Show simple item record

dc.contributor.advisorSağlam, Necdet
dc.contributor.authorİlhan, Hasan
dc.date.accessioned2019-10-21T12:32:16Z
dc.date.issued2019
dc.date.submitted2019-06-26
dc.identifier.citationİlhan Hasan, ESCHERICHIA COLI VE SALMONELLA ENTERITIDIS TAYİNİNE YÖNELİK YATAY AKIŞ ANALİZ SİSTEMİ GELİŞTİRİLMESİ,2019tr_TR
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11655/9384
dc.description.abstractIn recent years, rapid and accurate detection of pathogenic bacteria has been a current research area in terms of public health and food safety. One of the effective methods for this purpose is Surface-enhanced Raman scattering (SERS), its sensitivity, signal amplification capability, portability, and paper-based horizontal flow immunoassay (LFIA) system; Due to their high analysis rate and low cost, they stand out as a powerful and effective technique for the detection of pathogenic microorganisms. In the first step of this study, E. coli and S. enteritidis strains selected and known common pathogenicity were used to generate the SERS-based LFIA system using the raman tag DTNB; 5,5 ́-Dithiobis(2-Nitrobenzoic acid). Quantitative analysis and rapid detection of selected bacteria was performed after pre-enrichment with Fe3O4/Au-PEI nanoparticles. For this purpose, 20 nm gold nanoparticle (AuNP) and 15 nm Fe3O4/Au-PEI were synthesized. In the next stage, optimized conditions for detection of selected microorganisms were investigated by using rennet enzyme cleaving casein. iv In the second stage of our study, Fe3O4/Au-PEI nanoparticles coated selected bacterial antibody were interacted with E. coli concentrations of 101-107 cfu/mL with used of enzyme based magnetic extraction LFIA system. Then, when the casein was hydrolyzed with the help of rennet, E. coli bound to Fe3O4/Au-PEI nanoparticles was separated by magnetic field. Free bacteria were carried out on nitrocellulose membrane with DTNB raman label bound to AuNPs on conjugation pad (AuNP DTNB antibody complex), and the paper-based LFIA system was then allowed to be detected bacteria concentration on the test line of the nitrocellulose membrane. Tracking the SERS signals of DTNB molecule, LOD: 0,52 cfu/mL and R2: 0,98 values were determined from a linear calibration curve against the increasing concentration of bacteria. These values have been shown to work exclusively for E. coli against different bacterial species such as B. subtilis, M. luteus, S. enteritidis strains. In the third stage of our study, synthetic urine, reference blood and commercial milk samples were used as biological samples. With the developed system, the efficiency of binding of selected E. coli was determined as 86% or more. In the last stage of our study, the effectiveness of E. coli was investigated in synthetic urine, reference blood and commercial milk known as biological samples. Here, this study showed that the synthetic urine, reference blood and milk, valuable nutrients especially indicator E. coli tested as biological samples confirmed the idea that we will detect other pathogen bacteria. In this study, an alternative method was considered due to the expensive antibody used in the determination of pathogen microorganisms. In accordance with this purpose, instead of the antibody used in LFIA system, it is aimed to use bacteriophages as an alternative method because of their natural affinity and high specificity of host selectivity. For this reason, the P22 phage selecting S. enteritidis as the host, and its antibody were used to compare. As a result of bacteriophage study, S. enteritidis (101-107 cfu/mL) was determined from SERS calibration curve as LOD: 7 cfu/mL and R2: 0,98 whereas LOD: 6 cfu/mL and R2: 0,98 were found in our antibody study. These results showed that bacteriophage would be an alternative and inexpensive method compared to antibody in the detection of pathogenic microorganisms. In our in vivo study, egg and chicken samples infected with S. enteritidis were found to bind and separate 90% or more bacteria when using our P22-bacteriophage-based LFIA system. As a result, it was found that our LFIA system works effectively and also bacteriophages can be an alternative method.tr_TR
