| dc.description.ozet | Mezenkimal stromal/kök hücreler (MKH'ler), multipotent özelliklere ve kendini yenileme yeteneklerine sahip iğ şeklindeki hücrelerdir. MKH'ler hücre kültür kaplarına yapışır ve kondrositlere, osteositlere ve adipositlere farklılaşabilmektedirler. ISCT (International Society for Cell and Gene Therapy) kriterlere göre kemik iliği (Kİ) kaynaklı MKH'ler (Kİ-MKH) hücre yüzeyi belirteçleri olan CD73, CD90 ve CD105 için pozitif; CD45, CD34, CD14, CD11b ve HLA-DR belirteçleri için ise negatiflerdir. Hücreler hem kolayca izole edilebilmekte hem de düşük immünojeniteye sahiptirler. MKH'ler hem Kİ, yağ dokusu gibi yetişkin dokulardan hem de plasenta, göbek kordonu ve amniyotik sıvı gibi fetal dokulardan izole edilebilmektedirler. MKH'ler yüksek proliferatif kapasiteye sahip olmaları, göç için kemotaksik sinyallere yanıt vermeleri ve yaralanma bölgelerine yönelmelerinin yanı sıra önemli immünomodülatuar özelliklere de sahiptirler. Bu özelliklerinden dolayı MKH'ler rejeneratif tıp alanında ve (oto)immün hastalıkların tedavisinde özellikle önemli hale gelmişlerdir. Son yirmi yıldır MKH'ler çeşitli klinik çalışmalarda test edilmiş ve klinik kök hücre tedavisi için hem etkili hem de güvenli kaynaklar oldukları gösterilmiştir. Kök hücreler yaşam boyunca hem in vivo hem de in vitro koşullar altında çeşitli stres durumlarıyla karşılaşabilmektedir. Hücrelerin strese karşı verdikleri tepki; hücre tipine, stres kaynağına ve stresin süresine bağlı olarak değişebilmektedir. Stres faktörlerine yanıt olarak hücreler, hayatta kalmalarını desteklemek veya yeni bir dengeyi yeniden kurmak için çok çeşitli koruyucu mekanizmaları etkinleştirebilmektedir. Kronik stres durumlarında veya strese karşı koruyucu mekanizmalar stresi azaltmak için yeterli olmadığında apoptotik veya otofaji yolakları aktive olmaktadır. Dolayısıyla hücrenin hücresel stresle nasıl ve ne kadar başa edebildiği, kaderini belirlemektedir. Aşağıda hücrelerin yaşam boyunca karşılaşabileceği farklı stres koşulları ve onlara karşı verdikleri tepkiler tartışılmaktadır. Endoplazmik retikulumu (ER), hem salgılanan ve membrana bağlı proteinlerin katlanmasında hem de hücre içi kalsiyum homeostazisinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Homeostatik koşullar altında üç ER stres sensörü vardır; PKR benzeri ER kinaz (PERK), İnositol gerektiren enzim 1a (IRE1a) ve aktive edici transkripsiyon faktörü 6 (ATF6). Normal şartlarda bu sensörler aktif değildir ve ER moleküler şaperonu GRP78'e (veya BiP) bağlı durumdadır. Protein sentezi sırasında ER'deki katlanmamış/yanlış katlanmış proteinlerin sayısı artar ve proteinler, uygun şekilde katlanıncaya kadar ER'de bekletilmektedir. Proteinler doğru üçüncül şekillerine uygun şekilde katlanamazsa, proteinler veya peptidler yok edilmek üzere işaretlenmektedir. Protein üretimindeki artış veya protein katlama kapasitesindeki azalma, katlanmamış/yanlış katlanmış proteinlerin birikmesi nedeniyle ER stresine sebep olmaktadır. ER stresine yanıt olarak, katlanmamış protein yanıtı (UPR) adı verilen bir süreç başlatılmaktadır. UPR, katlanmamış/yanlış katlanmış proteinleri ortadan kaldırmak için GRP78'in sensörlerden serbest bırakılmasıyla başlamaktadır. Bu süreç PERK ve IRE1a'nin otofosforilasyonuna ve ATF6'nın ER'den Golgi kompleksine göç etmesine neden olmaktadır. ER stres seviyeleri arttığında, hücreler başlangıçta ER ekspansiyonu ile protein katlama kapasitelerini artırarak, diğer proteinlerin üretimini azaltarak ve şaperon proteinlerinin sentezinde bir artış sağlayarak, katlanmamış/yanlış katlanmış proteinlerin parçalanması veya düzeltilmesiyle sonuçlanan ER stresini azaltmaya çalışılacaktır. PERK'nin aktivasyonu, ökaryotik başlatıcı faktör 2a'nin (eIF2a) aşağı yönde aktivasyonu ve daha sonra çekirdeğe giren ve apoptotik yol C/EBP homolog proteininin (CHOP), X-box'ın gen ekspresyonunu artıran transkripsiyon faktörü 4'ün (ATF4) aktive edilmesiyle sonuçlanmaktadır. ER stresi sonucunda gerçekleşen IRE1a otofosforilasyonuyla sXBP1 proteininde bir artışa ve ATF6 proteininin ER membranından ayrılmasına neden olmaktadır. ATF6 daha sonra Golgi organeline yerleşerek, modifiye edilerek