| dc.contributor.advisor | Tacal, Özden | |
| dc.contributor.advisor | Lockridge, Oksana | |
| dc.contributor.author | Önder, Seda | |
| dc.date.accessioned | 2018-08-06T07:26:58Z | |
| dc.date.available | 2018-08-06T07:26:58Z | |
| dc.date.issued | 2018 | |
| dc.date.submitted | 2018-07-13 | |
| dc.identifier.citation | Önder, S. Organosfatlara Maruziyet Sonrasında Oluşan Protein Eklenti Ürünlerini Tanıyan Monoklonal Antikorun Karakterizasyonu. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Biyokimya Programı Doktora Tezi, Ankara, 2018. | tr_TR |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11655/4750 | |
| dc.description.abstract | Organophosphorus (OP) pesticides are irreversible inhibitors of cholinesterases [acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE)]. The OPs cause the acute toxic effect by covalent binding to a serine amino acid in the active site of AChE. Proteins that have no active site serine, such as albumin, are covalently modified by OPs on tyrosine and lysine. The covalent bond of OP compounds with tyrosine is more stable than with serine. Chronic illness from OP pesticides exposure is not explained by inhibition of AChE and BChE. New biomarkers are needed to elucidate the cause of chronic toxicity. The goal of this study was to design and characterize monoclonal antibody that recognizes protein adducts on tyrosine that would be useful in the identification of new biomarkers. Various diethoxyphosphate-tyrosine peptides were synthesized and cross-linked to 4 different carrier proteins. Monoclonal antibody called as depY were produced with hybridoma technology using the conjugated proteins. DepY antibody was purified and characterized by ELISA, Western Blot, Biocore, Octet technology to determine binding affinity and binding specificity. The results showed that depY recognizes diethoxyphospho-tyrosine modified proteins and peptides independent of the surrounding amino acid sequence. Furthermore, HEK293 cell lysates were treated with chlorpyrifos oxon. When tryptic peptides immunopurified with depY-Sepharose were analyzed by mass spectrometry, 116 diethoxyphosphate-tyrosine modified peptides from 73 proteins were identified. Consequently, the use of depY monoclonal antibody could be useful for identifying novel biomarkers of OP exposure and for analyzing modified proteins in any species.
Keywords: Organophosphate, chlorpyrifos oxon, depY monoclonal antibody, diethyloxyphosphate-tyrosine, mass spectrometry.
This thesis | tr_TR |
| dc.description.sponsorship | TÜBİTAK 2211A | tr_TR |
| dc.description.tableofcontents | İÇİNDEKİLER
ONAY SAYFASI iii
YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv
ETİK BEYAN v
TEŞEKKÜR vi
ÖZET vii
ABSTRACT viii
İÇİNDEKİLER ix
SİMGELER VE KISALTMALAR xiii
ŞEKİLLER xv
TABLOLAR xvii
1. GİRİŞ 1
2. GENEL BİLGİLER 3
2.1. Organofosfatlar 3
2.1.1. Organofosfatların Genel Kimyasal Yapısı 4
2.2. Organofosfat Pestisitler 7
2.3. Klorprifos 8
2.3.1. Klorprifosun Kimyasal Yapısı ve Fiziksel Özellikleri 8
2.3.2. Klorprifosa Maruziyet 9
2.3.3. Klorprifos Metabolizması 9
2.4. Klorprifos için Hedef Proteinler 11
2.4.1. Asetilkolinesteraz: Klorprifosun Birincil Hedefi 11
2.4.2. Nöropati Target Esteraz 14
2.4.3. Bütirilkolinesteraz 14
2.4.4. Serin Hidrolazlar 18
2.4.5. Düşük Doz OP Maruziyeti 19
2.4.6. Diğer Klorprifos Hedefleri 19
2.4.7. Beta Glukronidaz 20
2.4.8. Açilpeptit Hidrolaz 20
2.4.9. Reseptörler 21
2.4.10. Albümin 22
2.4.11. Tübülin 23
x
2.5. Tirozin 25