dc.description.tableofcontentsABSTRACT ........................................................................................................ iii TEŞEKKÜR ........................................................................................................ vi İÇİNDEKİLER .................................................................................................... vii ŞEKİLLER DİZİNİ ................................................................................................ x ÇİZELGELER DİZİNİ ....................................................................................... xiv SİMGELER VE KISALTMALAR ........................................................................ xv 1. GİRİŞ ........................................................................................................ 1 2. GENEL BİLGİLER .................................................................................... 4 2.1. Bakterilerin Yapısı .................................................................................... 4 2.2. Bakteriyofajlar Giriş .................................................................................. 6 2.2.1. Bakteriyofajların keşfi ........................................................................... 7 2.2.2. Bakteriyofajların yapısı ......................................................................... 9 2.2.3. Bakterilerin tespitinde fajlar ................................................................ 10 2.3. Faj Enfeksiyonu ve Yaşam Döngüsü ...................................................... 11 2.3.1. Litik (parçalayıcı) faj ........................................................................... 11 2.3.2. Ilıman Faj............................................................................................ 12 2.3.3. Faj Enfeksiyon Aşamaları ................................................................... 12 2.4. Salmonella faj ......................................................................................... 14 2.5. Yüzeyde Güçlendirilmiş Raman Spektroskopisi (SERS) ........................ 14 2.6. Patojen bakteri tespiti için SERS etiket yöntemleri ................................. 16 2.6.1. SERS etiketleri ................................................................................... 16 2.6.2. Bakterilerin tespiti için SERS etiketleri ................................................ 17 2.6.3. Bakteri tespiti için etiketsiz yöntem ..................................................... 20 2.6.4. Patojen bakterilerin SERS profili ........................................................ 20 2.6.5. Yeni etiketsiz SERS yöntemleri .......................................................... 21 2.6.6. Nanoyapılı metal yüzeye dayalı SERS yöntemi. ................................ 22 2.6.7. Soy metal NP'lerine dayalı SERS yöntemi. ........................................ 22 2.7. Bakterilerin tespiti için çok fonksiyonlu SERS platformu ......................... 24 viii 3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR .................................................................... 27 3.1. Kimyasal Maddeler................................................................................. 27 3.2. Kullanılan Cihazlar ................................................................................. 27 3.3. Kullanılan Diğer Malzemeler .................................................................. 27 3.4. Kullanılan Yöntemler .............................................................................. 28 3.4.1. Çözeltiler ............................................................................................ 28 3.4.2. Benzalkonyum Klorür Kullanılarak Altın Nanopartikül Sentezi ........... 28 3.4.3. Etiket Olarak Kullanılacak Küresel Sitratlı Altın Nanopartikül Sentezi ve Yüzey Modifikasyonu ........................................................................ 30 3.4.4. Sentezlenen Altın Nanopartiküllerin SERS Etkileri ............................ 31 3.4.5. Altın Kaplı Demir Oksit Manyetik Nanopartikül Sentezi Ve Yüzey Modifikasyonu ........................................................................................ 32 3.4.6. Demir Manyetik Nanopartiküllerin Altın ve Polietilen İmin ile Kaplanması: ........................................................................................... 