| dc.contributor.advisor | Öner, Ayşe Filiz | |
| dc.contributor.author | Kaya Özsan, Ayşe Göksu | |
| dc.date.accessioned | 2017-05-30T05:19:13Z | |
| dc.date.available | 2017-05-30T05:19:13Z | |
| dc.date.issued | 2017 | |
| dc.date.submitted | 2017-04-26 | |
| dc.identifier.citation | Kaya Özsan, AG. Rekombinant Granülosit Koloni Uyarıcı Faktörün Biyopolimerlerle Enzimatik Konjugasyonu ve Proteinin Özellikleri Üzerindeki Etkilerinin Araştırılması Üzerinde Çalışmalar, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Farmasötik Biyoteknoloji Programı Doktora Tezi, Ankara, 2017. | tr_TR |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11655/3399 | |
| dc.description.abstract | Second generation protein products are studied and products are developed in recent years. Aim of this thesis is to add a new alternative to second generation drug development approaches with filgrastim. For this purpose, enzymatic conjugation of filgrastim with transglutaminase is designed by using a polymer which is not used for this aim before. Conjugation studies are conducted with hydrolysates of chitosan, which is a natural polymer in the polysaccharide structure. Conjugate formation is shown by SEC-HPLC, RP-HPLC, Fourier transform infrared spectroscopy, mass spectroscopy, SDS-PAGE gel electrophoresis, isoelectric focusing and western blot analysis. In addition, HPLC, FTIR and mass spectral analysis showed that conjugate is formed of three similar molecular weight subfraction. After the conjugate formation, effects of parameters such as temperature, reaction period, pH and different ratios of components on the formation and stability of conjugates are studied. Polymer ratio is found to be the main factor on conjugate formation. Solution and lyophilized forms of conjugate is found stable at 5±3oC for four months. Bioactivity of the conjugate solution is studied on cell cultures complying with the European Pharmacopeia by using NFS-60 cells and conjugate is seen more active than reference filgrastim. | en |
| dc.description.sponsorship | TÜBİTAK (SBAG 114S759 nolu 1001 projesi) | tr_TR |
| dc.description.tableofcontents | ONAY SAYFASI iii
YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv
ETİK BEYAN v
TEŞEKKÜR vi
ÖZET vii
ABSTRACT viii
İÇİNDEKİLER ix
SİMGELER VE KISALTMALAR xiii
ŞEKİLLER xvi
TABLOLAR xx
1. GİRİŞ 1
2. GENEL BİLGİLER 4
2.1. Rekombinant DNA Teknolojisi ile Üretilen Proteinler 4
2.1.1. Rekombinant Büyüme Faktörleri 5
2.2. İkinci Kuşak Protein İlaçlar 10
2.3. Protein-Polimer Konjugatları 11
2.3.1. Kimyasal Konjugasyon 12
2.3.2. Enzimatik Konjugasyon 13
2.4. Polimerler 15
2.4.1. Polietilen Glikol (PEG) 15
2.4.2. Kitosan 16
2.5. Enzimler 20
2.5.1. Transglutaminaz 20
2.6. Protein Analizinde Kullanılan Yöntemler 22
2.6.1. Kromatografik Yöntemler 23
2.6.2. Spektroskopik Yöntemler 26
2.6.3. Elektroforetik Yöntemler 28
2.6.4. Diğer Yöntemler 29
2.7. Filgrastimin Biyotayini 30
3. GEREÇ VE YÖNTEM 31
3.1. Kullanılan Maddeler ve Cihazlar 31
3.2. Filgrastimin Fizikokimyasal Özellikleri 34
3.2.1. Filgrastim Çözeltisinin Hazırlanması 34
3.2.2. Filgrastimin UV Spektroskopik Analizi 34
3.2.3. Filgrastimin HPLC ile Analizi 34
3.3. Kitosanın Fizikokimyasal Özellikleri 40
3.3.1. Kitosan Çözeltisinin Hazırlanması 40
3.3.2. Kitosan Hidrolizatlarının Elde Edilmesi 41
3.3.2. Düşük Molekül Ağrılıklı Kitosan ve Kitosan Hidrolizatlarının UV Spektrumu 41
3.4. Transglutaminazın Fizikokimyasal Özellikleri 41
3.4.1. Transglutaminaz Çözeltisinin Hazırlanması 41
3.5. Enzimatik Yöntemle Konjugatların Oluşturulması 42
3.6. Konjugat Oluşumunun Tayini 43
3.6.1. HPLC ile Tayinler 43
3.6.2. Elektroforetik Yöntemlerle Yapılan Analizler 44
3.6.3. Preparatif Amaçlı Kromatografi Çalışmaları 50
3.6.4. Spektroskopik Tayinler 51
3.6.5. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) 51
3.6.6. Konjugattan Ayrılan Filgrastimin Tayini 52
3.6.7. Hücre Kültürlerinde Filgrastimin ve Konjugatının Biyoetkinliğinin Tayini 53
3.6.8. Proteinin Konjugattaki Kararlılığı 56
4. BULGULAR 57
4.1. Filgrastimin Fizikokimyasal Özelliklerinin Tayini 57
4.1.1. Filgrastimin UV Spektroskopik Analizi 57