3. GEREÇ VE YÖNTEM 29
3.1. Gereçler 29
3.2. Yöntemler 30
3.2.1. Dietoksifosfotirozin İçeren Peptitlerin Hazırlanması 30
3.2.2. Dietoksifosfotirozin Modifiye Peptitlerin Saflaştırılması 31
3.2.3. Dietoksifosfotirozin Modifiye Peptitler için Amino Asit Miktar Tayini ve Spektrumlarının Analizi 31
3.2.4. Dietoksifosfotirozin Modifiye Peptitlerin Taşıyıcı Proteinlere Konjugasyonu 32
3.2.5. MALDI-TOF Kütle Spektrometri ile Taşıyıcı Proteinlere Bağlı Dietoksifosfotirozin Modifiye Peptit Sayılarının Belirlenmesi 33
3.2.6. Proteinlerin Klorprifos Okson ile Muamele Edilmesi 33
3.2.7. Monoklonal Antikor Üretimi 34
3.2.8. Monoklonal Antikorun Saflaştırılması 35
3.2.9. Saflaştırılmış DepY’nin İzotipinin Belirlenmesi 35
3.2.10. DepY İmmobilize Sefaroz Reçinenin Hazırlanması 35
3.2.11. ELISA 36
3.2.12. Western Blot Analizi 36
3.2.13. İnsan Serum Albümine Konjuge Dietoksifosfolizinin Hazırlanması ve DepY Monoklonal Antikor ile ELISA 37
3.2.14. Klorprifos Okson, Diklorvos ve Krezil Saligenin Fosfat ile Modifiye İnsan BChE’nin Hazırlanması ve DepY Monoklonal Antikor ile ELISA 37
3.2.15. Diklorvos ile Modifiye Peptitlerin Hazırlanması ve DepY Monoklonal Antikor ile İmmuno MALDI 38
3.2.16. IC50 Değerinin Yarışmalı ELISA ile Belirlenmesi 39
3.2.17. Kd Değerinin Bio-Layer İnterferometri ile Belirlenmesi 39
3.2.18. Kd Değerinin Biacore Analizi ile Belirlenmesi 40
3.2.19. DepY Monoklonal Antikor ile Tanımlanabilen En Düşük Antijen Miktarının Western Blot Analizi ile Belirlenmesi 40
xi
3.2.20. İnsan Serum Albümine Konjuge O-fosfo-L-tirozinin Hazırlanması ve PY20 Monoklonal Antikor ile Western Blot Analizi 40
3.2.21. Hücre Lizatlarının Hazırlanması ve Klorprifos Okson ile Muamele edilmesi 41
3.2.22. Hücre Lizatlarının ELISA ile Analizi 43
3.2.23. Hücre Lizatlarının Kapiller Elektroforez- Western Blot ile Analizi 43
3.2.24.Kütle Spektrometri Analizleri için Hücre Lizat Örneklerinin Hazırlanması 43
3.2.25.Triple-TOF 6600 Sıvı Kromatografi Tandem Kütle Spektrometri 45
3.2.26. OrbiTrap Fusion Lumos Sıvı Kromatografi Tandem Kütle Spektrometri 46
4. BULGULAR 48
4.1. OP-Peptitlerin Soğurma Katsayıları 48
4.2. Taşıyıcı Proteinlere Konjuge Dietoksifosfotirozin Modifiye Peptitlerin ve Kontrol Peptitlerin Sayısı 48
4.3. Klorprifos Okson ile Muamele Edilen Proteinlerde Modifiye Olan Amino Asitler ve Miktarları 51
4.3.1. İnsan Albümini 51
4.3.2. Fare Albümini 52
4.3.3. Aprotinin 53
4.3.4. Kazein 53
4.3.5. Sığır Tübülin 56
4.3.6. Domuz Tübülin 58
4.4. DepY Monoklonal Antikor İzotipi 62
4.5. DepY Monoklonal Antikor Farklı Amino Asit Dizisine Sahip Dietoksifosfotirozin Modifiye Proteinleri Tanımaktadır 62
4.6. DepY Monoklonal Antikor Dietoksifosfolizin Modifiye Proteinleri Tanımamaktadır 65
4.7. DepY Monoklonal Antikor CBDP, Diklorvos ve CPO Modifiye İnsan BChE’yi Tanımamaktadır 65
4.8. DepY Monoklonal Antikor Diklorvos Modifiye Tirozini Tanımamaktadır 66
xii
4.9. Dietoksifosfotirozin Modifiye Domuz Tübülinin DepY Monoklonal Antikora Bağlanma Afinitesinin Yarışmalı ELISA ile Analizi 68
4.10. Dietoksifosfotirozin Modifiye Proteinlerin DepY Monoklonal Antikora Bağlanma Afinitesinin Bio-Layer İnterferometri ile Analizi 68
4.11. Dietoksifosfotirozin Modifiye Peptitlerin DepY Monoklonal Antikora Bağlanma Afinitesinin Biacore ile Analizi 71
4.12. DepY Monoklonal Antikor ile Tanımlanabilen En Düşük Antijen Miktarının Belirlenmesi 72
4.13. Anti-fosfo-L-tirozin Monoklonal Antikorun (PY20) Dietoksifosfotirozin Modifiye Proteinleri Tanımamaktadır 73