33 3.4.7. Farklı Raman Etiketlerinin AuNP Konjugasyonunda Optimizasyonu . 33 3.4.8. Yatay akışlı immunoassay striplerinin inşası ...................................... 35 3.4.9. Yatay akış immunoassay platformu için test membranı belirlenmesi . 36 3.4.10. Altın nanopartiküllerin agregasyon testi ............................................. 37 3.4.11. Kağıt tabanlı yatay akış immunoassay sisteminin inşa çalışmaları .... 38 3.4.12. Yatay akış immunoassay platformunun E. coli tayininde yapay idrar, referans kan ve ticari süt örneklerinde uygulanması .............................. 40 3.4.13. Manyetik nanoekstraksiyon sonrası E. coli için Yatay Akış İmmunoassay Yöntemi ........................................................................... 41 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA .................................................................. 44 4.1. Manyetik ekstraksiyona dayalı kağıt tabanlı LFIA sistem ....................... 44 4.1.1. Benzalkonyum klorür temelli altın nanopartikül karakterizasyonu ...... 44 4.1.2. Sitrat varlığında AuNP sentezi ve optimizasyon çalışmaları .............. 46 4.1.3. Fe3O4/Au-PEI partiküllerinin sentez ve karakterizasyonu .................. 47 4.1.4. Nitroselelüoz membranda gözenek büyüklük etkileşimleri ................. 52 4.1.5. Altın nanopartikül agregasyon testi .................................................... 53 4.1.6. Farklı Raman Etiketleri ile altın nanopartikül modifikasyonu .............. 55 4.1.7. Manyetik ekstraksiyona dayalı yatay akış immünoassay çalışmaları . 56 ix 4.1.8. Kuantum noktacıkların E. coli antikoru ile modifikasyonu ve enzim ile bölünmesi ............................................................................................... 56 4.1.9. Manyetik nanopartiküllerin E. coli antikoru ile modifikasyonu ve enzim ile bölünmesi ........................................................................................... 60 4.1.10. Manyetik ekstraksiyon ile geliştirilmiş kağıt bazlı LFIA parametrelerinin optimizasyonu ......................................................................................... 61 4.1.11. Manyetik ekstraksiyona dayalı yöntem için kalibrasyon çalışması ..... 65 4.1.12. Geliştirilen kağıt tabanlı LFIA sisteminin örnek denemeleri ................ 68 4.1.13. Manyetik ekstraksiyona dayalı yöntem için seçicilik çalışmları ........... 70 4.1.14. Manyetik ekstraksiyona dayalı yöntem için farklı türdeki manyetik partiküllerin kullanılması ......................................................................... 72 4.2. Bakteriyofaja dayalı kağıt tabanlı LFIA sistem ........................................ 73 4.2.1. Bakteriyofaj bazlı kağıt tabanlı yatay akış immünoassay çalışmaları . 73 4.2.2. İmmünomanyetik ayırım ile S. enteritidis tespiti .................................. 74 4.2.3. Farklı yüzey modifikasyonları ile S. enteritidis tespiti .......................... 75 4.2.4. Faj bazlı ELISA plaka ile bakteri tayini ............................................... 77 4.2.5. Bakteriyofaj bazlı kağıt tabanlı LFIA sistem ........................................ 78 4.2.6. Bakteriyofaj tabanlı LFIA sistemin seçicilik çalışmları ......................... 81 4.2.7. Bakteriyofaj tabanlı sistemin gerçek örnek denemeleri ...................... 83 5. YORUM .................................................................................................. 89 6. KAYNAKLAR ........................................................................................ 100 EKLER ............................................................................................................ 115 6.1. EK 1 – Manyetik partiküllerin FTIR sonucu. .......................................... 115 EK-2 Saf kazein ve manyetik partikül ile kovalent bağlı olan kazein’in FTIR sonuçları ............................................................................................... 116 6.2. EK 2 - Tezden Türetilmiş Yayınlar ........................................................ 117 6.3. EK 3 - Tezden Türetilmiş Bildiriler ........................................................ 118 6.4. EK 6 - Tez Çalışması Orjinallik Raporu ................................................ 119 ÖZGEÇMİŞ ..................................................................................................... 120tr_TR
