DARUNAVİR BASKILANMIŞ PHEMA TEMELLİ MİKROKRİYOJELLERİN HAZIRLANMASI VE SALIM KİNETİĞİNİN İNCELENMESİ PREPARATION OF DARUNAVIR IMPRINTED PHEMA BASED MICROCRYOGELS AND INVESTIGATION OF RELEASE KINETICS İSMET ŞAFAK Pof. Dr. ADİL DENİZLİ Tez Danışmanı Hacettepe Üniversitesi Lisansüstü Eğitim-Öğretim ve Sınav Yönetmeliğinin Kimya Anabilim Dalı için Öngördüğü YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak hazırlanmıştır. 2022 i ÖZET DARUNAVİR BASKILANMIŞ PHEMA TEMELLİ MİKROKRİYOJELLERİN HAZIRLANMASI VE SALIM KİNETİĞİNİN İNCELENMESİ İsmet ŞAFAK Yüksek lisans, Kimya Bölümü Tez Danışmanı: Prof. Dr. Adil DENİZLİ Şubat 2022, 58 sayfa Darunavir (D.V), insan immün yetmezlik virüsü (HIV) ile enfeksiyonların tedavisinde kullanılan güçlü bir Antiretroviral ilaçtır. Edinilmiş immün yetmezlik sendromu (AIDS), HIV enfeksiyonunun en ileri aşamasıdır. D.V sentetik bir peptid olmayan proteaz inhibitörüdür. İlk olarak Haziran 2006'da, HIV'in dirençli tip-1 tedavisi için kullanılması FDA tarafından onaylanmıştır. Kontrollü ilaç salım sistemleri, hastalıkların tedavisi sürecinde hedef dokuya ilaçları istenilen dozda, doğru zaman ve yerde kullanılarak etkin bir tedavi yöntemi sunmaktadır. Biyomalzeme olarak polimerik sistemler, doğal/sentetik olarak elde edilebilen kontrollü salım sistemlerinde kullanılır. Bu malzemelerin kullanımı günümüzde artmaktadır. Polimerik sistemlerden en yaygın olarak kullanılan polimerler hidrojellerin türevi olan mikrokriyojellerdir. Mikrokriyojeller çözücünün donma sıcaklığı altında sentezlenen jel matrikslerdir. Mikrokriyojellerin süpermakrogözenekli, elastik ve süngerimsi morfolojiye sahip olmasından dolayı son zamanlarda ilaç salımı gibi biyomedikal uygulamalarda kullanılmaktadır. Tez çalışmasında, ilk önce D.V baskılanmış poli (2-hidroksietil metakrilat) (PHEMA) temelli mikrokriyojeller sentezlenmesi planlanarak darunavir’in kontrollü salımı ve salım kinetiğinin incelenmesi yapılmıştır. Antiretroviral ilaç olan darunavir’in, ii karakterizasyon çalışmaları ve in vitro salım deney çalışmalarını incelemek amacıyla, farklı çapraz bağlayıcı oranlarına ve farklı ilaç yükleme miktarlarına sahip darunavir baskılanmış PHEMA mikrokriyojeller hazırlanmıştır. İlk aşamada, MAH monomeri Cu (II) metal iyonları ile üç farklı molar oranda kompleks oluşturulmuştur. Daha sonra darunavir baskılanmış mikrokriyojeller -14oC sıcaklıkta elde edilmiştir. İkinci aşamada, mikrokriyojellerin yapı ve yüzey morfoloji karakterizasyonu Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FTIR-ATR), taramalı elektron mikroskobu (SEM), şişme deneyleri ve yüzey alanı ölçümleri ile yapılmıştır. SEM sonuçlarına göre mikrokriyojellerin, makrogözenek boyutlarının 20 µm’den büyük olduğu ve homojen bir şekilde dağıldığı gözlenmiştir. Farklı ilaç yükleme oranlarına sahip mikrokriyojellerin yüzey alanı ve şişme davranışlarının, darunavir yükleme miktarının artması ile hem şişme oranının hem de yüzey alanının önemli miktarlarda arttığı görülmüştür. Üçüncü aşamada, farklı oranlardaki Cu (II) iyonunun, ilaç yükleme miktarının, çapraz bağlayıcının ve ortam pH’nın D.V salım hızına etkisi in vitro salım deney çalışmaları ile incelenmiştir. Farklı darunavir miktarı (0.5-1.75 mg/mL) yüklenerek farklı D.V baskılanmış mikrokriyojeller hazırlanmıştır. D.V baskılanmış mikrokriyojellerin ilaç miktarının artmasıyla D.V salım oranı arttığı gözlenmiştir. Molar olarak üç farklı oranda MBAAm (nHEMA/nMBAAm = 4, 6, 8) içeren üç farklı mikrokriyojel hazırlanmıştır. D.V'nin kontrollü salımı MBAAm miktarının (çapraz bağlayıcı yoğunluğunun) artması ile azalmıştır. Ayrıca, farklı ortam pH’larında (6.0, 7.0, 7.4 ve 8.0) D.V baskılanmış mikrokriyojellerden darunavir salımı incelenmiştir. Sonuçlara göre en fazla ve kontrolü olarak ilaç salımı pH 7.4’de gerçekleşmiştir. Son olarak tez çalışmasında kullanılan mikrokriyojellerin sitotoksisite çalışmaları fibroblast hücre hattı (L929) kullanılarak yapılmıştır. Anahtar Kelimeler: Darunavir, Antiretroviral İlaç, HIV, PHEMA Temelli Mikrokriyojel, Kontrollü İlaç Salım Sistemleri iii ABSTRACT PREPARATION OF DARUNAVIR IMPRINTED PHEMA BASED MICROCRYOGELS AND INVESTIGATION OF RELEASE KINETICS İsmet ŞAFAK Master of Science, Department of Chemistry Supervisor: Prof. Dr. Adil DENİZLİ February 2022, 58 pages Darunavir (D.V) is a powerful Antiretroviral drug used to treat infections with the human immunodeficiency virus (HIV). Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) is the most advanced stage of HIV infection. D.V is a synthetic non-peptide protease inhibitor that was first approved by the FDA for resistant type-1 treatment of HIV, in June 2006. Controlled drug release systems offer an effective treatment method by using drugs to the target tissue at the specific dose, at the right time, and place during the treatment of diseases. Polymeric systems as biomaterials are used in controlled release systems that can be obtained naturally/synthetically. The use of these materials is increasing nowadays. One of these biomaterials is microcryogels, which are derivatives of hydrogels, and gel matrices synthesized under the freezing temperature of the solvent. Since microcryogels have supermacroporosity, elastic and spongy morphology, they have recently been used in biomedical applications such as drug release. In this thesis study, the controlled release and kinetic studies of darunavir were investigated with the D.V imprinted poly (2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) iv based microcryogels. Darunavir imprinted PHEMA microcryogels with different crosslinker ratios and different loaded drug were prepared for in vitro release studies of darunavir. In the first step, the MAH monomer was complexed with Cu (II) metal ions at three different molar ratios. Then, darunavir imprinted microcryogels were prepared at -14oC. In the second stage, the structure and surface morphology of microcryogels were characterized with FTIR-ATR, scanning electron microscopy (SEM), swelling experiments and surface area measurements. According to the SEM results, it was observed that the microcryogels were homogeneously distributed with macroporous sizes greater than 20 µm. Also, the surface area and % swelling of microcryogels were increased by increasing the amount of loaded darunavir. In the third stage, the effect of different Cu (II) ion, drug loaded amount, crosslinker and pH on in vitro D.V release rate was investigated. Different D.V imprinted microcryogels were prepared by loading different amounts of darunavir (0.5-1.75 mg/mL). It was demosntarted that D.V release rate was increased by increasing the amount of D.V. Also, darunavir imprinted microcryogels were prepared in three different mole ratios of MBAAm (nHEMA/nMBAAm = 4, 6, 8), as crosslinker. The controlled release of D.V. was decreased by increasing the crosslinker density. The release of darunavir from drug imprinted microcryogels at different pH (6.0, 7.0, 7.4, and 8.0) was studied. According to the results, the most and controlled drug release was occured at pH 7.4. Finally, cytotoxicity studies of the microcryogels were performed using the fibroblast cell line (L929) in the thesis study. Keywords: Darunavir, Antiretroviral Drug, HIV, PHEMA-Based Microcryogels, Controlled Drug Delivery Systems. v TEŞEKKÜR Tez çalışmalarımın yürütülmesi ve sonuçlandırılması için akademik ve bilimsel çalışmalarımda ve hayatta engin bilgi ve tecrübeleriyle desteğini hiçbir zaman esirgemeyen, disiplinli çalışması ve yol göstericiliğiyle her zaman örnek alacağım kıymetli bilim insanı, tez danışmanım, çok değerli hocam Prof. Dr. Adil Denizli’ye, Bilimsel katkısı ve desteği ile yanımda olan, sevgili hocam Doç. Dr. Nilay BERELİ’ye, Lisansüstü eğitimimin ilk gününden beri bana hocadan hep daha fazlası olan, tez çalışmam boyunca üzerimde desteğini hiç eksik etmeyen, deneysel çalışmalarımda bana yardımını esirgemeyen, bilgisi ve gösterdiği güven sayesinde bana her zaman yol gösteren çok sevdiğim Dr. Monireh BAKHSHPOUR’a, Yüksek lisans ve tez süreçlerim ile ilgili planlamalarımda, desteğiyle hep yanımda olan, çok sevgili BIOREG ailesi hocalarım Prof. Dr. Handan Yavuz, Doç. Dr. Deniz Türkmen, Doç. Dr. Fatma Yılmaz, Dr. Semra Akgönüllü ve diğer hocalarıma, Hayatımın her aşamasında olduğu gibi bu süreçte de her anlamda beni destekleyen, sevgi ve sabırla yanımda olan annem ve babam Havva- Ömer ŞAFAK’a, özellikle en başından başlayarak yaptığım işlerde, ilerlediğim yolda bana her zaman inanan ve güvenen; bir kez olsun beni yalnız bırakmayan, desteklerini ve sevgisini sonsuz kez hissettiğim çok sevdiğim ablam Çağla ŞAFAK’a, Her başım sıkıştığında yanlarına koştuğum; her zaman vermiş oldukları destek ve yardımların yanında katmış oldukları bilgi ve fikirler ile yanımda olan arkadaşım Gülşen BAYRAK başta olmak üzere sevgisini hissettiğim tüm arkadaşlarıma sonsuz teşekkür ediyorum. vi İÇİNDEKİLER ÖZET ................................................................................................................................................ i ABSTRACT ................................................................................................................................... iii TEŞEKKÜR .................................................................................................................................... v İÇİNDEKİLER ............................................................................................................................... vi ŞEKİLLER DİZİNİ ...................................................................................................................... viii ÇİZELGELER DİZİNİ .................................................................................................................. ix SİMGELER VE KISALTMALAR ................................................................................................. x 1. GİRİŞ ................................................................................................................................... 1 2. GENEL BİLGİLER .................................................................................................................... 3 2.1. Kontrollü İlaç Salım Sistemleri ............................................................................................ 3 2.1.1. Salım Mekanizmasına Göre Kontrollü Salım Sistemleri .............................................. 5 2.2. Antiretroviral İlaç ................................................................................................................ 9 2.2.1. Antiretroviral Bileşikleri ............................................................................................. 10 2.2.2. Darunavir ..................................................................................................................... 18 2.3. Moleküler Baskılama......................................................................................................... 19 2.3.1. Moleküler Baskılama Yönteminde Kullanılan Temel Bileşenler ............................ 