ATF6N olarak çekirdeğe girip; şaperon, lipit ve XBP1 üretimini arttırmaktadır. Stres uzun süre devam edilip aşılmaz olduğunda ise UPR, CHOP'un aktivasyonuyla proapoptotik bir yanıtı aktive edebimektedir. Sonunda ER stresi yeterince azaltılamadığında hücre otofaji veya apoptotik yolların aktivasyonu yoluyla yok edebilmektedir. Oksidatif stres (OS), reaktif oksijen ve nitrojen türlerinin (ROS ve RNS) düzensiz üretimi ve/veya temizlenememesi ile karakterize edilmektedir. Yüksek ROS düzeyleri hücresel hasara ve işlev bozukluğuna neden olurken, düşük bazal ROS düzeylerinin hücre için gerekli olduğu ve hücresel çoğalmayı, farklılaşmayı ve hayatta kalmayı sürdürdüğü düşünülmektedir. ROS'un yaklaşık %90'ı mitokondriyal elektron taşıma sistemleri (ETS) tarafından endojen olarak üretilmektedir. Radyasyon, ultraviyole ışık, hipoksi ve düşük sıcaklık gibi dış faktörler de ROS üretiminin artmasına neden olmaktadır. ROS hücre içi sinyalleşme ve iletişimde önemli bir rol oynamaktadır. Hücrelerin fizyolojik çoğalması ve farklılaşması için belirli seviyelerde ROS gerekli olmasına rağmen, aşırı ROS'un MKH'lerde fonksiyonel hasara neden olduğu gösterilmiştir. Sürekli artan ROS seviyeleri, biyolojik makromoleküllerde (DNA/RNA) kırıkların meydana gelmesi yoluyla hücrede ciddi hasara neden olabilmekle birlikte genomik dengesizliğe yol açabilmektedir. Kök hücreler, güçlü antioksidan/DNA onarım mekanizmaları nedeniyle diğer olgun hücrelere göre OS'ye nispeten daha dayanıklıdır. Ayrıca kök hücreler, oksidatif fosforilasyon yerine glikolize bağımlı olmaları nedeniyle bu hücreler OS'ye karşı daha az duyarlı olup, bu da onları OS'ye karşı kendilerini korumak için olgun hücrelere göre daha avantajlı kılmaktadır. Ancak savunma mekanizmaları yetersiz kalırsa OS, ER stresine benzer şekilde kronikleşebilmektedir. Devam eden OS, nörodejeneratif ve metabolik hastalıklar gibi çeşitli insan hastalıklarının başlangıcına ve ilerlemesine neden olduğu gösterilmiştir. Antioksidan moleküller OS'yi azaltır ve hücreyi uzun süreli strese karşı koruyabilmektedir. Artan katalaz ekspresyonu, hücrenin OS'ye karşı direncini artırmaktadır. ER stresine benzer şekilde, XBP1 ve hedef genleri OS'ye yanıt olarak aktive edilerek DNA hasarı onarımını ve redoks homeostazisini düzenlemektedir. XBP1'in baskılanmasının, artan ROS seviyeleri ve kalıcı p38 fosforilasyonu yoluyla OS'yi arttırdığı gösterilmiştir. XBP1'in silinmesi veya susturulması, süperoksit dismutaz 1 (SOD1) ve tioredoksin redüktaz 1 (TXNRD1) dahil olmak üzere antioksidan genlerin ekspresyonunun azalmasına neden olmaktadır (7). Yaşlanan hücreler, yaşlanma fenotipini diğer hücrelere yayarak ve inflamatuar proteinlerin salgılanmasına neden olarak komşu hücrelerin davranışını etkileyen yaşlanmayla ilişkili salgı fenotipi (SASP) kazanmaktadır. Mekanik olarak yaşlanma, proliferatif uyaranların varlığına rağmen geri döndürülemez bir hücre döngüsü durması ile karakterize edilmekte ve eksojen/endojen mutajenlerin neden olduğu replikasyon hatalarının bir sonucu olarak biriken DNA hasarından kaynaklanmaktadır. DNA hasar tepkisi (DDR) sırasında p53 stabilizasyonu ile mutasyonları tespit edilmekte ve p21 aktivasyonu yoluyla hücre döngüsünü zorla durdurarak DNA onarımını başlatmaktadır. Ancak DNA hasarı devam ederse; p38-mitojenle aktifleştirilen protein kinaz (MAPK) aktivasyonu, mitokondriyal fonksiyon bozukluğuna, CDK inhibisyonuna ve Rb1 aktivasyonuna neden olarak hücresel yaşlanmayı tetikleyebilmektedir. Ek olarak, artan ROS seviyeleri telomer erozyonunu hızlandırabilmekte ve mitokondriyal metabolizmayı daha da azaltabilmektedir. Ayrıca bu durum kök hücrelerin hücre döngüsünden kalıcı olarak çıkmasına sebep olmaktadır. Telomerler tüm ökaryotik kromozomların uçlarında bulunur ve kısa nükleotid TTAGGG tekrarlarından oluşmaktadır. DNA replikasyonu sırasında DNA'nın uç kısmı kopyalanmadığından dolayı her replikasyon döngüsünde telomerler kısalmaktadır. Biriken DNA hasarı ve telomerlerin kısalması sonucunda MKH'lerin kendini yenileme ve rejeneratif potansiyeli azalarak, hücreler replikatif yaşlanmaya girmektedir. Yaş, obezite ve sistemik inflamasyon gibi diğer faktörlerin de bu