dc.language.isoturtr_TR
dc.publisherFen Bilimleri Enstitüsütr_TR
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccesstr_TR
dc.subjectSERS
dc.subjectLFIA
dc.subjectDTNB
dc.subjectAuNP
dc.subjectRennet
dc.subjectFe3O4/Au-PEI
dc.subjectBakteriyofaj
dc.subjectAntikor
dc.subject.lcshKonu Başlıkları Listesi::Bilimtr_TR
dc.titleEscherichia Coli ve Salmonella Enteritidis Tayinine Yönelik Yatay Akış Analiz Sistemi Geliştirilmesitr_TR
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesistr_TR
dc.description.ozetSon yıllarda patojen bakterilerin hızlı ve doğru tespiti, halk sağlığı ve gıda güvenliği açısından oldukça güncel bir araştırma alanıdır. Bu amaca yönelik etkin yöntemlerden biriside, Yüzeyde geliştirilmiş Raman saçılması (SERS) olup, duyarlılığı, sinyali çoğaltma yetkinliği, taşınabilirliği ve kâğıt tabanlı yatay akış immünoassay (LFIA) sistem, yüksek analiz hızı, aynı zamanda düşük maliyetli olması nedeniyle patojen mikroorganizma tespitinde güçlü ve etkili bir teknik olarak öne çıkmaktadırlar. Yapılan bu çalışmanın birinci aşamasında, yaygın patojenitesi bilinen ve seçilen E. coli ve S. enteritidis suşları, SERS tabanlı LFIA sistemi oluşturmak için, raman etiketi DTNB; 5,5 ́-Dithiobis(2-Nitrobenzoik asit) kullanıldı, ikinci aşamada da Fe3O4/Au-PEI nanopartikülleri ile ön-zenginleştirme yapıldıktan sonra, seçilen patojen bakterilerin tespiti ve kantitatif analizi gerçekleştirilmiştir. Bu hedefe yönelik olarak, 20 nm boyutunda altın nanopartikül (AuNP) ve 15 nm boyutunda Fe3O4/Au-PEI sentezlenmiştir. Daha sonraki aşamada da kazeini parçalayan rennet enzimi kullanılarak seçilen mikroorganizmaların tespitinde optimize koşullar araştırılmıştır. Araştırmamızın ikinci aşamasında, enzim tabanlı manyetik ekstraksiyon sistemi kullanılarak, seçilen bakteri antikoru ile kaplı Fe3O4/Au-PEI nanopartiküller, 101-107 ii kob/mL E. coli derişimleri olacak şekilde etkileştirilmiştir. Daha sonra rennet yardımıyla kazein hidroliz edildiğinde, Fe3O4/Au-PEI nanopartiküllerine bağlı bulunan E. coli manyetik alan yardımıyla ayrılmıştır. Serbest bakteriler konjugasyon ped (AuNP+DTNB+antikor kompleksi) üzerinde altın nanopartiküllere bağlı olan raman etiket DTNB ile nitroselüloz membran üzerinde yürütülmüş, ve bakteri derişimi kağıt tabanlı LFIA sistem nitroselüloz membran üzerinde bulunan test çizgisi ile tespit edilmesi sağlanmıştır. DTNB molekülünün SERS sinyallerini takip edilerek bakterinin artan konsantrasyonuna karşı lineer bir kalibrasyon eğrisinden LOD: 0,52 ve R2 değerleri de 0,98 olarak saptanmıştır. Bu değerler farklı bakteri türlerine B. subtilis, M. luteus, S. enteritidis suşlarına karşı sadece E.coli‘ye spesifik olarak çalıştığı gösterilmiştir. Çalışmamızın üçüncü aşamasıda, biyolojik örnek olarak sentetik idrar, referans kan ve ticari süt örnekleri kullanılmıştır. Geliştirilen sistem ile seçilen E. coli’yi ne kadar tuttuğumuzun etkinliği %86 ve üzeri olarak saptanmıştır. Yaptığımız bu çalışmada patojen mikroorganizmaların tayininde kullanılan antikorun pahalı olması nedeniyle alternatif bir yöntem düşünülmüştür. Bu amaca uygun olarak, LFIA sistemde kullanılan antikor yerine, doğal afiniteleri ve yüksek özgüllükte konak seçicilikleri nedeniyle bakteriyofajların alternatif yöntem olarak kullanılması hedeflenmiştir. Bunun için S. enteritidis’i konak olarak seçen P22 fajı ve kıyaslamak amacıyla antikoru kullanılmıştır. Yapılan bakteriyofaj çalışması sonucunda S. enteritidis (101-107 kob/mL) SERS kalibrasyon grafiklerinden LOD: 7 kob/mL ve R2: 0,98 olarak saptanırken, antikor çalışmamızda LOD: 6 kob/mL ve R2: 0,98 bulunmuştur. Bu sonuçlar göstermiştir ki patojen mikroorganizmaların tayininde bakteriyofajın antikora kıyasla alternatif ve ucuz bir yöntem olacağı görülmüştür. In vivo çalışmamızda S. enteritidis ile enfekte edilen yumurta ve tavuk eti örnekleri, P22-bakteriyofaj tabanlı yatay akış sistemimiz kullanıldığında, %90 ve üzerinde bakteriyi tuttuğu ve ayırdığı saptanmıştır. Sonuçta yatay akış sistemimizin etkin çalıştığı ayrıca bakteriyofajların alternatif bir yöntem olabileceği görülmüştür.tr_TR
dc.contributor.departmentNanoteknoloji ve Nanotıptr_TR
dc.embargo.termsAcik erisimtr_TR
dc.embargo.lift2019-10-21T12:32:16Z


Files in this item

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record