21 2.3.2. Moleküler Baskılama Yöntemleri ............................................................................ 23 2.3.3. Moleküler Baskılanmış Polimerlerin Kullanım Alanları ......................................... 27 2.4. Kriyojeller .......................................................................................................................... 27 2.4.1. Kriyojellerin Sentezlenmesi ........................................................................................ 29 3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR ........................................................................................... 33 3.1. Kimyasal Malzemeler ........................................................................................................ 33 3.2. Moleküler Baskılama için Kullanılan Ön-kompleksin Hazırlanması ................................ 33 3.3. MIP-Mikrokriyojellerin Hazırlanması ............................................................................... 33 3.4. Mikrokriyojellerin Karakterizasyon ................................................................................... 35 3.4.1. FTIR-ATR ................................................................................................................... 35 vii 3.4.2. Yüzey Morfolojisi ........................................................................................................36 3.4.3. Şişme Deneyleri ...........................................................................................................36 3.4.4. Yüzey Alanı Ölçümleri ................................................................................................36 3.5. Mikrokriyojellerden Darunavir Salımının İncelenmesi ......................................................36 3.6. Sitotoksisite Çalışmaları .....................................................................................................37 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA ..........................................................................................38 4.1. MAH-Cu (II) Ön-Kompleksin Hazırlanması ......................................................................38 4.2. Mikrokriyojellerin Karakterizasyonu .................................................................................38 4.3. MIP Mikrokriyojellerden D.V Salım Davranışının İncelenmesi ........................................42 4.3.1. Farklı Oranlardaki Cu(II) İyonunun Salım Hızına Etkisinin İncelenmesi ...................42 4.3.2. İlaç Yükleme Miktarının İlaç Salım Oranı ve Hızına Etkisinin incelenmesi ..............43 4.3.3. Farklı Oranlarda Çapraz Bağlayıcının Darunavir Salım Hızına Etkisinin İncelenmesi ...............................................................................................................44 4.3.4. Ortam pH’nın D.V Salım Hızına Etkisi .......................................................................45 4.4. Kinetik İncelemesi ..............................................................................................................46 4.5. Sitotoksisite Çalışmaları .....................................................................................................47 5. YORUM .............................................................................................................................50 6. KAYNAKLAR ..................................................................................................................53 ÖZGEÇMİŞ ................................................................................... Error! Bookmark not defined. viii ŞEKİLLER DİZİNİ ŞEKİL 2. 1. PLAZMADAKİ İLAÇ DERİŞİMİNİN ZAMANLA DEĞİŞİMİ VE GELENEKSEL ALIŞILMIŞ DOZAJ ŞEKİLLERİ İLE KONTROLLÜ SALIM YÖNTEMİNİN KARŞILAŞTIRILMASI .................................................................................................................... 4 ŞEKİL 2. 2. REZERVUAR (ZARLI) SİSTEM ........................................................................................... 6 ŞEKİL 2. 3. MATRİKS (MONOLİTİK) SİSTEM ...................................................................................... 7 ŞEKİL 2. 4. HİDROJEL TABLETİN CAMSI VE ELASTİĞİMSİ HALLERİ ......................................... 7 ŞEKİL 2. 5. BİYOBOZUNUR SİSTEMDEN İLAÇ SALIMI .................................................................... 8 ŞEKİL 2. 6. ZİNCİRE TAKILI SİSTEMDEN İLAÇ SALIMI ................................................................... 9 ŞEKİL 2. 7. NÜKLEOZİD/NÜKLEOTİD REVERS TRANSKRİPTAZ İNHİBİTÖRLERİ (NRTI) MEKANİZMASI .............................................................................................................................. 11 ŞEKİL 2. 8. NONNÜKLEOZİD REVERSE TRANSKRİPTAZ İNHİBİTORLERİ (NNRTI) MEKANİZMASI .............................................................................................................................. 12 ŞEKİL 2. 9. İNSAN İMMÜN YETMEZLİK VİRÜSÜ (HIV) PROTEAZ TARAFINDAN PARÇALANAN NORMAL PEPTİT BAĞINI TAKLİT EDEN BİR HİDROKSİETİLEN İSKELESİNE DAYANAN PROTEAZ İNHİBİTÖRLERİNİN ETKİ MEKANİZMASI (DE CLERCQ, 2009). ............................................................................................................................. 13 ŞEKİL 2. 10. ENFUVİRTİDİN ETKİ MEKANİZMASI ......................................................................... 14 ŞEKİL 2. 11. İKİ İNTEGRAZ KATALİTİK REAKSİYON (3'-İŞLEME VE İPLİK TRANSFERİ) MEKANİZMASI ............................................................................................................................. 15 ŞEKİL 2. 12. KO-RESEPTÖR İNHİBİTÖRLERİNİN (CRI'LER) ETKİ MEKANİZMASI .................. 16 ŞEKİL 2. 13. DARUNAVİR İLACIN KİMYASAL YAPISI ................................................................... 18 ŞEKİL 2. 14. DARUNAVİR MEKANİZMASI ........................................................................................ 19 ŞEKİL 2. 15. MOLEKÜLER BASKILANMIŞ POLİMERLERİN HAZIRLANMASININ GENEL ŞEMASI ........................................................................................................................................... 21 ŞEKİL 2. 16. KOVALENT BASKILAMA YÖNTEMİ ............................................................................ 23 ŞEKİL 2. 17. KOVALENT OLMAYAN BASKILAMA YÖNTEMİ ...................................................... 24 ŞEKİL 2. 18. YARI-KOVALENT BASKILAMA YÖNTEMİ ................................................................ 25 ŞEKİL 2. 19. METAL KOMPLEKSİ İLE MOLEKÜLER TANIMLAMA, R = FORMAT, ASETAT, PROPİONAT ................................................................................................................................... 26 ŞEKİL 2. 20. KRİYOJELLERİN GÖZENEKLİLİĞİ ............................................................................... 29 ŞEKİL 2. 21. KRİYOJEL SENTEZLENMESİ ......................................................................................... 31 ix ÇİZELGELER DİZİNİ ÇİZELGE 2. 1. KONTROLLÜ İLAÇ SALIMI AVANTAJLARI .............................................................. 5 ÇİZELGE 2. 2. KONTROLLÜ İLAÇ SALIMI DEZAVANTAJLARI ...................................................... 5 ÇİZELGE 2. 3. ABD VE AVRUPA’DA ONAYLANMIŞ ANTİRETROVİRAL İLAÇLAR ................. 17 ÇİZELGE 4. 1. FARKLI MİKTARLARDA D.V YÜKLÜ MİKROKRİYOJELLERİN ŞİŞME DAVRANIŞI VE YÜZEY ALANINA ETKİSİ .............................................................................. 42 ÇİZELGE 4. 2. POLİMER I-V İÇİN MMC SALIM KİNETİK VERİLERİ. ........................................... 47 ÇİZELGE 4. 3. SİTOTOKSİTE ÇALIŞMALARINDAN ELDE EDİLEN % HÜCRE CANLILIK DEĞERLERİ. ................................................................................................................................... 48 ÇİZELGE 4. 4. DARUNAVİRİN TAYİNİ İÇİN KULLANILAN YÖNTEMLER..................................49 x SİMGELER VE KISALTMALAR Simgeler ve Kısaltmalar APS Amonyum Persülfat BET Brunauer-Emmett-Teller Yöntemi D.V Darunavir FDA Gıda ve İlaç Dairesi FTIR Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi HEMA 2-hidroksetil metakrilat HIV İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü MAH N-Metakriloil-(L)-Histidin metil ester MBAAm Metilen Bisakrilamid MED Minimum Etkili Derişimi MIP Moleküler Baskılanmış Polimerlerin MTD Minimum Toksik Derişimi NNRTI Nonnükleozid Reverse Transkriptaz İnhibitörleri NRTI Nükleozid/Nükleotid Revers Transkriptaz İnhibitörleri PHEMA Poli(2-Hidroksietil Metakrilat) PI Proteaz İnhibitörü TEMED N,N,N',N'-tetrametil etilen diamin UV Ultraviyole 1 1. GİRİŞ İnsan immün yetmezlik virüsü/edinilmis immün yetmezlik sendromu hastalarının hastalık süreçlerini ve patolojilerin günlük yaşam üzerindeki etkilerini iyileştirmek veya ortadan kaldırmak için terapötik müdahale gerekmektedir. İlaçlar, doz ve erişimin yeterli olması şartıyla hücresel süreçleri seçimli olarak büyüten veya genellikle daha fazla bloke eden bir etki üretmek için hücresel hedeflerle etkileşime giren yararlı terapötik maddelerdir. İlacın sunumu ve etkisi arasındaki ilişki matematiksel olarak tanımlanabilir ve uygulama için hedef pencereyi hesaplamak amacıyla kullanılır; bununla birlikte, patolojik süreçler vücudun yapısında ve işlevinde değişiklikler meydana geldikçe maruziyeti değiştirebilir ve bu da ilaç etkinliğinin kontrolünün azalmasına yol açar (Duan ve ark., 2014). Tıbbi ve ilaç tedavisinin temel amacı enfeksiyon, inflamasyon, yaralanma etkilerini yavaşlatmaktır. Geleneksel yöntemler, tablet ya da kapsüllerin ağızdan alımı ya da enjeksiyon şeklindedir ve bu yöntemler sık ve tekrarlanan dozlarda ilaç alımını gerektirmektedir. İlaç derişimi başlangıçta bir süre artar, çok kısa bir süre sabit kalır ve hızla azalır. Etkin düzeyin altındaki ve toksik düzeydeki bölgeler boşa harcanmış ilaç miktarlarını ifade eder (Bakhshpour ve ark., 2018). Terapötik bir ajanın plazma derişimi, terapötik pencere adı verilen bir aralıkta tutulmalıdır. Bu aralık, minimum etkili derişimi (MED) ile minimum toksik derişimi (MTD) arasında yer almaktadır. İlaç salım sistemleri bu iki ana derişimi noktasına odaklanmaktadır. İlaç salım sistemi, terapötik ajanı metabolik ataklardan korumalı ve ilacın etkisiz olmasını (MED'nin altında kalmasını) ve aşırı dozun (MTD'nin üstünde olmasını) olumsuz etkilerini önlemek için ilaç moleküllerini terapötik pencerede tutmalıdırlar (Çetin ve Denizli., 2019). Kontrollü salım sistemleri, ilaçları istenilen dozlama aralıklarında hedef dokuya vermeye dayanan etkin bir tedavi yöntemi sunmaktadır. Son zamanlarda araştırmacılar, çevreye duyarlı veya hedef maddeye özgü mekanizmalara sahip olan akıllı malzemelerden geliştirilebilecek ilaç salım sistemlerine odaklanmaktadırlar. 