yaşlanma sürecini hızlandırarak kök hücre fonksiyonunu daha fazla negatif yönden etkilediği gösterilmiştir. Yaşlanmanın bir başka biyolojik belirteci yaşlanmayla ilişkili b-galaktosidazdır (SA-B-Gal). Sağlıklı hücrelerde b-galaktosidaz pH 4.0'da eksprese edilirken, yaşlanmayla ilişkili bu SA-B-Gal'in ifadesi pH 6.0'da olduğu gösterilmiştir ve sağlıklı ve yaşlanmış hücreleri ayırt etmek için kullanılabilmektedir. Obezite küresel bir halk sağlığı sorunu olup, diyabet, kardiyovasküler hastalıklar gibi metabolik hastalıkların olasılığını arttırmaktadır. Hem karbonhidrat hem de lipit metabolizması obeziteden etkilenmektedir. Glikolipotoksisitenin bir sonucu olarak ER fonksiyonunun bozulması; olgunlaşmamış, yanlış katlanmış veya katlanmamış proteinlerin birikmesine neden olmaktadır. ER stresi kronikleşirse hepatik lipogenezi indüklemekte ve pankreatik beta hücrelerinde glukozla uyarılan insülin sekresyonunu bozarak karaciğer ve pankreasta fonksiyonel bozukluklara neden olmaktadır. Yetişkinlerde obezite, vücut kitle indeksi (BMI) kullanılarak ölçülür; burada 20-25'lik bir BMI sağlıklı bireyleri, BMI ≥ 25 obezleri ve BMI ≥30 morbid obez hastaları temsil etmektedir. Kök hücrelerin rejeneratif tıp amacıyla kullanım alanları hızla genişlemektedir. Genel popülasyonda obezite oranlarının yükselmesi ve obezitenin kök hücre fonksiyonu üzerindeki olası (olumsuz) etkilerinin aydınlatılması hızla önem kazanmıştır: kök hücre ve doku onarım fonksiyonlarının obeziteden etkileyebildiği için tedavi hedefi olarak kullanılabilmektedir, ek olarak kök hücrelerin fonksiyonel olarak bozulmuş olabilmesi hücrelerin kullanılabilecek tedavi alanlarını sınırlandırmaktadır. Yüksek BMI'ye sahip insan donörlerden elde edilen Kİ-MKH'lerin ciddi derecede bozulmuş osteojenik, azalmış adipogenik farklılaşma, azalmış proliferasyon oranları ve artan yaşlanma ile birlikte ER stresi ile ilişkili genler olan ATF4 ve CHOP'un artan ekspresyonunu sergiledikleri gösterilmiştir. Benzer şekilde obez bireylerden elde edilen yağ dokusu kaynaklı kök hücrelerin farklılaşması bozulmakta ve ömürleri kısalmaktadır. Obezite ayrıca kök hücre nişini etkileyerek ve bozarak hematopoietik kök/progenitör hücreler (HPKH'ler), iskelet kası kök hücreleri ve germ hücreleri dahil olmak üzere diğer birçok kök hücre tipinin fonksiyonlarını hem doğrudan hem de dolaylı olarak olumsuz etkiler. Örneğin, Kİ adipositlerinde obeziteye bağlı bir artış, HPKH fonksiyon bozukluğuna ve bağışıklık yetersizliğine neden olabilmektedir. Memelilerde Melatonin (N-asetil-5-metoksitriptamin, MT); günün karanlık evrelerinde başlıca epifiz bezindeki pinealositler tarafından üretilmektedir. MT sentezi; Kİ, yumurtalık, testis, bağırsak, plasenta ve karaciğer gibi birçok farklı dokuda gerçekleşmektedir. MT esas olarak sirkadiyen ritmin düzenleyicisi olmasına rağmen antioksidan savunma mekanizmalarının düzenlenmesinde, bağışıklık sisteminin modülasyonunda, kanserin önlenmesinde ve osteoproteksiyonda da önemli bir rol oynamaktadır. MT'nin sirkadiyen etkisine ana sirkadiyen genler CLOCK ve BMAL1 aracılık etmektedir. Sirkadiyen ritmin çevresel bozulması obezitenin gelişimini tetiklemekte veya hızlandırmaktadır. Memelilerde MT etkilerini dört farklı mekanizma aracılığıyla gösterir: 1) yüzey MT reseptörlerine bağlanma, 2) nükleer reseptörlere bağlanma, 3) hücre içi proteinlere bağlanma ve 4) doğrudan antioksidan etki yoluyla. Bu MT reseptörleri beyin, retina, kardiyovasküler sistem, karaciğer ve safra kesesi, pankreas, böbrek, bağışıklık sistemi hücreleri, trombositler, prostat ve meme epiteli gibi vücudun farklı bölgelerinde bulunabilmektedir. MT1 aktivasyonu, Protein Kinaz A'nın (PKA) inhibisyonuna, forskolin (FSK) ile uyarılan cAMP oluşumunun inhibisyonuna yol açmakta ve hem pAKT hem de pERK1/2'nin forsorilasyonu ve aktivasyonu sağlamaktadır. MT2 reseptörü G-proteinlerine bağlanarak hem adenilat siklaz inhibisyonuna hem de guanilil siklaz yolunun inhibisyonuna, aynı zamanda FSK ile uyarılan cAMP oluşumunun inhibisyonuna neden olmaktadır. MT2 sinyal yollarının aktivasyonuna PKC'nin aktivasyonu ve pERK1/2'nin fosforilasyonu aracılık ederken, pAKT'nin aktivasyonu aracılık