4.1.2. Filgrastimin Ters-Faz HPLC ile Miktar Tayini ve Yöntemin Validasyonu 59
4.1.3. Filgrastimin Büyüklük Dışlama HPLC (SE-HPLC) Kromatografisi ile Tayini-1 64
4.1.4. Filgrastimin Büyüklük Dışlama HPLC (SE-HPLC) Kromatografisi ile Tayini-2 64
4.2. Kitosanın Fizikokimyasal Özellikleri 65
4.2.1. Düşük Molekül Ağırlıklı Kitosan ve Hidrolizatlarının UV Spektrumu 65
4.3. Konjugat Oluşumunun Tayini 66
4.3.1. HPLC ile Tayinler 66
4.3.2. Elektroforetik Yöntemlerle Yapılan Analizler 75
4.3.3. Preparatif Amaçlı Kromatografi Çalışmaları 87
4.3.4. Spektroskopik Tayinler 89
4.3.5. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) 93
4.3.6. Konjugattan Ayrılan Filgrastimin Tayini 94
4.3.7. Hücre kültürlerinde Filgrastimin ve Konjugatının Biyoetkinliğinin Tayini 95
4.3.8. Proteinin Konjugattaki Kararlılığı 97
5. TARTIŞMA 99
5.1. Filgrastimin Fizikokimyasal Özelliklerinin Tayini 99
5.1.1. Filgrastimin UV Spektroskopik Analizi 99
5.1.2. Filgrastimin Ters-Faz HPLC ile Miktar Tayini ve Yöntemin Validasyonu 99
5.1.3. Filgrastimin Büyüklük Dışlama HPLC (SE-HPLC) Kromatografisi ile Tayini-1 100
5.1.4. Filgrastimin Büyüklük Dışlama HPLC (SE-HPLC) Kromatografisi ile Tayini-2 101
5.2. Kitosanın Fizikokimyasal Özellikleri 101
5.2.1. Düşük Molekül Ağırlıklı Kitosan ve Hidrolizatının UV Spektrumunun Belirlenmesi 101
5.3. Konjugat Oluşumunun Tayini 102
5.3.1. HPLC ile Tayinler 102
5.3.2. Elektroforetik Yöntemlerle Yapılan Analizler 105
5.3.3. Preparatif Amaçlı Kromatografi Çalışmaları 109
5.3.4. Spektroskopik Tayinler 110
5.3.5. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) 111
5.3.6. Konjugattan Ayrılan Filgrastimin Tayini 111
5.3.7. Hücre Kültürlerinde Filgrastimin ve Konjugatının Biyoetkinliğinin Tayini 112
5.3.8. Proteinin Konjugattaki Kararlılığı 113
6. SONUÇ VE ÖNERİLER 114
7. KAYNAKLAR 116
8. EKLER
EK-1: Tez Çalışması ile İlgili Poster
EK-2: Tez Çalışması ile İlgili Yayın
9. ÖZGEÇMİŞ | tr_TR |
| dc.language.iso | tur | tr_TR |
| dc.publisher | Sağlık Bilimleri Enstitüsü | tr_TR |
| dc.rights | info:eu-repo/semantics/openAccess | tr_TR |
| dc.subject | proteinler | tr_TR |
| dc.subject | filgrastim | tr_TR |
| dc.subject | rh G-CSF | tr_TR |
| dc.subject | farmasötik biyoteknoloji | tr_TR |
| dc.subject | transglutaminazlar | tr_TR |
| dc.subject | kitosan hidrolizatları | tr_TR |
| dc.subject | protein konjugatları | tr_TR |
| dc.title | Rekombinant Granülosit Koloni Uyarıcı Faktörün Biyopolimerlerle Enzimatik Konjugasyonu ve Proteinin Özellikleri Üzerindeki Etkilerinin Araştırılması Üzerinde Çalışmalar | tr_TR |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis | en |
| dc.description.ozet | Son yıllarda ikinci kuşak protein ilaçlar üzerinde araştırmalar yapılmakta ve ürünler geliştirilmektedir. Bu tez çalışmasında proteinlerle ikinci kuşak ilaç geliştirme yaklaşımlarına bir yenisini eklemek amaçlanmıştır. Bu amaçla filgrastimin mikrobiyal transglutaminaz aracılığı ile daha önce bu yaklaşımla üzerinde çalışma yapılmamış bir polimer ile konjugatının hazırlanması planlanmıştır. Konjugasyon çalışmaları polisakkarit yapıda doğal bir polimer olan kitosanın hidrolizatları ile yapılmıştır. SEC-HPLC, RP-HPLC, Fourier transform infrared spektroskopisi, kütle spektroskopisi, SDS-PAGE jel elektroforezi, izoelektrik odaklama ve western blot ile yapılan analizlerle konjugat oluşumu gösterilmiştir. Ayrıca HPLC, FTIR ve kütle spektroskopisi analizlerinde konjugatın birbirine yakın büyüklükte üç farklı moleküler yapıdan oluştuğu belirlenmiştir. Konjugat oluşumu başarıldıktan sonra sıcaklık, bekletme süresi, pH, bileşenlerin farklı oranları gibi etkenlerin konjugat oluşumu ve dayanıklılığı üzerindeki etkileri incelenmiş ve konjugat oluşumunda polimerin oranının etkili olduğu görülmüştür. Konjugatın çözeltisinin ve liyofilize formunun kararlılığının dört ay 5±3o C derecelik bekletme koşulunda değişmediği görülmüştür. Konjugat çözeltisinin biyoetkinliği hücre kültürü çalışmaları ile Avrupa Farmakopesi’ne uygun şekilde NFS-60 hücreleri kullanılarak araştırılmış ve referans filgrastime göre oluşan konjugatın daha etkili olduğu görülmüştür. | tr_TR |
| dc.contributor.department | Diğer | tr_TR |