2 Hidrojeller fiziksel ya da kimyasal yolla çapraz bağlanmış, bol miktarda su absorbe edebilen polimer ağlarıdır. Hidrojeller, hazırlama yöntemi, mekanik ve yapısal özellikleri dâhil olmak üzere çeşitli parametrelere bağlı olarak farklı kategorilere ayrılabilir. Hidrojellerin bir türü biyoteknolojide büyük bir öneme sahip olan kriyojeller ve mikrokriyojellerdir (Razavi ve ark., 2019). Kriyojellerin ve mikrokriyojellerin oluşumu çözücünün donma noktasının altında gerçekleşir, polimerleşerek buz kristallerinin etrafında bir ağ yapı oluştururlar. Kriyojellerin, yüksek hidrofiliklik, suda çözünmeden önemli ölçüde şişebilme, biyouyumluluk, esneklik ve yüksek mekanik kararlılığa sahip olma gibi birçok avantajları vardır (Çetin, 2013). Moleküler baskılama yönteminde hedef bir kalıp molekül çevresinde gerçekleşen polimerizasyonla çok özel tanıma ve katalitik bölgelere sahip olan polimer matrisler elde edilir. Molekül polimerden uzaklaştırıldığında ise hedefe özgü boşluklar oluşur (Piletsky ve ark, 2001). Moleküler baskılamış polimerlerin yüksek kararlılığı, düşük maliyeti ve polimerizasyon basamaklarının kontrollü salım sisteminde kullanılan mikroüretime tamamen uyumlu olması pek çok pratik uygulamada sentetik tanıma elemanı olarak kullanılabilmesine olanak sağlar (Bakhshpour ve ark., 2019). Bu tez kapsamında, darunavir baskılanmış poli(2-hidroksietil metakrilat) (PHEMA) mikrokriyojeller hazırlanmıştır. Sonraki aşamada bu mikrokriyojellerin FTIR ile yapı analizi, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile yüzey morfolojisi, şişme deneyleri ve yüzey alanı ölçümleri karakterizasyon çalışmaları incelenmiştir. Tezin son bölümünde ise ilaç baskılanmış PHEMA mikrokriyojellerden darunavir salımı in vitro sistemde incelenmiştir. Ayrıca darunavir salım kinetiği ve davranışı tartışılmıştır. 3 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Kontrollü İlaç Salım Sistemleri Kontrollü salım, ilk kez 1950’li yılların başlarında tarım ilaçlarının polimerik taşıyıcılar kullanarak çeşitli pestisitlerin salımı için denenmeye başlanmıştır. 1960’larda bu denemeler tıp alanına da girmiş ve uygulanmaya başlanmıştır. 1970’li yıllarda ise büyük moleküllü ilaçların (MA>600) katı polimerlerden salımı yönünde çalışmalar başlamıştır (Kost ve Langer, 1984). Son yıllarda hastalıkların tedavisi sürecinde ilaçların, hastalara istenilen dozda, doğru zamanda ve yerde kullanarak verilmesi oldukça önemlidir (Forbes ve ark.,1999). Tedavisi boyunca hastaların ilaca karşı terapötik periyodunun uzatılması ve yan etkilerini azaltması amacıyla birçok çalışmalar yapılmaktadır (Denizli ve ark., 1988). Kontrollü ilaç salım sistemleri, bu çalışmaların başında gelerek hedef dokuya ilaçları istenilen dozlama aralıklarında vermeye dayanan etkin bir tedavi yöntemi sunmaktadır (Singh ve Kim, 2000). Geleneksel yöntemlerde, ilaç kana karıştıkça kandaki etken madde seviyesi, etkili olduğu terapötik plazma derişimi (terapötik pencere) ismi verilen bir aralıkta tutulmalıdır. Bu aralık, minimum etkili derişimi ile minimum toksik derişimi arasında değişmektedir. İlaç salım sistemleri, bu iki ana derişim noktasına odaklanmaktadır ve ilacın, terapötik pencere aralığında uzun bir periyot boyunca salımı gerçekleşebilmelidir (Çetin ve Denizli, 2019a). 4 Şekil 2. 1. Plazmadaki İlaç Derişiminin Zamanla Değişimi ve Geleneksel Alışılmış Dozaj Şekilleri ile Kontrollü Salım Yönteminin Karşılaştırılması Geleneksel yöntemlerde, ilaçların alımı tablet/kapsüller ile oral yolla veya enjeksiyon ile gerçekleşir. İlaç belirli aralıklarda tablet/kapsüller halinde oral yolla alınır, enjeksiyon yoluyla doğrudan kana verilir. Bu tür alışılmış dozaj şekillerinde ilacın plazma düzeyini etkili dozda tutabilmek için ilacın sık sık ve tekrarlanan dozlarda alınması gerekmektedir. Plazmadaki ilaç derişiminin zamanla değişimini gösteren Şekil 2.1. incelendiğinde, başlangıçta kandaki ilaç derişiminin seviyesi hızla bir süre artarak, maksimuma yükseldiği gözlenmektedir. Ardından çok kısa bir süre sabit kalır, ilacın vücuttan atılmasıyla hızla azalıp, minimum seviyeye düştüğü görülmektedir. Alışılmış dozaj şekillerinde ilaç alındıktan bir süre sonra derişim düşer ve ikinci bir uygulama gerçekleştirilir. Bu uygulamada, yeni başka bir benzer doz alınır ve etkin madde-plazma düzeyi etkili alanda tutulmaya çalışılır. Tedavi, bu işlemin birkaç kez tekrarlanmasıyla sağlanabilir. Derişimin düşme süresi, ilacın metabolize edilme, parçalanma ya da etki alanından uzaklaşma gibi nedenlerle vücuda yararsız hale gelme hızına bağlıdır. Bu nedenlerden dolayı ilacın kan plazmasındaki minimum etkili derişimi altına düşebilir veya güvenilir 5 düzeyin minimum toksik derişimi üzerine çıkabilir. Kontrollü ilaç salımı sistemlerinin avantajları ve dezavantajları aşağıdaki Çizelge 2.1 ve Çizelge 2.2’de özetlenmiştir. Çizelge 2. 1. Kontrollü ilaç salımı avantajları; ✓ Belirli bir doz alındıktan sonra tedavi edici oranda ilacın plazma düzeyi, istenilen sürede sabit kalır ve hasta sık sık ilaç almaktan kurtulur. ✓ Düşük dozlarla tedavi sağlanabildiği için ilacın yan ve toksik etkileri azalır veya tamamen ortadan kalkar. ✓ Etkin madde, tedavisi istenen bölgeye, organa, dokuya veya hücreye ulaştırılabilir ve zararlı etkiler azaltılabilir. ✓ Hastaların, yaşam kalitesi artar ve hasta bakımı kolaylaşır. ✓ Hastaya uygulanacak ilaç rejimine hastanın uyumunu sağlayacak şekilde gerekli dozaj miktarı ayarlanabilir. ✓ Etkin madde kapalı bir sistemde bulunduğu için ortam koşullarından etkilenmez. Çizelge 2. 2. Kontrollü ilaç salımı dezavantajları; ✓ Yapı taşı polimerlerdir ve ilaç salım hız ve süreleri polimerlerle ayarlanır, polimerlerin sorun çıkarma olasılığı vardır. ✓ Üretim sırasında oluşabilecek polimerin yapısındaki çatlaklar, ilaç vücuda verildikten sonra salımın kontrolü zorlaşabilir. ✓ Her ilaca uygun tek bir hazırlama yöntemi yoktur. Kullanılan etkin maddenin yapısına ve özelliklerine göre hazırlama yöntemi belirlenir. ✓ Yarılanma ömrü 4 saat civarında olan ilaçlar bu sistem için en uygun ilaçlardır. ✓ İlaç taşıyıcı malzemeler/üretim sürecine bağlı sistem maliyetinin artışı olur. 2.1.1. Salım Mekanizmasına Göre Kontrollü Salım Sistemleri Kontrollü ilaç salım mekanizmaları dört genel sistem ile karakterize edilir. 1. Difüzyon Kontrollü Sistemler 2. Şişme Kontrollü Sistemler 3. Kimyasal Kontrollü Sistemler 4. Dışsal (Ayarlanmış) Kontrollü Sistemler 6 1. Difüzyon Kontrollü Sistemler İlaç salımını kontrol etmek için kullanılan en yaygın mekanizmadır. Salım, Fick difüzyon yasasına göre gerçekleşmektedir. Salım kinetikleri, dozaj biçiminin boyutuna ve şekline bağlıdır. Sistemin boyutlarının ve geometrisinin belirlenmesi ile istenen salım profilleri elde edilebilir (Siepmann ve ark., 1999). Fick’in difüzyon yasasına dayanan sistemler, rezervuar (zarlı) ve matriks (monolitik) olmak üzere iki grupta incelenebilir. Rezervuar sistemlerde, ilaç salım hızı kontrol bariyeri olan bir polimerik zar ile çevrili konumdadır. Bu sistemlerde ilaç salımı zardan difüzyonla gerçekleşir. Bu nedenle kapsüllenmiş olan ilacın zardan difüzyonu hız sınırlayıcı bir aşamadır ve zarın türü, kalınlığı ile kontrol edilir (Tunón ve ark., 2003). İlaç parçacıklarının aşması gereken difüzyonun mesafesi ile salım sabit tutulur. İlaç zar tarafından iç hacimden emilir ve zardan yayılır, rezervuar sistemini çevreleyen sıvıya desorbe edilir. Böylelikle rezervuar sistemlerde salım sıfırıncı derece salım kinetiğiyle gerçekleşir. Matriks (monolitik) sistemlerde ise ilaç polimer içinde çözünmüş veya dağılmış şekildedir. Rezervuar sistemine göre avantajı, hazırlanması daha kolaydır. Dezavantajı ise salım devam ettikçe artan difüzyon mesafesidir bu nedenle ilacın salım hızı zamanla azalmaktadır (birinci dereceden salım davranışı) (Bajpai ve ark., 2008). Şekil 2. 2. Rezervuar (Zarlı) Sistem 7 Şekil 2. 3. Matriks (Monolitik) Sistem 2. Şişme Kontrollü Sistemler Bu sistemde, çözücü alarak şişebilen polimerlerden kontrollü ilaç salımı, çözücünün polimer matriksine girmesine bağlı olarak polimerin camsı-elastiğimsi (kauçuksu) faz geçişi esasına dayanır (Colombo ve ark., 1996). Çözücü, polimer yapısına girdiği an şişebilen polimerlerin esnekliğini artırır, camsı geçiş sıcaklığını düşürür ve makro gözenek oluşumunu sağlar. Böylelikle camsı durumdaki polimerik yapı elastiğimsi duruma geçer ve kısa periyotlarla ilaç salımı gerçekleşir. Şekil 2. 4. Hidrojel Tabletin Camsı ve Elastiğimsi Halleri (Çetin, 2013). 8 3. Kimyasal Kontrollü Sistemler Kimyasal kontrollü sistemler, biyobozunur sistemler (Erozyon) ve zincire takılı sistemler olmak üzere ikiye ayrılırlar. Biyobozunur (Erozyon), polimerlerin gelişimiyle oldukça yaygınlaşmıştır. Biyobozunur sistemlerde, salım oldukça karmaşıktır ve kimyasal, fiziksel erozyonla gerçekleşmektedir. Asit-baz hidrolizi, enzimatik etki veya yükseltgenme (oksidasyon) ile polimer zaman içerisinde aşınır. Polimer aşındıkça, kontrollü ilaç salımı gerçekleşir. Zincire takılı sistemlerde ise ilaç, polimer ağına parçalanabilir kovalent bağlarla bağlıdır. Bu bağlar, hidrolitik ve enzimatik yolla parçalanır. Bağların parçalanma hızı ile kontrollü ilaç salımı gerçekleşir (Lin ve Metters., 2006). Şekil 2. 5. Biyobozunur Sistemden İlaç Salımı 9 Şekil 2. 6. Zincire Takılı Sistemden İlaç Salımı 4. Dışsal (Ayarlanmış ) Kontrollü Sistemler Dışsal sistemlerde ilacın salımı, fiziksel veya kimyasal uyarı ile gerçekleşmektedir. Substrat duyarlı, pH, sıcaklık, elektriksel alan, iyonik güç ve UV (ultraviyole) ışığı gibi çevre duyarlı olarak hazırlanabilirler (Bajpai ve ark., 2008). 2.2. Antiretroviral İlaç Antiretroviral ilaç tedavisi, insan immün yetmezlik virüsü (HIV)/Edinilmiş immün yetmezlik sendromu (AIDS) hastalarının tedavisinde temel bir rol oynar. HIV enfeksiyonu, 1990'ların ortalarından günümüze kadar (Youle, 2007) erken tanı, düzenli takip ve antiretroviral ilaç tedavisi ile yönetilebilir kronik bir enfeksiyon haline gelmiştir. Yıllar içerisinde daha etkin, kullanımı daha kolay, daha az yan etkiye sahip ve genetik bariyeri daha yüksek bir proteaz inhibitörü (PI) içeren antiretroviral ilaçlar geliştirilmiştir. HIV enfeksiyonu olan hastalarda tedavinin hedefleri yaşam kalitesini arttırmak, HIV-1 proteaz (PR), inhibitörlerinin kullanımının, kalıcı virolojik baskılamaya bağlı olarak morbidite ve mortaliteyi azaltmaktır (De Meyer ve ark., 2005). Bazı hastaların tedavilerinde iki ya da daha fazla sınıftan en az iki ilaçlı kombinasyonlar kullanılmaktadır. 10 İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV-1), edinilmiş immün yetmezlik sendromunun (AIDS) birincil nedeni olarak kabul edildikten sonra (Leonis ve ark., 2012), 25 anti-HIV bileşiği, AIDS tedavisinde klinik kullanım için resmi olarak onaylanmıştır (Çizelge 2.1). 2.2.1. Antiretroviral Bileşikleri Günümüzde antiretroviral tedavi bileşikleri 6 sınıfa ayrılır: 1. Nükleozid/Nükleotid Ters Transkriptaz İnhibitörleri (NRTI) 2. Nonnükleozid Ters Transkriptaz İnhibitörleri (NNRTI) 3. Proteaz İnhibitörleri (PI) 4. Füzyon / Giriş İnhibitörleri 5. İntegraz İnhibitörleri 6. Ko-reseptör Antagonistleri 1. Nükleozid/Nükleotid Ters Transkriptaz İnhibitörleri (NRTI) Etki mekanizması: Zincir sonlandırıcılarıdır. 