etmemektedir. MT reseptörü 3/Kinon redüktaz 2 enzimi (MT3), redüktaz grubuna aittir ve kinonların elektron transfer reaksiyonlarını inhibe ederek OS'den korunmada rol oynar. MT3 reseptörü, MT'ye olan düşük afinitesi nedeniyle MT1 ve MT2 bağlanmasından daha hızlı ligand birleşme/ayrılma kinetiği sergilemektedir. MT3/QR2 detoksifikasyonda önemli bir rol oynamaktadır. MT3 reseptörün bağlanma bölgesinin membrana bağlı iken, QR2 enzimi sitozolde bulunmaktadır. MT'nin bilinen tek nükleer reseptörü, Retinoid ilişkili yetim nükleer hormon reseptörüdür (RZR/RORa) ve hem periferik sinir sisteminde hem merkezi sinir sisteminde bulunmaktadır. MT'nin ROR'un ligand bağlama domeynine bağlanmasından sonra, RZR/RORa'un reseptör DNA bağlanma domeynine, hedef genlerindeki bir ROR yanıt elemanına (RORE) bağlanarak transkripsiyonu başlatmaktadır. RZR/RORa'nun MT aktivasyonu, immün modülasyondan, hücresel büyümeden ve periferdeki kemiğin farklılaşmasından sorumludur. MT'nin nükleer reseptörüyle etkileşimi, protein kinaz C'nin (PKC) aktivasyonuyla sonuçlanır ve mononükleer hücrelerde IL-2 ve IL-6 üretimini indüklemektedir. MT'nin doğrudan etkileri, hücre içi proteinler kalmodulin, kalretikulin ve tubulin ile etkileşim yoluyla modüle edilmektedir. Kalmodulin, hücre içi ikincil haberci olarak görev yapmaktadır. MT, kalsiyumun kalmodulin'e bağlanmasını doğrudan antagonize etmekte ve MT'nin kanser gelişimi üzerindeki anti-proliferatif etkisine bu yolak aracılık edebileceği düşünülmektedir. Yüksek lipit çözünürlüğü nedeniyle MT, reseptörleriyle olan etkileşimlerinden bağımsız olarak hücre zarından serbestçe geçerek güçlü bir oksijen radikal temizleyicisi olarak görev yapabilmektedir. Memelilerde, OS altındaki hücrelerin dolaşımdaki MT'yi periferik kandan hızla temizlediği gösterilmiştir. MT daha sonra oligopeptit taşıyıcılar PEPT1 ve PEPT2 yoluyla mitokondriye girerek antioksidan olarak işlev görmekte ve lipitleri, proteinleri ve DNA'yı oksidatif hasardan korumaktadır. MT'nin mitokondriyal üretimi ayrıca oksijen radikallerinin temizlenmesine yardımcı olmaktadır. MT'nin etkilerini gösterdiği diğer mekanizmalar, metallerin bağlanması ve OH radikallerinin azaltılması, süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GPx) ve glutatyon redüktaz (GR) gibi antioksidan enzim sistemlerinin aktivasyonu yoluyladır . MT'nin kök hücreler üzerindeki etkileri kök hücre tipine göre değişmektedir. Birçok çalışma, MT'nin MKH'lerin osteojenik ve kondrojenik farklılaşmasını indüklerken, adipogenik farklılaşmayı baskıladığını göstermiştir. Bu etkilerin çoğuna Wnt/b-Katenin sinyal yolunun aktivasyonu ile başlatılmaktadır. İnflamasyon sırasında MT'nin proinflamatuar sitokinlerin üretimini baskılayarak hücresel canlılığı koruduğu gösterilmiştir. Ayrıca MT bu hücreleri apoptozdan korduğu ve hücresel stresi azaltarak canlılığı arttırabildiği gösterilmiştir. Ek olarak, MKH'lerin MT ile ön muamelesinin, böbrek iskemisinin tedavisinde kullanıldığında terapötik etkinliğini arttırdığı gösterilmiştir. Her ne kadar Kİ-MKH'lerde MT reseptörlerinin varlığı doğrudan doğrulanmamış olsa da MT antagonistlerinin kullanımı, MKH'lerde sinyallemenin MT2 reseptörlerinin aktivasyonu yoluyla gerçekleştiğini göstermektedir. Kİ nişindeki MT'nin, ROS üretiminin baskılanması ve NF-kB sinyallemesinin inhibisyonu yoluyla iltihaplanma yoluyla HKPH bakımını desteklediği de gösterilmiştir. Embriyonik kök hücreleri (EKH'ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (uPKH'ler) içeren MT çalışmaları nadir olmasına rağmen, MT'nin büyük ölçüde MT1 ile etkileşim yoluyla bu kök hücreleri de etkilediği gösterilmiştir. MT aynı zamanda MT reseptörüne bağımlı N6-metiladenosin (m6A) RNA düzenlemesi yoluyla uzun süreli kültürlenmiş EKH'lerin pluripotensitesini de arttırmıştır. MT; nöronal kök ve progenitör hücrelerde (NKPH'ler) farklılaşma, çoğalma ve hayatta kalma yollarında önemli bir rol oynamaktadır. MT kan-beyin bariyerini geçebildiğinden ve aynı zamanda hem lipitte hem de suda çözünebildiğinden, NKPH'lerin çoğalmasını ve hayatta kalmasını modüle etmek için kullanılabilmektedir. NKPH'lerde MT, etkilerini MT1 ve MT2 reseptörlerine bağlanarak, hem