
dc.embargo.lift2020-04-05T13:53:32Z
dc.fundingDiğertr_TR


Files in this item

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record