3’ hidroksil gruplarıın olmamasından dolayı uzmakta olan DNA zincirine girdiklerinde kendilerine yeni bir nükleotid eklenemez. Direnç mekanizması: Nükleotidlerin eklenmesi bozulur, M184V, K65R ve Q151M kompleksi seçici olarak viral RT’nin nükleotid anologlarını yeni DNA molekülüne ekleme yeteneğini azaltırlar. Nükleotidlerin DNA zincirinden çıkartılması, TAM’lar ATP’nin RT’ye nükleozid anlogunun sokulması ile sonlanmış olan DNA zincinin 3’ ucuna yakın bir yerden bağlanmasına olanak verirler ve bağlanan ATP, nükleozid analogunu viral DNA’dan ayırır. Sonunda ters transkripsiyon işlemi kaldığı yerden devam eder (Midilli, 2014). İnhibitörleri: Tenofovir Disoproksil Fumarat (TDF), Tenofovir Alafenamid (TAF), Emtrisitabin (FTC), Abakavir (ABC), Lamivudin (3TC), Zidovudin (AZT), Zalsitabin (ddC), Didanozin (ddI), Stavudin (d4T) 11 Şekil 2. 7. Nükleozid/Nükleotid Ters Transkriptaz İnhibitörleri (NRTI) Mekanizması 2. Nonnükleozid Ters Transkriptaz İnhibitorleri (NNRTI) Etki mekanizması: RT enziminin katalitik bölgesine yakın bir yerdeki hidrofobik cebe yüksek afinite gösterirler. Bu cebe bağlandıklarında enzimin esnekliğini bozarlar ve RT DNA sentezleyemez hale gelir. Direnç mekanizması: Direnç mutasyonlarının çoğu inhibitörlerin bağlanma bölgesi içinde yer alır. Az sayıdaki mutasyonsa inhibitörle doğrudan temas halindeki amino asitlerin pozisyon ya da yönünde değişikliğe yol açar. Etravirin (ETV), konformasyonel izomerizm gösteren bir diarilprimidindir ve RT enzime değişik konformasyonlarda bağlanabilme özelliği, bazı direnç mutasyonlarının (K103N) varlığında bile RT enzimine bağlanmasına olanak verir (Midilli, 2014) İnhibitörleri: Efavirenz (EFV), Nevirapin (NVP), Rilpivirin (RPV), Etravirin (ETV), Delavirdin (DLV) 12 Şekil 2. 8. Nonnükleozid Reverse Transkriptaz İnhibitorleri (NNRTI) Mekanizması 3. Proteaz İnhibitorleri (PI) Etki mekanizması: PI’leri HIV proteaz enziminin doğal viral substratlarını taklit eder ve enzimin aktif kısmına bağlanmada doğal substratlarla yarışa girer. Direnç mekanizması: İnhibitörlerle doğrudan temas halindeki amino asitlerdeki mutasyonlar ya da enzimin oyuğunun genel yapısında değişikliğe yol açan amino asit değişiklikleri, inhibitörlerin enzimin oyuğa uyumunu bozarak dirence yol açar (Midilli, 2014) İnhibitörleri: Tipranavir (TPV), İndinavir (IDV), Sakinavir (SQV), Darunavir (DRV), Atazanavir (ATV), Lopinavir (LPV), Ritonavir (RTV), Amprenavir (APV), Fosamprenavir (FPV), Nelfinavir (NFV) 13 Şekil 2. 9. İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü (HIV) Proteaz Tarafından Parçalanan Normal Peptit Bağını Taklit Eden Bir Hidroksietilen İskelesine Dayanan Proteaz İnhibitörlerinin Etki Mekanizması (De Clercq, 2009). 4. Füzyon / Giriş İnhibitörleri (Enfuvirtid) Etki mekanizması: Enfuvirtid, 36 merlik bir sentetik oligopeptidtir ve trimerik HR-1 kompleksine bağlanarak, HR-1 ve HR-2 birleşmesini ve böylelikle füzyonu engeller. Direnç mekanizması: Gp41’in HR1 bölgesinin 36-38 ve 39-45. pozisyonlarında korunmuş olan amino asit üçlülerindeki değişiklikler enfuvirtdin bağlanmasını engeller. (Midilli, 2014) İnhibitörleri: Enfuvirtid (T-20) 14 Şekil 2. 10. Enfuvirtidin etki mekanizması (Matthews ve ark., 2004) 5. İntegraz İnhibitorleri (InSTI) Etki mekanizması: Raltegravir ve Elvitegravir, integrazın katalitik çekirdeğindeki katiyonlara (Mg++) bağlanarak integraz ile konak DNA’sı arasında kovalent bağ oluşumunu engeller. Direnç mekanizması: Katalitik çekirdekteki katyonlara bağlanan bölgelerdeki mutasyonlar direnç gelişimi ile ilişkilidir. Çapraz direnç son derece yaygındır (Midilli, 2014). İnhibitörleri: Raltegravir (RAL), Dolutegravir (DTG), Elvitegravir/Kobisistat (EVG/cobi) 15 Şekil 2. 11. İki İntegraz Katalitik Reaksiyon (3'-İşleme ve İplik Transferi) Mekanizması (De Clercq, 2009) 6. Ko-reseptör Antagonistleri Etki mekanizması: CCR5 antagonistlerinin bağlanması, CCR5 resptörünün üç boyutlu yapısında değişikliğe yol açar ve gp120, CCR5’e bağlanamaz. Direnç mekanizması: Dirençli virüsler, CCR5 antagonistlerinin CCR5 reseptörlerinde oluşumuna yol açtıkları üç boyutlu yapı değişikliklerini tanıyabilme yeteneği kazanırlar (Midilli, 2014) İnhibitorleri: Maraviroc (MVC) 16 Şekil 2. 12. Ko-reseptör İnhibitörlerinin (CRI'ler) etki mekanizması (Westby, 2005) İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) glikoprotein gp120, CD4 (A) 'ya bağlanır. Bu, gp120'de konformasyonel değişiklikleri ve C4'teki V3 halkasını ve spesifik amino asit kalıntılarını içeren karmaşık bir alan olan ko-reseptör bağlanma bölgesinin (B) açığa çıkmasına neden olur ve topluca "köprü tabakası" olarak adlandırılır. Ortak reseptör bağlanma bölgesinin açığa çıkması, gpl20'nin ortak reseptöre (C) bağlanmasına izin verir. Ortak reseptör antagonistleri, ko-reseptörü bağlayarak ve şeklini gpl20'nin tanıyamayacağı şekilde değiştirerek bu adımı inhibe eder. Ortak reseptör bağlanması, gp41'de konformasyonel değişiklikleri ve bir "füzyon peptidinin" konakçı hücre membranına (D) sokulmasını indükler ve sonuçta viral ve hücre membranlarının füzyonuyla sonuçlanır. Viral çekirdeğin hücreyi geçip enfekte edebileceği bir füzyon gözeneği oluşturmak için birden fazla gp120 ko-reseptör etkileşimi gereklidir. 17 Çizelge 2. 3. ABD ve Avrupa’da onaylanmış Antiretroviral İlaçlar Genel isim Marka adı Üretici firma FDA onay tarihi Zidovudin Retrovir GlaxoSmithKline 19 Mart 1987 Didanozin Videx (tablet) Bristol-Myers Squibb 9 Ekim 1991 Videx EC (kapsül) Bristol-Myers Squibb 31 Ekim 2000 Zalsitabin Hivid Hoffmann-La Roche 19 Haziran 1992 Stavudin Zerit Bristol-Myers Squibb 24 Haziran 1994 Lamivudin Epivir GlaxoSmithKline 17 Kasım 1995 Saquinavir Invirase Hoffmann-La Roche 6 Aralık 1995 Fortovase Hoffmann-La Roche 7 Kasım 1997 Ritonavir Norvir Abbott Laboratuvarları 1 Mart 1996 Indinavir Crixivan Merck 13 Mart 1996 Nevirapin Viramune Boehringer Ingelheim 21 Haziran 1996 Nelfinavir Viracept Agouron İlaç 14 Mart 1997 Delavirdin Rescriptor Pfizer 4 Nisan 1997 Efavirenz Sustiva (ABD) Bristol-Myers Squibb 17 Eylül 1998 Stocrin (Avrupa) Merck 17 Eylül 1998 Abacavir Ziagen GlaxoSmithKline 17 Aralık 1998 Amprenavir Ageneraz GlaxoSmithKline 15 Nisan 1999 Lopinavir + ritonavir Kaletra Abbott Laboratuvarları 15 Eylül 2000 Aluvia Abbott Laboratuvarları 15 Eylül 2000 Tenofovir disoproksil fumarat (TDF) Viread Gilead Bilimleri 26 Ekim 2001 Enfuvirtid Fuzeon Hoffmann-La Roche ve Trimeris 13 Mart 2003 Atazanavir Reyataz Bristol-Myers Squibb 20 Haziran 2003 Emtrisitabin Emtriva Gilead Bilimleri 2 Temmuz 2003 Fosamprenavir Lexiva (ABD) GlaxoSmithKline 20 Ekim 2003 Telzir (Avrupa) GlaxoSmithKline 20 Ekim 2003 Tipranavir Aptivus Boehringer Ingelheim 22 Haziran 2005 Darunavir Prezista Tibotec, Inc. 23 Haziran 2006 Maraviroc Celsentri (Avrupa) Pfizer 18 Eylül 2007 Selzentry (ABD) Pfizer 18 Eylül 2007 Raltegravir Isentress Merck & Co., Inc. 12 Ekim 2007 Etravirin Zeka Tibotec Terapötikler 18 Ocak 2008 18 2.2.2. Darunavir Darunavir (D.V) veya TMC114, Darunavir etanolat, Prezista olarak da kullanılmaktadır. Kimyasal adı [(1S, 2R) -3 - [[(4-aminofenil) sülfonil] (2-metilpropil) amino] -2- hidroksi-1- (fenilmetil) propil] -karbamik asit (3R, 3aS, 6aR) -heksahidrofuro [ 2,3-b] furan-3-il ester ‘tır. Kimyasal özelliikleri, görünümü beyaz şekilsiz katı, moleküler formülü C27H37N3O7S, mol kütlesi 547,665 g/mol, erime noktası: 74-74 ℃, çözünürlüğü yaklaşık 0,15 mg / mL, eliminasyon yarı ömrü 15 saat ve protein bağlama 95% ‘tir (National Center, 2021). Şekil 2. 13. Darunavir İlacının Kimyasal Yapısı Darunavir, edinilmiş immün yetmezlik sendromuna (AIDS) karşı ilaç keşfinde en önemli enzimlerden biri olan olgun insan immün yetmezlik virüsü HIV-1 proteaz (PR), aspartil proteazlar ailesinin pazara ulaşan onuncu ve şimdiye kadar son üyesidir (Li ve ark., 2014). Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından 23 Haziran 2006 tarihinde Prezista markası altında (De Clercq, 2009) ABD ve tüm AB ülkeleri de dahil olmak üzere birçok ülkede onaylanmıştır. İkinci nesil peptidik olmayan peptidomimetik (Mantena ve ark., 2015) bir proteaz inhibitörü (PI) ve antiretroviral ilaç olan D.V'nin, şiddetli yan etkiler ve ilaç toksisiteleri gibi erken proteaz inhibitörü ile ilgili sorunların üstesinden geldiği, yüksek bir terapötik doz gerektirdiği keşfedilmiştir, üretimi maliyetlidir (Ghante ve ark., 2014). 19 D.V, oral yoldan (Fenton ve Perry, 2007) HIV / AIDS’i tedavi etmek ve önlemek için ritonavir ve diğer ilaçlı kombinasyonlar ile kullanılmaktadır. In vitro, darunavir güçlü antiretroviral potensi ve seçiciliği (Pauwels, 2006), sınırlı sitotoksisiteye ve dirence karşı yüksek bir genetik bariyere sahiptir. Ayrıca çoklu ilaca dirençli HIV-1’in laboratuvar suşlarına ve klinik izolatlarına karşı in vitro olarak aktif olup potensi korumaktadır, enfekte olmuş hücrelerde HIV gag ve gag-pol poliproteinlerinin bölünmesini seçici olarak inhibe ederek olgun virüs partiküllerinin oluşumunu önler (McKeage, K, 2009). HIV'in çoğalması için gerekli olan bir enzim olan HIV proteazı bloke eder. HIV enfeksiyonu, bağışıklık sistemi için önemli olan CD4 (T) hücrelerini yok eder. Bağışıklık sistemi enfeksiyonla savaşmaya yardımcı olur. Saf ve PI deneyimi olan HIV'li hastaların tedavisi için potansiyel bir Antiretroviral ilaç adayı olabileceği sonucuna varılmıştır (De Meyer ve ark., 2005). Şekil 2. 14. Darunavir Mekanizması 2.3. Moleküler Baskılama Moleküler baskılama, moleküler afiniteli polimer matriksten kalıp molekül tasarımını hazırlamak için yapay bir yaklaşımdır (Byrne ve Salian, 2008). Moleküler baskılama yönteminde, hedef bir kalıp molekül ile çevresinde gerçekleşen (Çetin ve Denizli, 2019a) fonksiyonel monomerin ve çapraz bağlayıcının üç boyutlu yapılarının etkileşmesine bağlı bir polimerizasyon işlemidir (Spivak, 2005). Bu işlemde, özel tanıma ve katalitik bölgeli özellikleri olan polimer matrislere sahip olunur. Molekül https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0166354206001355?via%3Dihub#! 20 polimerden uzaklaştırıldığı zaman hedefe özgül boşluklar meydana gelir (Piletsky ve ark., 2001). Moleküler baskılama yöntemi ilk kez 1972 yılında Günter Wulff ve çalışma grubu tarafından ifade edilmiştir (Çetin, 2018). Moleküler baskılanmış polimerlerin (MIP) yüksek kararlı yapıları (basınç, yüksek sıcaklık, ve geniş pH değişimleri gibi faktörlere karşı), düşük maliyeti, kolay hazırlanması moleküler tanımaya elverişli olmaları moleküler baskılanmış polimerlere olan ilgiyi yoğunlaştırmıştır (Bakhshpour ve ark., 2018). Ayrıca birkaç yıl boyunca saklanabilir ve tekrarlanarak kullanılabilirler (Bakhshpour ve ark., 2021). Moleküler baskılama yöntemi temel olarak üç basamaktan oluşmaktadır: 1. Ön-kompleksleşme: Fonksiyonel monomerler, hem seçici etkileşime girebilecek fonksiyonel gruplara hem de polimerleşebilecek doymamış bağlara sahip moleküllerdir. Bu monomerler, kalıp moleküle kovalent veya kovalent olmayan etkileşimlerle bir kompleks oluştururlar. Bu basamakta kalıp etrafında fonksiyonel gruplara sahip monomerin bağlandığı bir kalıp (hedef) molekülün etkileşimi söz konusudur. Bu etkileşimde, kalıp (hedef) molekülün üç boyutlu yapısı ve kimyasal özellikleri açısından çok önemli bir yer tutar. 2. Polimerizasyon: Fonksiyonel monomer-kalıp (hedef) molekül kompleksi, uygun bir çapraz bağlayıcının da kullanılmasıyla fonksiyonel monomer üzerinden polimerleştirilir. 