ERK/MAPK hem de PI3K/AKT yollarını aktive ederek göstermektedir. MT; hasarlı, işlevsiz NPKH'lerin onarımını destekleyerek NPKH'lerin hayatta kalması, çoğalması ve farklılaşmasında da önemli bir rol oynamaktadır. MT'nin farklı pluripotent ve doku kök hücreleri üzerindeki etkisinin yanı sıra, kanser kök hücrelerini (KKH'ler) doğrudan etkileyerek kanser önleyici etkilere sahip olduğu da gösterilmiştir. Bu anti-kanser etkileri birçok araştırmacı tarafından hem in vitro hem de in vivo olarak ve birçok farklı kanser türü için doğrulanmıştır. MT'nin, anti-proliferatif etkiler, onkogen ekspresyonunun düzenlenmesi, antioksidan ve anti-anjiyogenik etkiler gibi birçok mekanizma yoluyla kanseri inhibe ettiği gösterilmiştir. MT sinyali aynı zamanda KKH'lerin kendini yenileme ve hayatta kalmasıyla ilişkili anahtar yolları da düzenleyebilmektedir. Çoğu zaman kanser hücreleri oksidatif fosforilasyondan aerobik glikolize geçer; bu süreç Warburg etkisi olarak adlandırılmaktadır. Kanser hücreleri bu adaptasyon mekanizmasından yararlanarak, hücre büyümesi için gerekli olan nükleotidlerin, lipitlerin ve proteinlerin yeni üretimi için glikozu bir karbon kaynağı olarak kullanmaktadırlar. MT kullanımının kanser hücresi metabolizmasını aerobik glikolizden uzaklaştırdığı, böylece kanser hücresi büyümesini inhibe ettiği gösterilmiştir. MT ilk olarak glikoz ve lipit metabolizmasının düzenlenmesinde yer alan endojen bir hormon olarak işleviyle ve daha sonra bir antioksidan rolüyle tanınmıştır. Uykudan mahrum bırakılan hayvanların kilo alımına duyarlı olduğu gösterilmiş; bu da epifiz bezi, MT üretimi ve sağlıklı kilonun korunması arasında doğrudan bir ilişkiye işaret etmiştir. İlk olarak, hipotalamik nöronlar ve suprakiazmatik çekirdeklerde (SCN) eksprese edilen MT ve MT1 arasındaki etkileşim, norepinefrin (NE) üretimi yoluyla sempatik sinir sistemi aktivitesini arttırmakta ve eşleşmeyen protein 1 (UCP1), PPARG ve PGC1'in uyarılmasına ve gen ekspresyonunun artmasına neden olmaktadır. İkinci olarak, MT doğrudan BAT üzerinde etki ederek hücre içi cAMP'de bir azalmaya, PKA aktivitesinde azalmaya, cAMP'ye duyarlı element bağlayıcı proteinin (CREB) fosforilasyonuna ve hem MT1 hem de MT2 reseptörlerinin aktivasyonu yoluyla UCP1 ekspresyonunun yukarı regülasyonuna neden olmaktadır. Üçüncü olarak, MT'nin uygulanması, BAT mitokondrisinde MT ve metaboliti olan N1-asetil-N2-formil5-metoksiknuramin (AFMK) ile birlikte organeli OS'den korumakta ve Kahverengi adipoz doku (BAT)'ın termojenik fonksiyonunu geliştirmektedir. Zucker Diabetic Fatty (ZDF) farelerine uzun süreli MT uygulamasının, Beyaz adipoz doku (WAT)'nun bej yağ dokusuna geçişini ve UCP1 ekspresyonunun yukarı regülasyonunu teşvik ettiği, böylece termojenez ve kilo kaybına katkıda bulunabildiği gösterilmiştir. Bu nedenlerden dolayı BAT enerji kullanımını iyileştirmek için MT kullanımının obezitenin tedavisi için potansiyel bir terapötik hedef sağlayabileceği öne sürülmüştür. Obezitede yağ dokusu tarafından üretilen proinflamatuar sitokinler ROS üretmektedir. Etkili bir serbest radikal temizleyici olarak görev yapan MT'nin uygulanması, daha sonra endojen antioksidan enzimler SOD, katalaz (CAT), GPx ve GR ile iş birliği yaparak hücrelerin doğrudan ROS'u temizleyerek OS'ye karşı korumasını sağlamaktadır. MT ayrıca glutatyon metabolizmasıyla ilgili antioksidan enzimleri aktive ederek ROS'u dolaylı olarak azaltmakta ve böylece mitokondriyal hasarı inhibe etmektedir. Ayrıca MT, OS'yi azaltan geçiş metallerini şelatlayarak hidroksil radikallerinin oluşumunu azaltabilmektedir. MT'nin obeziteye bağlı OS'yi azaltmasının bir başka yolu, hücre içi bir bozunma yolu olan otofajinin düzenlenmesi (aktivasyonu) yoluyladır. IL-1a varlığında MT'nin hem ROS üretimini azalttığı hem de SOD düzeylerini artırarak serbest radikalleri ortadan kaldırdığı, böylece genel hücre sağkalımını koruduğu gözlemlenmiştir. MT'nin anti-apoptotik etkisine, hem pPERK, GRP78 ve p-eIF2a gibi ER stresiyle ilişkili proteinlerin aşağı regüle edilmesiyle ER stresinin azaltılması hem de oksidatif ve nitrosatif stres, hücreleri apoptoza karşı daha az duyarlı hale getirmektedir. MT'nin OS'yi