4.14. Klorprifos Okson ile Muamele Edilen HEK 293 Hücre Lizatlarının ELISA ile Analizi 74
4.15. Klorprifos Okson ile Muamele Edilen HEK 293 Hücre Lizatlarının Kapiller Elektroforez- Western Blot ile Analizi 74
4.16. Klorprifos Okson ile Muamele Edilen HEK 293 Hücre Lizatlarının LC-MS/MS Kütle Spektrometri ile Analizi 76
5. TARTIŞMA 88
5.1. Hedef Olarak Dietoksifosfotirozinin Seçilme Nedeni 88
5.2. Literatürde OP Eklenti Ürünlerini Tanıyan Antikorlar 89
5.3. Aktif Bölgesinde Serin İçermeyen Proteinlerde Tirozin ve Lizin Amino Asitleri, Serine Göre Daha Reaktiftir 89
5.4. DepY Monoklonal Antikor Seçiciliği 90
5.5. DepY Monoklonal Antikor için Afinite 91
5.6. CPO ile Tirozin üzerinden Kovalent Olarak Modifiye Edilen Proteinler 92
5.7. Fizyolojik İlişki 93
5.8. Fosfo-tirozin Bölgeleri ile Reaksiyon 94
5.9. Diğer OP Çalışması ile Karşılaştırma 95
6. SONUÇ VE ÖNERİLER 97
7. KAYNAKLAR 98
8. ÖZGEÇMİŞ | tr_TR |
| dc.language.iso | tur | tr_TR |
| dc.publisher | Sağlık Bilimleri Enstitüsü | tr_TR |
| dc.rights | info:eu-repo/semantics/openAccess | tr_TR |
| dc.subject | Organofosfat | tr_TR |
| dc.subject | klorprifos okson | |
| dc.subject | depY monoklonal antikor | |
| dc.subject | dietoksifosfotirozin | |
| dc.subject | kütle spektrometri | |
| dc.title | Organosfatlara Maruziyet Sonrasında Oluşan Protein Eklenti Ürünlerini Tanıyan Monoklonal Antikorun Karakterizasyonu | tr_TR |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis | tr_TR |
| dc.description.ozet | Organofosfat (OP) pestisitler, kolinesterazların [asetilkolinesteraz (AChE) ve bütirilkolinesteraz (BChE)] tersinmez inhibitörüdür. OP’ler, akut toksik etkisini AChE’nin aktif bölgesindeki serin amino asidine kovalent bağlanarak göstermektedir. Aktif bölgede serin içermeyen proteinler (örneğin albümin) ise, tirozin ve lizin amino asitlerinden OP bileşikler ile kovalent olarak modifiye edilmektedir. OP’lerin tirozin amino asidi ile yaptığı kovalent bağ, serin ile yaptığı kovalent bağa göre daha stabildir. AChE ve BChE inhibisyonu, OP pestisitlere maruziyet sonrasında ortaya çıkan kronik hastalıkların nedenini açıklayamamaktadır. Kronik OP toksisitesinin nedeninin aydınlatabilmesi için yeni biyobelirteçlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışmanın amacı, yeni biyobelirteçlerin belirlenmesinde kullanılmak üzere tirozine bağlı protein eklenti ürünlerini tanıyan bir monoklonal antikor tasarlamak ve karakterize etmektir. Çalışmada, farklı amino asit dizilerine sahip dietoksifosfotirozin peptitleri sentezlenip 4 farklı taşıyıcı proteine konjuge edildi. Konjuge proteinler kullanılarak hibridoma teknolojisi ile depY olarak isimlendirilen monoklonal antikor üretildi. DepY antikoru saflaştırıldı ve bağlanma afinitesi ve özgüllüğünü belirlemek için ELISA, Western Blot, Biocore, Octet teknolojisi ile karakterize edildi. Sonuçlar, depY antikorun, amino asit dizisinden bağımsız olarak sadece dietoksifosfotirozin modifiye protein ve peptitleri tanıdığını gösterdi. Ayrıca HEK293 hücre lizatları, klorprifos okson ile muamele edildi. Triptik peptitler, depY-Sefaroz reçine ile saflaştırılıp kütle spektrometri ile analiz edildiğinde; 73 proteine ait 116 dietoksifosfotirozin modifiye peptit tanımlandı. Sonuç olarak, depY monoklonal antikoru, OP maruziyetinin yeni biyobelirteçlerinin tanımlanmasında ve herhangi bir türdeki dietoksifosfotirozin modifiye proteinlerin belirlenmesinde yararlı olacaktır. | tr_TR |
| dc.contributor.department | Biyokimya | tr_TR |
| dc.contributor.authorID | 233341 | tr_TR |