3. Kalıp Molekülün Uzaklaştırılması: Yapıda kalıp (hedef) molekülün yerini alacak boşlukların oluşturulması amacıyla, kalıp (hedef) molekül polimerden uzaklaştırılır. Uygun koşullar altında, bu boşluklar kalıp (hedef) molekülün boyutunu, yapısını ve fizikokimyasal özelliklerini tanır, yüksek seçicilik ve ilgiye sahip olarak kalıp (hedef) bağlar (Saylan ve ark., 2014). 21 Şekil 2. 15. Moleküler Baskılanmış Polimerlerin Hazırlanmasının Genel Şeması 2.3.1. Moleküler Baskılama Yönteminde Kullanılan Temel Bileşenler Kalıp (Hedef) Moleküller: Moleküler baskılama tekniğinde, çapraz bağların arasından kolaylıkla uzaklaştırabilmek için (Shen ve ark., 2012) amino asitler ve türevleri, karbohidratlar, aminler, ilaçlar, metal iyonları, vitaminler, proteinler, hormonlar, enzimler ve hücreler gibi küçük moleküller kalıp (hedef) moleküllü olarak kullanılabilir (Turner ve ark., 2006). Kalıp (hedef) molekül merkezi bir öneme sahiptir ve moleküler baskılama süreci boyunca monomerlerin fonksiyonel gruplarının organizasyonunu yönetir (Bakhshpour ve Ark., 2019). Baskılanan molekül polimerleşme esnasında kimyasal olarak inert olmalıdır (Bakhshpour ve ark., 2020a). Serbest radikal polimerizasyonunu engelleyecek veya yavaşlatacak grup içermemeli ve polimerleşme süresince yüksek sıcaklıklarda baskılanan molekül kararlı olmalıdır (Yan ve Kyung, 2006). Fonksiyonel Monomer: Moleküler baskılama işleminde kilit rol oynarlar. Fonksiyonel monomer ile kalıp (hedef) molekül yüksek afinitede bağlanma etkileşimlerinden sorumludur. Bu nedenle baskılama işlemi sırasında monomer ve kalıp (hedef) molekül arasındaki etkileşim birbirinin tamamlayıcısı olmalıdır. Kovalent moleküler baskılama yönteminde, Kovalent olmayan etkileşimleri içeren baskılama modelinde fonksiyonel 22 monomer ile kalıp (hedef) molekül arasındaki etkileşimi artırmak icin fazla oranda fonksiyonel monomer kullanılır(kalıp (hedef) molekül ve fonksiyonel monomer oranı 1:4 olarak seçilir). Bu oran çok az olursa yeterli bağlanma bölgeleri oluşmaz ya da yüksek olursa özgül olmayan adsorpsiyon bölgeleri oluşur (Vasapollo ve ark., 2011). Çapraz Bağlayıcılar: Doğrusal molekülleri köprü vazifesi ile kararlı bir ağ matrisine bağlayarak polimer zinciri ağı oluşturur. Bir diğer görevi ise bu polimer zincirini desteklemek ve düzenlemektir (Bereli ve ark., 2020). Bu nedenle, çapraz bağlayıcı oranının moleküler baskılanmış polimerlerin özelliklerinin üzerindeki etkisi fazladır. Çapraz bağlayıcı miktarı az olduğu zaman, moleküler baskılanmış polimerlerin, özgün tanıma yeteneği olan oyukların kendilerine özgü şekillerini devam ettiremezler ve kararlılığı ile doğrudan ilişkili olan çapraz bağlanma bölgelerinin yetersiz ve verimsiz olmasına ayrıca aşırı miktarı ise birim kütledeki fonksiyonel monomer sayısını düşürür ve tanıma bolgelerinin sayısının düşmesine neden olur (Yan ve Kyung, 2006). Çözücü: Baskılanmış polimerlerin gözenekli yapıda olmasını sağlar. Çözücü molekülleri tarafından kaplanan boşluklar, çözücü kalıp (hedef) molekülün uzaklaştırılmasına ve kalıp (hedef) molekül ile fonksiyonel monomerler arasındaki etkileşimleri yeniden bağlanmasına kolayca izin verebilecek derecede gözenekli bir matris oluşturmasını sağlamalıdır. Genel olarak polar çözücüler, kalıp (hedef) molekül ile fonksiyonel monomerler arasındaki kompleks oluşturmasını sağlayacak hidrojen bağı gibi etkileşimleri bozarak kalıp (hedef) molekül-monomer kompleksi oluşumunu negatif yönde etkiler. Bu nedenle, toluen, benzen, kloroform, ksilen ve metilen klorür gibi düşük dielektrik sabitlerine sahip çözücüler moleküler baskılamada yaygın olarak tercih edilir (Li ve ark., 2012). Başlatıcılar: Polimerleşmenin başlamasını sağlayan kimyasal maddelerdir. Başlatıcılar monomerlere göre daha az miktarlarda (%1 civarında) kullanılırlar (Yan ve Kyung, 2006). Başlatıcı seçilirken polimerleşme türü ile kalıp(hedef) molekülün ve fonksiyonel monomerlerin kimyasal yapısı göz önünde bulundurulmalıdır. Moleküler baskılanmış polimerlerin hazırlanmasında kullanılan başlatma yöntemleri radyasyon polimerizasyonu, radikal polimerizasyonu ve elektrokimyasal polimerizasyon yöntemleri olarak gruplara ayrılabilir (Li ve ark., 2012) 23 2.3.2. Moleküler Baskılama Yöntemleri Kovalent Baskılama Yöntemi: Kovalent baskılama yöntemi, Günter Wulff ve çalışma grubu tarafından 1970'lerin başında tanımlanmıştır (Wulff ve Sarhan, 1972). Bu yönteme göre, Şekil 2.16’ da gösterildiği gibi kalıp (hedef) molekül ile fonksiyonel monomer borat esterleri, Schiff bazları ,imin asetal türevlerini oluşturmak üzere tersinir kovalent olarak tepkimeye girer ve polimerleşme sonucu çapraz bağlanmış polimerler sentezlenir (Wulff ve ark., 1977). Ardından tanıma bölgelerini oluşturmak için kalıp (hedef) molekül çözücü varlığında kovalent bağlar kırılarak uzaklaştırılır. Molekül, baskılanmış polimerlerle etkileştirildiğinde kırılan kovalent bağa benzer bağ yeniden oluşur. Kovalent baskılama yönteminde yaygın olarak kullanılan küçük moleküllü fonksiyonel monomerler, etilen içeren borik asit, dioller ve borik asit esteri gibi esterler içeren silan karışımlarıdır (Molinelli, 2004). Şekil 2. 16. Kovalent Baskılama Yöntemi 24 Kovalent Olmayan Baskılama Yöntemi: 1981'lerin başında Mosbach ve Arshady tarafından moleküler baskılanmış polimerlerin geliştirilmesi kovalent olmayan baskılama için öne sürülen bir yöntemdir (Arshady ve Mosbach, 1981). Bu yöntemde, Şekil 2.17’de gösterildiği gibi elektrostatik kuvvetler, hidrojen bağı, yük transferi, van der Waals kuvvetleri, hidrofobik etkileşim, iyon-dipol ve dipol-dipol gibi kovalent olmayan etkileşimler fonksiyonel monomerleri kalıp (hedef) molekül etrafında düzenlemek için kullanılır. Polimerleşmeden sonra kalıp molekül uygun çözücülerle polimerden uzaklaştırılır. (Ersöz ve ark., 2005). Polimer matrisi, kovalent baskılama yönteminin tersine, herhangi bir bağ kırılması gerçekleşmeden korunur ve özgül tanıma bölgelerine tekrardan bağlanma benzer kovalent olmayan etkileşimler yoluyla gerçekleşir. Baskılanmış polimer hazırlamak için etkili ve kolay olması nedeniyle en yaygın olarak kullanılan yöntemdir (Kempe ve Mosbach, 1994). Şekil 2. 17. Kovalent Olmayan Baskılama Yöntemi 25 Yarı-kovalent baskılama yöntemi: 1990’ların sonunda Whitcombe ve çalışma grubu tarafından geliştirildi. Bu hibrit (melez) yöntem kovalent ve kovalent olmayan baskılamanın bir versiyonu olarak düşünülebilir. Bu yöntemde, Şekil 2.18’de gösterildiği gibi kalıp (hedef) molekül - fonksiyonel monomer kovalent bağlar ile oluşur ve polimerleşme sonası bağ kırılarak hedef molekül ortamdan uzaklaştırılır, kalıp (hedef) molekülün yeniden bağlanması kovalent olmayan etkileşimler ile gerçekleşir (Caro ve ark., 2002). Yarı-kovalent baskılama icin iki farklı yöntem bulunmaktadır. Birincisi, kalıp (hedef) molekül ile fonksiyonel monomer arasına hedef molekülle birlikte ortamdan uzaklaşan aracı gruplar eklemektir. İkincisi ise kalıp molekül ile fonksiyonel monomer arasına kalıp molekülle birlikte ortamdan uzaklaşan aracı gruplar eklenmesidir (Qi ve ark., 2010; Whitcombe ve Vulfson, 2001). Şekil 2. 18. Yarı-Kovalent Baskılama Yöntemi (Çetin, 2013) 26 Metal İyon Etkileşimleri ile Baskılama Yöntemi: Bu baskılama yönteminde, metal iyonlarıyla ligandlar arasında kurulan koordine kovalent bağlar üç boyutlu bir matris yapısı oluşturur (Şekil 2.19’da gösterilmiştir). Çoğu biyolojik reseptör hem yapısal hem de katalitik görevlere ve bu nedenle reaktif merkezin saptanmasına yardımcı olan metal iyonları içerir (Çetin, 2018). Doğada yapısal ve katalitik alanlarda önemli roller üstlenmektedir. Örnek olarak, hemoglobinin oksijen atomlarını 𝐹𝑒2+ iyonu içeren hem molekülleri ile bağlaması ve genetik materyalin sentezinde onarım görevi olan fosforil transferaz enzimlerinde metallerin katalitik etkisi gösterilir (Tock ve ark., 2003). Bu yöntemde, polimerleşme öncesi koordine kovalent bağlar sayesinde kalıp (hedef) molekül-metal iyonu ve fonksiyonel monomer kompleksi oluşturulur. Farklı metal iyonlarının farklı fonksiyonel gruplara gösterdikleri ilgi değişkendir. Örneğin, 𝑁𝑖2+ ve 𝑍𝑛2+iyonları fosforil gruplarına ilgi gösterirken, 𝐶𝑢2+ ve 𝐹𝑒2+ iyonları histidinin imidazol gruplarına yüksek ilgi gösterir (Hancock ve Martell, 1989). Böylelikle bu yöntemde aşırı miktarda fonksiyonel monomer bağlama gruplarını kullanmaya gerek kalmadığı için spesifik olmayan bağlanma riski azalır. Bu sebeple moleküler baskılama, metal iyonları sayesinde yüksek seçiciliğe ve ilgiye sahip polimerik sistemlerin geliştirilmesine katkı sağlar. Şekil 2. 19. Metal Kompleksi İle Moleküler Tanımlama, R = format, asetat, propionat (Çetin, 2013) 27 2.3.3. Moleküler Baskılanmış Polimerlerin Kullanım Alanları Moleküler baskılanmış polimerler ayırma işlemlerinde, çevresel, sensör ve kataliz alanlarında uygulanmaktadır. 2.4. Kriyojeller Hidrojeller , büyük miktarda su veya biyolojik sıvıyı emme kabiliyetine sahip üç boyutlu (3B) çapraz bağlı doğal veya sentetik polimer ağ olarak kabul edilir (Choudhary ve ark., 2018). Hidrojel , ısı, pH, elektrik alan ve iyonik kuvvet gibi çeşitli çevre koşullarında bile fiziksel yapılarını koruyabilen ve sıvıyı emme ile özgün boyutlarının yüzlerce katına kadar şişebilen özelliklerinin (Şarkaya ve Allı, 2021) yanında çok yönlü üretim yöntemlerinden dolayı, doku mühendisliği ile rejeneratif tıptan atık su arıtımına ve yumuşak robotiklere kadar çok çeşitli biyomedikal ve mühendislik uygulamalarında kullanılmıştır (Wang ve Ak., 2020). Son yıllarda, farklı hidrojel adsorbanlar geliştirilmiştir. Bu adsorbanlar, hidrojellerin türleri olan biyoteknolojide büyük bir öneme sahip, sıfırın altındaki sıcaklıklarda sentezlenen kriyojel / mikrokriyojel bazlı adsorbanlardır (Çetin ve Denizli, 2019b).Geçmişi 50 yıl öncesine uzanan kriyojellerin kökeni Yunancaya dayanmaktadır. Yunanca (κριοσ [Kryos] 'dan, yani buz) anlamına gelir (Lozinsky, 2018). Kriyojeller, monomerik veya polimerik öncüllerin orta derecede donmuş çözeltilerinde kriyojelasyon yoluyla sıfırın altındaki sıcaklıklarda sentezlenen hidrofilik, süpermakrogözeneklere, elastik ve süngerimsi morfolojiye sahip jel matrislerdir (Plieva ve ark., 2008). Kriyojeller, mükemmel yapısal özellikleri, boyutları 10-100 μm arasında değişen ve her boyuttaki çözünen maddelerin akış dinamikleri nedeniyle yeni nesil adsorbanlar olarak sınıflandırılır. Son zamanlarda kriyojellerin, biyoteknolojik ve biyomedikal uygulamalarda önemi artmaya başlamıştır. Örneğin, kriyojeller moleküler baskılama tekniklerinde, nanoparçacıkların ve bütün hücrelerin kromatografisinde, ilaç salım sistemlerinde uygulanmaktadır (Bakhshpour ve ark., 2020b). Fiziksel, kimyasal ve mekanik deformasyona karşı direnme kabiliyeti, enzim immobilizasyonu için taşıyıcılar, mikrobiyal hücre ve antikor immobilizasyonu, biyoafinite malzemeleri ve şişme kinetiği ilaç salım sistemleri için jel tabanlar gibi özelliklere sahip olması ön plana çıkmasını ve kullanışlı olmalarını sağlamaktadır https://www.sciencedirect.com/topics/materials-science/natural-polymer https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/polymerization 28 (Bakhshpour ve ark., 2014; Bakhshpour ve ark., 2016; Babac ve ark., 2006; Baydemir ve ark., 2009). Kriyojeller, kriyojelasyon (polimerizasyon) sırasında, katı fazı oluşturan çözücü molekülleri, kullanıcıların herhangi bir engel ve difüzyon problemi olmadan yüksek akış hızında çalışmasına mümkün kılan birbirine bağlı akış kanalları oluşturmak için porojen (gözenek yapıcı) görevi de görür (Memmedova ve ark., 2015). Bu görevde, porojen (gözenek yapıcı) olarak buz kristallerini kullanır.Yapılan kriyojelasyon türüne göre gözenek boyutlarını da kontrol etmek mümkündür (Plleva ve ark., 2007). Makro gözenekli yapı kriyojeller genellikle sütun ve membran-disk, monolitik kolon biçimde sentezlenir. Sentez süreleri karmaşıktır ve boncuk boyutunu kontrol etmek zordur. Son yıllarda, mikron boyutuna yakın gözeneklere sahip malzemeler (mikrokriyojeller), biyoteknolojik çalışmalar için dikkat çekmeye başlamıştır. Bu mikrokriyojeller, hücresel niş bileşenleri için enjekte edilebilir bir salım sistemi olarak kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Geometrik özelliklerin hassas kontrolü ile mikrokriyojeller potansiyel olarak doğal dokuların belirli mimarilerini kopyalayan çok yönlü hücresel düzenekler oluşturmak için ölçme olarak kullanılır. Mikrokriyojeller, suya maruz kalan yüzey / toplam hacim oranının daha yüksek olması nedeniyle şişme dengesine diğer kriyojellerden çok daha hızlı ulaşır. 