iyileştirdiğine dair ikna edici kanıtlar hem aşırı kilolu hayvanlarda hem de insanlarda bulunmuştur. MT'nin fare Kİ-MKH'lerinde ER stresini baskılayabildiği gösterilmiştir. Bir antiinflamatuar ajan olarak MT, proinflamatuar yanıtı baskılayarak obezite dahil bazı kronik hastalıkların iyileşmesini destekleyebilmektedir. MT'nin hem klinik ortamda hem de günlük yaşamda ticari olarak temin edilebilen gıda takviyesi olarak kullanımı arttığından, insanlarda kullanımının güvenliği ilgi konusu olmuştur. Ek olarak, mevcut klinik veriler, eksojen MT uygulamasının ciddi bir yan etkisinin olmadığını göstermektedir. Kolesterol, insan karaciğerinde birincil safra asitleri olan kolik asit ve kenodeoksikolik asitten (CDCA) sentezlenmektedir. Ursodeoksikolik asit (UDCA) taurin ile konjuge edilerek tauroursodeoksikolik asite (TUDCA) dönüştürülmektedir (24). TUDCA ve UDCA, G-protein bağlı reseptör 5 (TGR5), sfingozin-1-fosfat reseptörü 2 (S1PR2) ve nükleer reseptör Farnesoid X Reseptörü (FXR) gibi membran reseptörlerinin ligandlarıdır. Ek olarak TUDCA ve UDCA, a5β1 integrini bağlayıp aktive ederek Na+/taurokolat ortak taşıyıcı peptidi (NTCP) aracılığıyla doğrudan hücre içine taşınabilmektedirler. Ek olarak, Mineralokortikoid reseptörü (MR) ve glukokortikoid reseptörü (GCR) yoluyla da hücreye girebilmektedirler. FXR, safra asidi sentezinin düzenlenmesi, safra asidi sekresyonu, bağırsakta safra asidi emilimi ve safra asitlerinin hepatik alımı gibi çeşitli süreçlerden sorumludur. TGR5 sinyali çoğunlukla ekstrahepatik bölgelerde, enerji homeostazisini düzenlediği ve insülin salgısının uyarıldığı bölgelerde işlev görmektedir. BAT ve iskelet miyositlerinde TGR5 sinyallemesi ile CREB aktivasyonu sağlamakta ve obeziteyi ve insülin direncini önlemek için immünsüpresyona, enerji ve glukoz homeostazisine aracılık etmektedir. Enflamasyon sırasında FXR aktivasyonu, aktivatör protein 1 (AP-1) ve sinyal ileticileri ve transkripsiyon 3 aktivatörleri (STAT3) ile etkileşime girerek hücresel sinyal yollarını inhibe etmektedir. Ek olarak, FXR, NF-kB gibi immün yanıtların anahtar genlerinin ekspresyonunun inhibe edilmesinde de rol oynamaktadır (25). TUDCA; GRP78 ifadesinin düşürülmesi ve PERK/JNK fosforilasyonunu azaltarak ve CHOP ifadesinde bir azalma sağlayarak ER stresi baskılamaktadır. Aynı zamanda TUDCA'nın ROS üretimi yoluyla yüksek glukoza maruz kalan beyaz adipositlerde anti-apoptotik etkiyi indükleyebildiği gösterilmiştir. TUDCA'nın tip 2 diyabetik farelerde GRP78 ve ATF4 gibi ER stres belirteçlerini azalttığını, endotel fonksiyonunda iyileşmeye ve aterosklerozda azalmaya yol açtığını göstermiştir. Obezitenin birçok farklı kök hücre türü üzerinde olumsuz etkisi olduğu gösterilmiştir. Daha önce yüksek BMI'li bireylerden izole edilen Kİ-MKH'lerin ciddi derecede bozulmuş osteojenik ve azalmış adipogenik farklılaşma, azalmış proliferasyon oranları ve ER stresiyle ilişkili genler ATF4 ve CHOP'un artan ekspresyonunu sergilediğini göstermiştik. ER stresini azaltmak için TUDCA veya 4-Fenilbütirat (4-PBA) ile tedaviye maruz bırakılan Kİ-MKH'lerin, kök hücre fonksiyonunda kısmi iyileşme gözlenmiş, bu da osteojenik ve adipogenik farklılaşmanın artmasına neden olmuştur. Ancak, BMI'nin kondrojenik farklılaşma üzerindeki etkisi, OS'nin obeziteye bağlı kök kaybı gelişimindeki rolü ve MT'nin ER stresini, OS'yi ve diğer yolları azaltarak potansiyel koruyucu rolü daha önce değerlendirilmemiştir. Bu nedenle çalışma hipotezimiz şu şekildedir: "Kİ-MKH'lerde görülen ve artan BMI'e bağlı olarak gelişebilen köklülük kaybı MT ve TUDCA uygulamaları ile düzeltilebilir". Bu hipotezi test etmek için bu yüksek lisans tezi kapsamında: 1) Sağlıklı donörlere (BMI 20-25), obez donörlere (BMI 25-30) ve morbid obez donörlere (BMI>30) sahip donörlerden elde edilen Kİ-MKH'lerde ER stresi, OS ve yaşlanmayı değerlendirmesi; 2) Kİ-MKH'lerin çoğalma ve farklılaşma potansiyelini BMI ile ilişkili olarak değerlendirmesi; 3) TUDCA ile veya TUDCA olmadan MT tedavisinin ER stresini, OS'yi modüle edip edemeyeceğini ve obez donörden türetilen Kİ-MKH 'lerin hücresel fonksiyonlarını iyileştirip iyileştiremeyeceği araştırılması planlanmıştır. Kİ-MKH'ler