29 Şekil 2. 20. Kriyojellerin Gözenekliliği 2.4.1. Kriyojellerin Sentezlenmesi Kriyojellerin sentezlenmesini genel olarak 3 aşamada verebiliriz. Şekil 2.21’de gösterildiği gibi, bu aşamalar sırasıyla; 1) Polimer Çözeltisinin Hazırlanması İlk aşamada, polimer öncülleri/monomerler uygun çözücü içerisinde çözülür ve içerisinde çapraz bağlayıcıların ayrıca başlatıcıların eklendiği polimer çözeltisi hazırlanır. Sentez aşamasında, genellikle çözücü olarak su kullanılır ve oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Bu aşamada dikkat edilmesi gereken bir şart vardır. Dondurmadan önce jel öncüllerinin jele dönüşümünü en aza indirmek gerekir. Aksi halde, eğer çözücünün kristalleşmesinden önce jelleşme gerçekleşirse bu istenmeyen bir durumdur, ağın üç boyutlu yapısında bozulmalar olabilir. Bu durumu önlemenin iki yöntemi bulunmaktadır. Birinci yöntem, jelleşme başlamadan önce hızlı bir şekilde sistemi dondurmaktır. İkinci yöntem ise, başlatıcı ya da çapraz bağlayıcı eklemeden önce polimer çözeltisi sistemini buz banyosunda veya donma noktasının üzerindeki bir sıcaklıkta soğutmaktır (Çoban, 2015). 30 2) Sistemin Dondurulması ve İnkübasyonu İkinci aşama, hazırlanan polimer çözeltisinin dondurulması, bir sonraki aşamada kendiliğinden jel oluşumu ve elde edilen kriyojellerin özelliklerinin belirlenmesi için önemlidir. Dolayısıyla, buza bağımlı katı sistem içinde Jellerin oluşumu sırasında gerçekleşen işlemler ,öncül maddelerin başlangıçtaki moleküler/ koloidal çözeltilerinin donma özellikleri jelleşme verimliliğini ve oluşan kriyojelin yapısal özelliğini de belirler. Dondurma işleminin parametreleri; Dondurma sıcaklığı, soğutma hızı ve özel işlemlerdir. Parametreler arasında en önemli olan dondurma sıcaklığıdır, sentezlenecek olan kriyojelin özelliklerini doğrudan etkiler. Soğutma hızı ise kriyojeller dondurulurken hızlı soğutma yapılırsa buz kristallerinin büyümesi zorlaşır ve küçük, sayıca çok fazla mikrogözenekli kriyojellerin oluşmasını sağlar. Hızlı soğutma yapılmadığında ise, buz kristallerinin büyümesi için zaman olur ve büyük, sayıca daha az makrogözenekli kriyojellerin oluşumu gerçekleşir. Sonuç olarak, kriyojeller sentezlenirken parametreleri göz önünde bulundurup, kullanım alanına ve amacına göre istenen boyutta ve miktarda gözeneklere sahip kriyojeller ayarlanıp, üretilebilir. Hazırlanan polimer çözeltisi uygun şartlarda ve sıcaklıkta dondurulur. Dondurulmuş sistem en az iki fazdan (çözücü olarak su ve çözücünün yoğunlaştığı sıvı mikrofazdan) oluşur. Ardından, kriyojelasyon (polimerizasyon) başlatılır. Sistem, 17-24 saat arasında inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sırasında jelleşme güçlenerek sıvı yapının içinde katı kristalllerin artmasını ve bu fazın içinde üçboyutlu polimerik bir ağ oluşumunun meydana gelmesini sağlar. 3) Sistemin Erimesi Üçüncü aşama, belirli bir zamanda donmuş durumdaki inkübasyondan sonra jellerin erimesi ve kriyojel oluşumunun tamamlandığı son aşamadır. Sistemin dondurulma aşamasında oluşmuş birbiriyle bağlantılı olan kriyojellerin, en az enerji tüketerek çözücünün oda sıcaklığında kendiliğinden erimesiyle çok sayıda birbiriyle bağlantılı makrogözeneklerin/mikrogözeneklerin de oluştuğu kriyojeller ortaya çıkar. Üç aşamanın sonucunda ise süngerimsi, mekanik olarak dayanaklı ve esnek kriyojeller elde edilir (Hixon ve ark., 2017). 31 Şekil 2. 21. Kriyojel Sentezlenmesi Yapılan literatür taramalarında, Augustine ve ark., genel olarak hidrofobik ilaçların ve özellikle insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfeksiyonunun tedavisinde kullanılan antiretrovirallerin (ARV'ler) oral biyoyararlanımını artırmak için kapsamlı bir şekilde araştırmıştır. Bu çalışmada, birinci basamak proteaz inhibitörü darunavir (D.V) saf nanopartiküllerinden ve bunun artırıcı ajan ritonavir'den (RIT) film kaplı mikropartiküller içinde kapsüllenmiştir. Bunun için, saf D.V ve RIT nanopartiküllerinin klinik olarak ilgili bir kombinasyonu, viskozite stabilizatörü olarak sodyum aljinat kullanan sıralı bir nanopresipitasyon / çözücü difüzyon ve buharlaştırma yöntemi ile sentezlemiştir.Daha sonra saf nanopartiküller, gastrointestinal kanalda farklı çözünürlüğe sahip bir dizi poli (metakrilat) kopolimeri ile film kaplı kalsiyumalginat / kitosan mikropartikülleri içinde kapsüllendi. Bu kaplama, mide benzeri pH altında tam stabilite ve bağırsakta sürekli ilaç salımı sağladı. Sonuç olarak DRV'nin oral biyoyararlanımını önemli ölçüde arttırdığını doğrulamakla kalmayıp, aynı zamanda, nanonizasyonun tek başına oral biyoyararlanımı arttırmak için yeterli olmadığını ortaya çıkarmıştır (Augustine ve ark., 2018). Çetin ve ark., antineoplastik ilaç olan florourasilin in-vitro ortamda salımını incelemek amacıyla, farklı çapraz bağlayıcı oranlarına ve farklı ilaç miktarlarına sahip florourasil baskılanmış kriyojel diskler hazırlamışlardır. Kontrol grubu olarak PHEMA kriyojel 32 diskleri de sentezlenmiştir. İlacın aktivitesini kaybetmeden, kriyojel matrikste homojen bir şekilde dağıtıldığı gözlenmiştir. Farklı özelliklere sahip kriyojel disklerden ilaç salım hızının, çapraz bağlayıcı oranı, ortam pH’ı ve sıcaklığı, ilaç yükleme miktarı ve ilaç polimer etkileşimleri ile değiştiği gözlenmiştir (Çetin, 2013). Yavuz ve ark., çalışmada, bir antibiyotik etken maddesi olan Mupirosin içeren polivinilpirolidon/sodyum karboksimetil selüloz (PVP/NaCMC) mikroküreler hazırlamıştır. Mikroküreler emülsiyon çapraz bağlama yöntemi ile çapraz bağlayıcı FeCl3 kullanılarak sentezlemiştir. Çalışmanın ikinci kısmında en iyi salım profiline sahip mikroküreler kullanılarak PHEMA temelli mikroküre-kriyojel kompozit sistemi disk şeklinde hazırlanmıştır. En iyi Mupirosin salımı, mikroküre-kriyojel kompozit sisteminde bulunmuştur (Yavuz, 2018). Öncel ve ark., çalışmada, kriyojel bazlı implante edilebilir moleküler baskılı ilaç salım sistemleri, antineoplastik ajanın salınması için tasarladılar. Mitomisin C baskılı poli (2- hidroksietil metakrilat-N-metakriloil- L - glutamik asit) kriyojel membranlar, polimerizasyon ile üretilmiştir. Laboratuvar ortamında çapraz bağlayıcı oranının ve kalıp içeriğinin etkilerini incelemek için salım çalışmaları yapılmıştır. Sonuç olarak, kontollü mitomisin C salımı, artan çapraz bağlama maddesi oranı ile azalmış ve kriyojel yapısındaki kalıp miktarı ile artmıştır (Öncel ve ark., 2017). 33 3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR Deneysel çalışmalarda ilk olarak D.V baskılanmış poli(2-hidroksietil metakrilat) (PHEMA) mikrokriyojeller hazırlanmıştır. Sonraki aşamada bu mikrokriyojellerin karakterizasyonu incelenmiştir. Tezin son bölümünde ise ilaç baskılanmış PHEMA mikrokriyojellerden darunavir salımı in vitro sistemde incelenmiştir. Ayrıca darunavir salım kinetiği ve davranışı da bu kısımda tartışılmıştır. 3.1. Kimyasal Malzemeler 2-hidroksetil metakrilat (HEMA), amonyum persülfat (APS), metilen bisakrilamid (MBAAm), N,N,N',N'-tetrametil etilen diamin (TEMED) ve Darunavir (D.V) Sigma Chemical Co.'dan (St. Louis, MO, ABD) temin edilmiştir. N-Metakriloil-(L)-Histidin metil ester (MAH) monomeri NanoReg'den (Ankara, Türkiye) temin edilmiştir. Bu bölümde kullanılan, diğer bütün kimyasallar analitik saflıktadır ve Merck AG (Darmstadt, Almanya) firmasından temin edilmiştir. Deneylerde kullanılan ultra saf su, yüksek akışlı selüloz asetat membran (Barnstead D2731) ile ters ozmoz Barnstead (Dubuque, IA) ROpure LP® birimi ve ardından Barnstead D3804 NANOpure® organik/kolloid uzaklaştırma birimi ve iyon değiştirici dolgulu kolon sistemi kullanılarak saflaştırılmıştır. 3.2. Moleküler Baskılama için Kullanılan Ön-kompleksin Hazırlanması MAH-Cu (II) ön-kompleksin hazırlanmasında, MAH fonksiyonel monomeri sabit tutulup Cu (II) metal iyonları üç farklı molar oranda (1:1, 1:2 ve 1:3) kullanılmıştır. Hazırlanan ön-kompleksler 1:1, 1:2 ve 1:3 olarak elde edilmiştir (kaynak: Cu(NO3)2.5H2O). AAS (Atomik Absorbsiyon Spektrofotometre, AA7000 Shimadzu, Japan) ile deneyler yapılmıştır. Ardından elde edilen her bir ön-kompleks çözeltisine 1.0 mol D.V eklenmiştir. MAH-Cu (II) –D.V karışımı 1.0 mL, 10 mM fosfat tamponu (PBS) (pH 7.4) içerisinde dağıtılmıştır ve daha sonra çözelti, 25°C'de 30 dakika rotatörde karıştırılmıştır (Şekil 3.1.). 3.3. Darunavir Baskılanmış Mikrokriyojellerin Hazırlanması İlk önce bir behere 13 mL HEMA monomeri eklenmiştir. Diğer tarafta ise, deiyonize suda 0.283 g MBAAm çözülmüş ve sonra önceki çözelti ile karıştırılıp toplam su hacmi 12 mL'de sabitlenmiştir. Ardından hazırlanmış olan MAH-Cu(II)–D.V kompleksi bu 34 karışım içerisine eklenerek 10 dakika karıştırılmıştır (Şekil 3.2.a). Son olarak 20 mg APS ve 25 μL TEMED başlatıcı çifti eklenerek karışım 2 dakika karıştırılmıştır. Sonra, 200 μm çapında ve 500 μm kalınlığında mikro kuyucuklara sahip bir mikrostensil kalıba aktarılmıştır (Şekil 3.2.b). Karışım, mikrostensil kalıbının iki cam plaka arasına sıkıştırılmasıyla -14°C'de 24 saat polimerleşmeye bırakılmıştır. Daha sonra, mikrostensil kalıbı liyofilizatöre (Christ Freeze Dryer - Alpha 1–2 LD, ABD) yerleştirilmiştir ve 2 saat -56°C ve 0.0010 mbar'da işleme tabi tutulmuştur (Şekil 3.2.c). Bu süre tamamlandıktan sonra iki cam arasında oluşan D.V baskılanmış (MIP) mikrokriyojeller oda sıcaklığına getirildikten sonra (Şekil 3.2.d) mikrostensil kalıbından toplanmıştır (Şekil 3.2.e). Tepkimeye girmemiş monomerlerin ve diğer artıkların polimerik yapıdan uzaklaştırılması için kriyojeller su ile yıkanmıştır (Şekil 3.2.f). Aynı yöntem D.V baskılanmamış (NIP) mikrokriyojeller için de uygulanmıştır, ancak NIP mikrokriyojelleri hazırlamak için mikrokriyojellerin oluşum sırasında monomer fazına D.V eklenmemiştir. NIP mikrokriyojellerin sentezinde MAH-Cu (II) ön- kompleksi 1:1 mol oranında kullanılmıştır. MIP mikrokriyojellerin hazırlanması prosedüründeki gibi, bir behere 13 mL HEMA ilave edilmiştir ve 0.283 g MBAAm çözülmüş diğer behere ilave edilmiştir. Ardından MAH-Cu (II) ön-kompleksi bu karışıma eklenerek karıştırılmıştır. Son olarak APS, TEMED eklenip, aynı çap ve kalınlığa sahip bir mikrostensil kalıba aktarılmıştır. Ayrıca PHEMA mikrokriyojellerin sentezinde MAH-Cu (II) ve D.V hedef molekülü kullanmadan, 13 mL HEMA monomer olarak ve 0.283 g MBAAm çapraz bağlayıcı olarak, MIP ve NIP mikrokriyojellerin sentezinde kullanılan yöntem ile hazırlanmıştır. Ardından APS, TEMED eklenip aynı çap ve kalınlığa sahip bir mikrostensil kalıba aktarılmıştır. Şekil 3. 