yetişkin sağlıklı (vücut kitle indeksi/BMI 20-25), obez (BMI 25-30) ve aşırı obez (BMI>30) donörlerden elde edilmiş ve karakterizasyon için 3. pasaja (P3) ve devam deneyleri için 6. pasaja kadar kültürlenmiştir. Yapılan deney sonuçlarında elde edilen verilere göre sağlıklı, obez ve morbid obez donör Kİ-MKH'ler morfolojik olarak birbirlerine benzerdir. Sağlıklı, obez ve morbid obez donörlerden alınan Kİ-MKH/P3, CD29, CD45, CD73, CD105, CD90 ve HLA-DR'ye karşı antikorlarla boyanmıştır. Tüm donörlerden alınan hücreler, CD29 (>%93), CD73 (>%93), CD90 (>97) ve CD105 (>%85) CD45 (<%3) ve HLA-DR (<%5) ekspresyonlarına ve düşük ekspresyonlarına dayanarak Kİ-MKH'ler olarak sınıflandırılabilir. Bu çalışmada her grupta karma cinsiyet popülasyonları kullanılmıştır. Ayrıca yaşın etkisini de değerlendirmek amaçlandığı için BMI ile yaş arasındaki korelasyon (Pearson korelasyonu: r=0,35) hesaplanmıştır. Çalışma grubunda yaş arttıkça BMI'da istikrarlı bir artış saptansa da yaş ile BMI arasında anlamlı bir korelasyon (p>0,05) bulunmamıştır. Bu nedenle, bu tez kapsamında sağlıklı, obez ve morbid obez Kİ-MKH donörlerinin ileri analizlerinde yaş, bir değişken olarak göz ardı edilmiştir. Sağlıklı (n=3), obez (n=3) ve morbid obez (n=3) hastalardan alınan Kİ-MKH'ler/P6, OS gen ekspresyonun değerlendirilmesi için SOD1 ve TXNRD1 gen ekspresyonuna; ER stresin/ UPR aktivasyonunun değerlendirilmesi için sXBP1, XBP1, ATF4 ve CHOP gen ekspresyonlarına bakılmıştır. Önceki çalışmalarda, ACTB ekspresyonunun Kİ-MKH'lerde osteojenik ve adipogenik soya doğru farklılaşma sırasında kararsız olduğu bulunduğu için Kİ-MKH farklılaştırmalarındaki kullanımı uygun değildir. Bu nedenle burada 3 farklı " house-keeping " genleri; ACTB, RPLP0 ve GAPDH, farklı Kİ-MKH donörlerinde ekspresyonun stabilitesi açısından test edilmiştir. Farklı donörlerin CT değerlerine göre en az değişkenlik RPLP0 ifadesinde gözlenmiş ve bu nedenle bu tez boyunca bu ''house-keeping'' gen olarak kullanılmıştır. Sağlıklı, obez ve morbid obez donörlerden elde edilen Kİ-MKH'ler adipojenik, osteojenik ve kondrojenik soylara göre farklılaştırılmıştır. Sonuçlar hem histolojik boyama hem de RT-PCR kullanılarak değerlendirilmiştir. 3 haftalık farklılaşmanın ardından değerlendirilen Kİ-MKH'lerin adipojenik ve osteojenik soylara yönelik farklılaşma kapasitesi artan BMI ile azalırken, ancak bu veriler grupların küçük olduğundan istatistiksel olarak anlam kazanamamıştır. Farklılaşma analizlerinin başlatılmasından bir hafta sonra değerlendirilen erken adipojenik ve osteojenik farklılaşma ile ilişkili genlerin ekspresyonu, sağlıklı donör Kİ-MKH'leri tarafından obez ve morbid-obez donörden elde edilenlere kıyasla adipojenik (SCD) ve osteojenik (ALPL) yönünde daha iyi farklılaşmayı ortaya çıkarmıştır. Kondrojenik farklılaşma, yalnızca farklılaşmadan 3 hafta sonra değerlendirilmiştir ve adipojenik ve osteojenik farklılaşmanın aksine, kondrojenik farklılaşma ile ilişkili COL2 artan BMI ile ekspresyonu artmıştır. Obez ve morbid obez donörlerde ER stresi ve OS ile ilişkili gen ekspresyonu, sağlıklı donörden türetilen Kİ-MKH'lerdeki seviyelerle karşılaştırılmıştır. Sağlıklı, obez ve morbid obez donör Kİ-MKH'lerde temel hücresel stres seviyeleri değerlendirildiğinde, morbid obez grupta yalnızca ATF4 seviyelerinin anlamlı ölçüde arttığı bulunmuştur. Adipojenik, osteojenik ve kondrojenik soylara doğru farklılaşma sonrasında hücresel stres belirlendiğinde hem ER stresi hem de OS belirteçleri genel olarak düşük kalmıştır, ancak osteojenik farklılaşma sırasında obez ve morbid obez donörlerde sXBP1 ekspresyonundaki artış dikkat çekicidir. Sağlıklı, obez ve morbid obez donör Kİ-MKH'lerde ROS seviyeleri ölçülmüştür. ROS yüzdeleri (H2DCFDA pozitif hücreler) BMI ile birlikte artmasına rağmen bu veriler anlamlı bulunmamıştır (r=0,45, p>0,05). Kültürlerdeki yaşlanan hücrelerin yüzdeleri ile BMI arasındaki doğrudan korelasyon da anlamlı bulunmamıştır (r=0.78, p>0.05). Bununla birlikte, veriler grup başına katmanlara ayrıldığında yaşlanan hücrelerdeki artışlar oldukça anlamlı bulunmuştur (sağlıklı vs obez, p<0,01; sağlıklı vs morbid obez, p<0,001). MT'nin hücresel büyüme ve canlılık üzerindeki potansiyel olumsuz etkilerini değerlendirmek için sağlıklı donör Kİ-MKH'ler kullanılmıştır. MT'nin sağlıkı Kİ-MKH'lerin proliferasyonu desteklediğini ve önemli bir toksisite göstermediği bulunmuştur. Bu verilere ve literatürde standart olarak kullanılan MT doz aralıklarına dayanarak, diğer tüm deneyler 30 nM MT dozuyla gerçekleştirilmiştir. MT, TUDCA ve 4-PBA kullanımının potansiyel sinerjistik etkilerini değerlendirmek için bu kimyasallar, hücre çoğalmasına ilişkin WST-1 analizi kullanılarak sağlıklı donör Kİ-MKH'ler üzerinde test edilmiş ve hücre büyüme analizleri 4. gün, 7. gün ve 11. günde ve 14. günde yapılmıştır. Grubumuzun önceki verilerine göre MT 30 nM, TUDCA 50 uM ve 4-PBA 1 mM konsantrasyonda kullanılmıştır. MT ve TUDCA'nın tek kullanımı en iyi çoğalma destekleme kapasitelerini gösterirken, 4-PBA tek başına veya kombinasyon halinde hiçbir zaman standart kullanılan mediyum DMF10'unu geçememiştir. Bu nedenle sonraki deneylerde 4-PBA kullanımı dahil edilmemiştir. MT'nin akış aşağı sinyal aktivasyon yolları değerlendirilmiştir. MT1'in aktivasyonunun hem AKT hem de ERK'nin aşağı yönde fosforilasyonuyla sonuçlandığı, oysa MT2'ye bağlanmanın yalnızca ERK'nin fosforilasyonuyla sonuçlandığı gösterilmiştir. MT ve/veya TUDCA'nın obez ve morbid obez donörden türetilen Kİ-MKH'lerin farklılaşması üzerindeki etkisi gözlemlenmiştir. İşlevsel olarak bozulmuş Kİ-MKH/P6'nın obez ve morbid obez donörlerden farklılaşma kapasitesini geliştirmek için hücreler, MT ve/veya TUDCA varlığında adipogenik, osteojenik ve kondrojenik soylara farklılaştırılmıştır. Her ne kadar TUDCA'nın eklenmesi adipogenik, osteojenik ve kondrojenik yöne doğru farklılaşmasını desteklerken bu etki sadece obezlerde gözlenirken morbid obezler de gözlenememiştir. Bu da hücrelerin stres seviyelerinin çok yüksek olduğu takdirde artık ne TUDCA ne de MT etkilerine duyarlı olamayacağı göstermektedir. MT'nin eklenmesi, obez donörden türetilmiş Kİ-MKH'lerde yalnızca kondrojenik SOX9 ifadesini geliştirmiştir. TUDCA'nın MT ile hiçbir sinerjistik etkisi gözlenmemiştir. Ayrıca TUDCA ve MT ile kombine tedavi, üç soyun tamamında genel olarak bastırılmış farklılaşma kapasitesiyle sonuçlanmıştır. Obez ve morbid obez donörden türetilmiş Kİ-MKH'lerde MT ve/veya TUDCA'nın hücresel stres düzeyleri üzerindeki etkisine de bakılmıştır. Öncelikle sağlıklı, obez ve morbid obez bir donörden farklılaştırılması sırasında ilk olarak OS ve ER stresinin hücresel stres belirteçlerinin gen ekspresyonu değerlendirilmiştir. Obez ve morbid obez donör Kİ-MKH'leirndeki sXBP1 ekspresyonunda bir artış gözlenmiş; bu da IRE1a yolunun ve daha az ölçüde PERK yolunun aktivasyonunu göstermiştir. Bu noktada da OS, Kİ-MKH'lerin obez ve morbid obez donörlerden kaynaklanan fonksiyon kaybında önemli bir rol oynamadığı gözlemlenmiştir. Daha sonra, Kİ-MKH'leri obez ve morbid obez donörlerden ayırmada hücresel stres belirteçlerini baskılayan ve bu hücrelerin farklılaşma kapasitesini artıran MT (OS üzerinde etkili olan) ve TUDCA'nın (ER stresini baskılayan) etkileri değerlendirilmiştir. Ne TUDCA ne de MT, obez ve morbid obez donörden türetilen Kİ-MKH'lerin farklılaşma potansiyelini tamamen kurtarmak için yeterli olmamış, ancak özellikle MT tedavisinden sonra osteojenik farklılaşma üzerinde etkileri gözlemlenmiştir. Sonuç olarak tüm donörlerden elde edilen Kİ-MKH'ler morfolojik ve fenotipik olarak benzerdir. Obez ve morbid obez donörden türetilen Kİ-MKH'ler, artan ER stresi ve orta derecede OS belirtileri gösterir, bu da yaşlanmanın hızlanmasına, çoğalmanın azalmasına, ROS seviyelerinin artmasına ve farklılaşma kapasitesinin azalmasına neden olur. TUDCA, obeziteye bağlı kök hücre fonksiyonu kaybının etkilerini kısmen tersine çevirmiştir. MT, sağlıklı Kİ-MKH'lerin çoğalmasını uyarmış, ancak köklülük kaybını telafi edememiştir. Ne TUDCA ne de MT tek başına veya kombinasyon halinde, obez donörden türetilen Kİ-MKH'lerin farklılaşma potansiyelini tamamen kurtarmak için yeterli değildir. Sonuç olarak, obeziteye bağlı kök hücre fonksiyonu kaybı, TUDCA ile kısmen tedavi edilebilecek olan artan ER stresine ve orta düzeyde OS'ye katkıda bulunabilir. | tr_TR |