1. MAH-Cu (II)- Darunavir Kompleksin Hazırlanması 35 Tez kapsamında farkı oranlarda MAH-Cu (II) ve farklı oranlarda çapraz bağlayıcı içeren MIP mikrokriyojeller sentezlenmiştir. Çapraz bağlayıcı miktarının değişimi mikrokriyojellerde şişme oranı, yüzey alanı ve salım hızını etkileyen parametreler arasında yer almaktadır. Çapraz bağlayıcı olarak kullanılan MBAAm hidrofobik yapıdadır. Mikrokriyojellerde, MBAAm oranın artması ile suyu az seven gruplar polimer yapısında artar. Ayrıca, mikrokriyojellerde çapraz bağlayıcı miktarının artması, çapraz bağ yoğunluğunun artmasına ve bununla birlikte daha sert ve çapraz bağlı polimerlerin oluşumuna neden olur. Şekil 3. 2. Enjekte Edilebilir Mikrokriyojellerin Hazırlanmasının Şematik Gösterimi. 3.4. Mikrokriyojellerin Karakterizasyonu 3.4.1. FTIR Analizi Darunavir baskılanmış (MIP), baskılanmamış (NIP) ve PHEMA mikrokriyojellerin yığın yapısı FTIR (Fourier dönüşümlü kızılötesi spektrumu, FTIR 8000 Series, Shimadzu, Japan) ile incelenmiştir. Analizden önce mikrokriyojeller, -60℃’da 24 saat boyunca liyofilize edilerek kurutulmuştur. Ardından, FTIR spektrumlarının elde edilmesi için 2.0 mg polimer örneği 98 mg KBr ile karıştırılarak havanda dövülmüştür. 36 Daha sonra, hidrolik preste 600 kg/cm2 basınçta ince bir pelet haline getirilmiştir. Hazırlanan numunelerin spektrumları 4600-400 cm-1 dalga sayısı aralığında FTIR cihazında ölçülmüştür. 3.4.2. Yüzey Morfolojisi Enjekte edilebilir mikrokriyojellerin yüzey morfolojileri taramalı elektron mikroskobu (SEM, GAIA3, Tescan, Çek Cumhuriyeti) ile incelenmiştir. SEM analizi öncesinde kurutulmuş enjekte mikrokriyojellerin yüzeyleri altın ile kaplanmış ve farklı büyütmelerle görüntüleri alınmıştır. Bu amaçla, ilk aşamada mikrokriyojeller -50°C’de (0.050 mbar) liyofilize edilmiştir (Christ Alpha 1-2 LD Plus, Almanya). Ardından numuneler vakum altında altın-paladyum (40:60) ile kaplanarak yüzeyleri iletken hale getirilmiştir ve yüzey morfolojisi SEM yuvasına yerleştirilerek farklı büyütme oranlarında incelenmiştir ve görüntüleri alınmıştır. 3.4.3. Şişme Deneyleri Mikrokriyojellerin şişme davranışı hesaplanmadan önce kurutulmuş mikrokriyojeller tartılmış (Wkuru, g) ve oda sıcaklığında 2 saat 10 mL deiyonize suda bekletildikten sonra, filtre kâğıdı ile silinerek tekrar tartılmıştır (Wşişmiş, g). Şişme yüzdesi Eşitlik 1 ile hesaplanmıştır. Şişme % = (Wşişmiş - Wkuru) / Wkuru) (1) 3.4.4. Yüzey Alanı Ölçümleri PHEMA temelli mikrokriyojelin yüzey alanı, çok noktalı analiz ile yüzey alanı ölçüm cihazı (Brunauer-Emmett-Teller (BET)) yöntemine göre ölçülmüştür (Flowsorb II 2300, Micromeritics Instruments Co, Norcross, ABD). 3.5. MIP Mikrokriyojellerden Darunavir Salımının İncelenmesi MIP mikrokriyojeller kurutulduktan sonra D.V salım çalışmaları 3 mL PBS tamponu içerisinde (pH 7.4) 37ºC'de incelenmiştir. Enjekte edilebilir mikrokriyojellerden Cu(II) sızıntısı, bir grafit fırınlı atomik absorpsiyon spektrometresi (Analyst 800 / Perkin- Elmer, Shelton, CT) ile araştırılmıştır. Ortam ve ilaç taşıma davranışı ile ilgili tüm sonuçlar n = 3 için elde edilmiştir ve ortalama değerler ifade edilmiştir. MIP 37 mikrokriyojeller, yüklenen farklı D.V derişimleri için incelenmiştir. D.V derişimi, UV/Vis spektrofotometre (Shimadzu, Model 1601, Tokyo, Japonya) kullanılarak 280 nm'de ölçülmüştür. Ayrıca pH’nın D.V yüzde salımı üzerindeki etkisini göstermek için farklı pH değerlerinde salım incelenmiştir. Farklı oranlarda çapraz bağlayıcı ve monomer oranının etkisini görmek amacıyla üç farklı mol oranında (nHEMA/nMBAAm = 4, 6, 8) mikrokriyojeller hazırlanmıştır. Çapraz bağlayıcı oranı arttıkça salım hızı düşmüştür. Farklı pH’larda salımın etkisini araştırmak için hazırlanan D.V yüklü mikrokriyojellerden 4 farklı pH’da (6.0,7.0, 7.4 ve 8.0’da) ilaç salımı incelenmiştir. 3.6. Sitotoksisite Çalışmaları Sitotoksik etkinin araştırılması için ISO-10993-5 'Tıbbi Cihazların Biyolojik Değerlendirmesi' standartları kullanılarak 3-(4,5-dimetil/tiyazol-2-il) 2,5- difeniltetrazolium bromür tiyazolil mavisi (MTT) testi ile yapılmış ve fibroblast hücre hattı (L929) kullanılmıştır. Hücrelerin kültür ortamı, DMEM içeren 37°C'de %95 hava ve %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde %10 fetal sığır serumu ve %10 L- glutamin ile oluşturulmuş ve 3 gün sürmüştür. Ultraviyole ışık altında 1 saat sterilize edilen mikrokriyojeller 72 saat 37°C'de inkübe edilmiştir. L929 hücrelerinin yoğunlukları 1×103'tür ve bu hücreler 200 μL hacimli 96 oyukta kültürlenmiş ve %5 CO2 ile nemlendirilmiş ortamda gece boyunca inkübe edilmiştir. Hücre kültürü ortamı daha sonra ekstraksiyon ortamı ile değiştirilmiş ve tekrar 37°C'de 24 saat inkübe edilmiştir. Kültürlenmiş hücreler 4 saat boyunca 100 μL/kuyucuk MTT çözeltisi ile muamele edilmiştir. Daha sonra plakalar, oda sıcaklığında 30 dakika karanlık bir yerde inkübe edilmiştir. Son olarak, 540 nm dalga boyu, otomatik bir enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) ile okunmuştur. 38 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA Yazılan tez çalışmasında, HIV tedavisinde antiretroviral ilaç olarak kullanılan darunavir (D.V) ilacının baskılanmış mikrokriyojellerden kontrollü salımı ve salım kinetiğinin incelenmesi araştırılmıştır. Darunavir baskılanmış PHEMA temelli mikrokriyojeller farklı özellikte polimer öncülerinin kullanılması ile değişen gözenekliliğe sahip olacak şekilde sentezlenmiştir ve mikrokriyojellerin hazırlanmasında farklı miktarda darunavir baskılanması gerçekleşmiştir. Ardından, hazırlanan mikrokriyojellerden ilaç salım deneyleri ve sitotoksisitesi incelenmiştir. Deneysel yöntemler üç temel basamakta gerçekleşmiştir. I) D.V baskılanmış ve baskılanmamış PHEMA temelli mikrokriyojellerin (MIP ve NIP mikrokriyojeller) hazırlanması, II) D.V baskılanmış ve baskılanmamış PHEMA temelli mikrokriyojellerin (MIP ve NIP mikrokriyojeller) karakterizasyonu, III) İn vitro koşullarda D.V ilacın salımının incelenmesi. 4.1. MAH-Cu (II) Ön-Kompleksin Hazırlanması İlk önce MAH ve Cu (II) ön-kompleksi hazırlanmıştır. MAH monomeri, metal iyonları üzerinden iyonik koordinasyonla D.V ile etkileşmek üzere metal şelatlayıcı ligand veya komonomer olarak seçilmiştir. MAH’ın imidazol grubu geçiş metal iyonları ile şelat yapma özelliğine sahiptir. Ön-kompleks oranının etkisini incelemek amacıyla MAH ve Cu(II) iyonlarının oranı 1:1, 1:2, 1:3 (mol/mol) olarak değiştirilmiştir. MAH molekülündeki histidin, Cu(II) iyonlarını imidazol azotu, amino azotu ve karboksil oksijen atomu üzerinden üç dişli olarak bağlar. Bakır altı koordinasyon bağı yapabilir. Burada, Cu (II) metal iyonları MAH ile kordinasyonundan sonra sızıntı yapmadığı atomik absorbsiyon deneyleri ile doğrulanmıştır. Diğer bağlar ise ortamdaki su moleküllerinde bulunan oksijen atomları ile tamamlanır. Bu aşamada toplam 0.2 mg bakır tuzu kullanılmıştır [Cu(NO3)2.5H2O]. Ardından, MAH-Cu (II) ön-kompleksi ve D.V birebir oranda hazırlanmış ve mikrokriyojellerin hazırlanması için kullanılmıştır. 4.2. Mikrokriyojellerin Karakterizasyonu FTIR spektrumu, MIP mikrokriyojellerin yapısındaki 1714 cm-1, 1658 cm-1'de amid bantlarını ve ayrıca NIP mikrokriyojellerin yapısındaki 1725 cm-1, 1661 cm-1'de amid 39 bantlarını gösterir (Şekil 4.1.). 3000–2900 cm-1 civarındaki değer aromatik ve alifatik C–H esneme bantlarına karşılık gelir. 3400–3200 cm-1 bölgesinde bulunan geniş bantlar, MIP mikrokriyojeller'deki HEMA temelli mikrokriyojellerin O–H germe bantlarına karşılık gelir. FTIR-ATR spektrumlarında amid bantlarının varlığı, MIP yapısına metal şelatlayıcı monomerlerin dahil edildiğini gösterir. Şekil 4. 1. Darunavir Baskılanmış (MIP), Baskılanmamış (NIP) ve PHEMA Mikrokriyojellerin FTIR Spektrumu. Mikrokriyojellerin gözenek yapısının ve yüzey alanının ilaç salım davranışına etkilerini incelemek üzere mikrokriyojeller üç farklı çapraz bağlayıcı oranında sentezlenmiştir. Bu tez kapsamında hazırlanan mikrokriyojellerin yüzey morfolojisi taramalı elektron mikroskobu ile, yapısal morfolojisi optik mikroskop ile incelenmiştir. Mikrokriyojellerin optik görüntüleri Şekil 4.2’de ve mikrokriyojellerin SEM görüntüleri Şekil 4.3’te verilmiştir. SEM fotoğraflarından da görüldüğü gibi mikrokriyojel polimer yapı içerisinde düzgün ve homojen bir dağılıma mevcuttur. Polimerik yapıdaki makrogözenek boyutlarının 20 µm’den büyük olduğu görülmektedir. Bu makrogözeneklerin dolayısı ile kanalların kriyojel yapıda birbirleriyle bağlantılı olduğu belirlenmiştir. Makrogözenekler şişme ve büzülme süreçleri sırasında mikrokriyojel 1 0 7 1 1 1 4 8 1 2 4 0 1 3 8 4 1 4 5 2 1 6 5 8 1 7 1 4 2 9 5 0 3 3 4 8 MIP 60 80 100 % T 1 0 8 1 1 1 5 1 1 2 5 2 1 3 9 2 1 4 5 0 1 6 6 1 1 7 2 5 2 9 3 4 3 4 0 7 NIP 40 60 80 100 % T 1 0 7 1 1 1 5 41 7 2 3 2 9 4 7 3 3 4 8 HEMA 60 70 80 90 100 110 % T 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 cm-1 40 yapıdan polimerik malzeme içerisine ve dış ortama su difüzyonunu kolaylaştırmaktadır. Makrogözenekli mikrokriyojellerin bu tersinir özellikteki şişme-büzülme davranışı biyomalzeme ve biyoteknoloji uygulamalarında oldukça önemli bir avantaj olarak değerlendirilmektedir. İlaç yükleme oranının şişme davranışı ve yüzey alanına olan etkisi -14oC sıcaklıkta sentezlenen mikrokriyojeller için incelenmiştir. Çizelge 4.1, farklı ilaç yükleme oranlarına sahip mikrokriyojellerin yüzey alanı ve şişme davranışlarını göstermektedir. Darunavir yükleme miktarının artması ile hem şişme oranının hem de yüzey alanının önemli miktarlarda arttığı görülmektedir. Darunavir yükleme miktarının 0.5 mg’dan 1.75 mg’a arttırılması ile şişme oranı % 8.17’ten % 9.88 değerine yükselmiştir. Şişme oranının neredeyse 1.2 kat artışının, yüzey alanı değerlerinin artması ile tutarlı olduğu rapor edilmiştir. 0.5 mg D.V yüklü PHEMA mikrokriyojelin yüzey alanı değeri 11.7 m2/g olarak elde edilirken bu değer 1.75 mg D.V yüklü mikrokriyojeliçin 18.5 m2/g’dır. Yüzey alanındaki artış D.V salım çalışmalarında, salım hızının kontrol edilmesinde ve ayrıca salınan D.V miktarı için önemli bir parametredir. Mikrokriyojellerin yapısal gözeneklerindeki artış bu duruma sebep olmaktadır. Bu artışın sonucunda mikrokriyojellerin yapısına giren su miktarı artar. Şekil 4. 2. Mikrokriyojellerin Optik Görüntüleri 41 Şekil 4. 3. Mikrokriyojellerin SEM Görüntüleri 42 Çizelge 4. 1. Farklı miktarlarda D.V yüklü mikrokriyojellerin şişme davranışı ve yüzey alanına etkisi Yüklenen ilaç miktarı (mg D.V/mg mikrokriyojel) Şişme oranı (%), mg H2O/mg mikrokriyojel Yüzey alanı (m2/g) MIP I 0.5 8.17 14.1 MIP II 1.0 8.65 14.9 MIP III 1.5 9.06 15.3 MIP IV 1.75 9.88 16.1 NIP - 8.01 12.8 PHEMA - 7.65 12.1 Ayrıca tez aşamasında MIP ve NIP mikrokriyojellerin yapısından Cu(II) iyonlarının sızmasını kontrol etmek amacıyla 1.0 mg MIP ve NIP mikrokriyojellerin ayrı ayrı pH 4.5, pH 7.4, pH 8.5’da 24 saat bekletilmiş ve ardından ortamdan alınan çözeltinin metal iyonları derişimi ölçülmüştür. Cu(II) iyonlarının ölçümü atomik absorpsiyon spektrofotometresi ile yapılmıştır. Analizler sonucunda elde edilen raporlarda her bir pH çözeltisinde herhangi bir Cu(II) iyonu tespit edilmemiştir. Sonuçlardan ön-kompleksin kararlı olduğu söylemek mümkündür. Dolaysıyla ilaç salım uygulamalarında Cu(II) iyonlarının mikrokriyojellerin yapısından salımı söz konusu olmayarak herhangi bir toksik etkiye neden olamayacağı açıklanmıştır. 4.3. MIP Mikrokriyojellerden D.V Salım Davranışının İncelenmesi 4.3.1. Farklı Oranlardaki Cu(II) İyonunun Salım Hızına Etkisinin İncelenmesi Hazırlanan mikrokriyojellerden 3 farklı mol oranında MAH-Cu (II) ön-kompleksi içeren ve 3 farklı miktarda darunavir baskılanmış mikrokriyojel seçilerek Cu(II) miktarının artışının darunavir salım hızının üzerindeki etki araştırılmıştır. Bu aşamada MAH fonksiyonel monomerin mol oranı sabit tutularak Cu(II) iyonlarının miktarı sırasıyla MAH-1Cu(II)- D.V, MAH-2Cu(II)- D.V, ve MAH-3Cu(II)- D.V, 1:1, 1:2, ve 1:3 olarak değiştirilmiştir. Farklı oranlarda MAH-Cu(II)- D.V ön-kompleks ile hazırlanan 3 farklı mikrokriyojel ile darunavir salım hızının etkisinin incelenmesinde monomer ve çapraz bağlayıcı oranı 4 olarak sabit tutulmuştur. Ayrıca D.V yükleme miktarı 1.5 mg/mL iken, salımın ortam pH’ı 7.4 tutularak 37°C’de salım 43 gerçekleşmiştir. Şekil 4.4’de salım hızının grafiği verilmiştir. Elde eden sonuçlara göre darunavirin salım hızının 1:1:1 mol oranında daha kontrollü ve %62 olduğundan tez boyunca kullanılacak olan MAH-Cu (II)- D.V mol oranı 1:1:1 olarak seçilmiştir. Şekil 4. 4. Farklı Oranlardaki Cu(II) İyonunun Salım Hızına Etkisi, Salım Ortamı pH’ı: 7.4; T: 37°C 4.3.2. İlaç Yükleme Miktarının İlaç Salım Oranı ve Hızına Etkisinin incelenmesi MIP mikrokriyojellere 0.5-1.75 mg/mL darunavir ilacı yüklenerek farklı D.V baskılanmış mikrokriyojeller hazırlanmıştır. Farklı miktarlarda ilaç yüklenmiş (0.5, 1.0, 1.5, 1.75 mg D.V/mg mikrokriyojel) mikrokriyojellerden D.V salım oranları zamanın fonksiyonu olarak Şekil 4.5’te gösterilmiştir. Şekilden de anlaşıldığı üzere D.V baskılanmış mikrokriyojellerin ilaç miktarının artmasıyla D.V salım oranı artmaktadır. D.V yükleme miktarı 0.5 mg D.V/mg mikrokriyojel olduğunda D.V salım oranı % 25 elde edilmiştir. Bu oran 1.0, 1.5, ve 1.75 mg D.V yüklü mikrokriyojeller için sırasıyla %40, %70, ve %85 olarak elde edilmiştir. Mikrokriyojel yapısındaki ilaç tamamına yakını yapıdan salınması 1.75 mg yüklü mikrokriyojellerde gerçekleşmiştir. İlacın derişim farkı darunavirin mikrokriyojel yapısından dışarıya salması kütle aktarımın sürücü kuvvetidir. Bu yüzden sürücü kuvveti ilacın derişim farkının artması ile orantılıdır. Salınan ilacın miktarı ise bu artışla 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 D V s al ım ( % ) Zaman (saat) 1MAH-1Cu (II)-1D.V 1MAH-2Cu (II)-1D.V 1MAH-3Cu (II)-1D.V 44 artmaktadır. Son olaraktan salım hızını doğrusal olarak etkiler. D.V salım hızı ve miktarı ilaç yükleme oranı ile artmıştır. Başlangıçta hızlı bir salımdan sonra hemen hemen 3’üncü saattten sonra tüm ilaç salım yükleme deneylerinde plato değerine ulaşmış ve sabit kalmıştır. Mikrokriyojellerden D.V salım süresinin 40 saate kadar uzatılabildiği şekilden görünmektedir. Şekil 4. 5. Farklı Oranlarda D.V Yükleme İlaç Salım Hızına Etkisi, Salım Ortamı pH’ı: 7.4; T: 37°C 4.3.3. Farklı Oranlarda Çapraz Bağlayıcının Darunavir Salım Hızına Etkisinin İncelenmesi Farklı oranlarda çapraz bağlayıcı ve monomer oranının etkisini görmek amacıyla 3 farklı mikrokriyel hazırlanmış (4, 6, ve 8 mol oranı) ve bu mikrokriyojeller ile salım deneyi yapılmıştır. Çapraz bağlayıcının etkisi, Şekil 4.6'da gösterilmiştir. Çapraz bağlayıcının miktarı, ilaç salım oranını etkileyen başka bir parametredir. Sabit ilaç miktarında (1.5 mg/mL) mikrokriyojellerden D.V salımı gerçekleşmiştir. Şekilde görüldüğü gibi, D.V'nin kontrollü salımı, MBAAm miktarı, çapraz bağlayıcı yoğunluğu artırılarak (n:4) azalmıştır. Çapraz bağlayıcı yoğunluğundaki artış, mikrokriyojel ağında büzülme ve boşlukların azalması nedeniyle mikrokriyojelin daha sert olmasına neden olur. Polimer matrisindeki çapraz bağlayıcı yoğunluğundaki artışa bağlı olarak MBAAm miktarını artırarak ilacın kümülatif salımının azaldığını gösterir. Çapraz bağlayıcı 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 D V s al ım ( % ) Zaman (saat) 1.75 mg/mL 1.5 mg/mL 1.0 mg/mL 0.5 mg/mL 45 yoğunluğunun artması, polimer ağdaki boşlukların daralması ve azalması nedeniyle mikrokriyojellerin daha sert yapısına yol açar. İlaç salım çalışmalarının geri kalanı için çünkü en kontrollü salım hızı elde edilen n:4 seçilmiştir. Bunun nedeni, çapraz bağlayıcı miktarı arttıkça dondurulmamış alanlarda mikrokriyojelin artan sertliği olabilir. Bu aşamada MAH-Cu(II)-D.V molar oranı 1:1:1 olarak kullanılmış. D.V miktarı 1.5 mg/mL, salım pH: 7.4, salım sıcaklığı 37°C seçilmiştir. Şekil 4. 6. Faklı Oranda Çapraz Bağlıyıcı ve Monomer Oranının Salım Hızına Etkisi, Salım ortamı pH’ı: 7.4; T: 37°C 4.3.4. Ortam pH’nın D.V Salım Hızına Etkisi Ortam pH’ının darunavir salım hızına etkisini incelemek için 6.0, 7.0, 7.4 ve 8.0 olarak farklı ortam pH’larda MIP mikrokriyojellerden darunavir salımı incelenmiştir (Şekil 4.7). Elde edilen sonuçlara göre en fazla ve kontrollü ve yavaş ilaç salımı pH 7.4’de gerçekleşmektedir. Metal şelat sistemlerinde Cu(II) iyonlarının kullanıldığı durumlarda ortam pH’ının asidik olması metal şelatın kararlılığını arttırdığından asidik pH’da D.V salımının daha düşük olması beklenen bir durumdur. Bazik ortamda ise metal iyonları ve ilaç arasındaki etkileşimler daha zayıf olduğu için salım daha hızlı gerçekleşmiştir. Asidik pH değerleri ilaçların yapısını bozma ihtimalini düşünerek tercih edilmemektedir. Dolayısıyla fizyolojik pH olan 7.4 salım çalışmaları için tercih edilmektedir. Farklı pH’larda (pH: 6.0-8.0) salımın etkisini araştırmak için hazırlanan 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 D V s al ım ( % ) Zaman (saat) n:4 n:6 n:8 46 MIP mikrokriyeller (n:4 ve ön-kompleks oranı MAH-Cu(II)- D.V için 1:1:1 seçilerek) ile salım deneyi yapılmıştır. D.V baskılanma miktarı 1.5 mg/mL iken salım deneyleri 37°C sıcaklıkta yapılmıştır. Şekil 4. 7. Ortam pH’nın D.V Salım Hızına Etkisi, Salım Ortamı T: 37°C 4.4. Salım Kinetiğinin İncelemesi Korsmeyer-Peppas modeli, in vitro ilaç salım kinetiğini ve mekanizmasını analiz etmek için seçilmiştir. Mt/M∞=ktn (2), Burada k, Korsmeyer-Peppas sabiti, n ilaç salım mekanizmasındaki difüzyon üssü, Mt, t zamanında D.V salım miktarı, M∞ denge noktasındaki salım ve Mt/M∞ ilaç salım fraksiyonu. Çizelge 4.2'te, R2 korelasyon katsayısı sabitleri ve D.V iletim üssü verileri sunulmuştur. Hesaplamalara göre, MIP mikrokriyojeller korelasyon katsayısı, D.V salımı için en uygun olanıdır. n değerleri açısından, n değeri n = 0.5 ise Fickian difüzyon tercih edilir. Eğer n> 0.5 ise, ne anormal ne de Fickian olmayan difüzyonlar çalışmaktadır. Son olarak, n 1'e eşitse, Fickian olmayan veya durum II kinetiği gözlenir. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 D V % S al ım ( % ) Zaman (saat) pH: 6 pH: 7 pH: 7.4 pH: 8 47 Bu çalışmada, Fickian olmayan difüzyon tipi tüm kriyojel membran türleri için gözlenmiştir. Çizelge 4. 2. Polimer I-V için D.V salım kinetik verileri. Mikrokriyojel Yüklenen ilaç miktarı (mg D.V/mg mikrokriyojel) MAH- Cu(II)-D.V mol oranı Çapraz bağlayıcı/monomer oranı (n) n k R2 MIP I 0.5 1:1:1 4 0.53 0.09 0.98 MIP II 1.0 1:1:1 4 0.41 0.16 0.98 MIP III 1.5 1:1:1 4 0.40 0.25 0.98 MIP IV 1.75 1:1:1 4 0.35 0.39 0.98 4.5. Sitotoksisite Çalışmaları Fare fibroblast hücre hattı L929, MIP, NIP ve PHEMA mikrokriyojellerinin sitotoksisitesinin ölçülmesi için de kullanılmıştır. Uygulamadan sonra, 12 ve 24 saat sonra görüntülerde MIP, NIP ve PHEMA mikrokriyojelleri için hücre çizgilerinin canlılığı gözlenmiştir. 0.5 mg/mL D.V ile yüklenmiş MIP, NIP ve PHEMA mikro kriyojellerin ölçümleri sırasıyla 95.02 ± 0.13, 96.11 ± 0.11 ve 97.02 ± 0.10’dur. Bu sonuçlar, MIP mikrokriyojellerinin sitotoksik olmadığının kanıtı olarak kabul edilebilir. 48 Şekil 4. 8. Farklı miktarlardaki D.V yüklü Mikrokriyojeller İçin Sitotoksite Test Sonuçları Çizelge 4. 3. Sitotoksite çalışmalarından elde edilen % hücre canlılık değerleri. İlaç yükleme miktarı MIP NIP PHEMA MIP I 0.5 mg/mL 96.02±0.26 96.11±0.17 97.02±0.24 MIP II 1.0 mg/mL 96.42±0.21 95.01±0.09 98.04±0.3 MIP III 1.5 mg/mL 94.21±0.11 94.04±0.31 98.58±0.12 MIP IV 1.75 mg/mL 97.01±0.13 96.25±0.15 99.03±0.41 Darunavir, yeni nesil PI grubunun bir bileşeni olarak, HIV/AIDS tedavisinde büyük bir avantajı temsil etmektedir. Bu nedenle, darunavirin tayini için literatürden elde edilen yöntemlerinin araştırması yapılmıştır ve çizelge 4.4.’te gösterilmiştir. 0 20 40 60 80 100 0.5 mg/mL 1.0 mg/mL 1.5 mg/mL 1.75 mg/mL H ü cr e ca n lı lı ğ ı % D.V yükleme miktarı MIP NIP PHEMA 49 Çizelge 4. 4. Darunavirin tayini için kullanılan yöntemler Malzeme Yöntem Referans Impurity-A ve Impurity-B Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) (Reddy ve ark., 2013) Tabletler IR spektroskopi (Kogawa ve ark., 2013) Tabletler Elektroforez (CE) (Kogawa ve ark., 2014) PBMC HPLC (D’Avolio ve ark., 2011) Tabletler Yüksek Performanslı İnce Tabaka Kromatografisi (HPTLC) (Patel ve ark., 2014) Sıçan Serumu ve İdrarı Sıvı Kromatografisi İle Kuadrupol Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi (LC–Q-TOF-MS/MS) (Nageswara Rao ve Guru Prasad, 2014) Mikrokriyojeller Moleküler Baskılama Tekniği Bu çalışma 50 5. YORUM Sunulan tez çalışmasında, darunavir baskılanmış PHEMA temelli mikrokriyojjeller farklı özellikte polimer öncülerinin kullanılması ile değişen gözenekliliğe sahip olacak şekilde sentezlenmiştir ve darunavirin kontrollü salımı ve sitotoksisitesinin incellenmesi için mikrokriyojellerin hazırlanmasında farklı miktarda darunavir baskılanması gerçekleşmiştir. Çalışma sonunda elde edilen önemli sonuçlar özetlenmiştir: İlk aşamada, fonksiyonel monomer olarak kullanılacak amino asit bazlı MAH, önceki çalışmalardaki prosedüre göre sentezlenmiştir. Daha sonra MAH ve Cu (II) metal iyonları ile üç farklı molar oranda bir ön-kompleks oluşturulmuştur. Mikrokriyojellerin hazırlamasında polimerizasyon tekniği kullanılmıştır. Hazırlanma aşamasında, temel monomer olarak HEMA, çapraz bağlayıcı olarak MBAAm ve polimerizasyon başlatıcı olarak APS, katalizör olarak ise TEMED kullanılmıştır. Bu yöntemle PHEMA temelli D.V baskılanmış ve D.V baskılanmamış mikrokriyojeller hazırlanmıştır. İkinci aşamada, mikrokriyojellerin FTIR ile yapı analizi, , taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile yüzey morfolojisi, şişme deneyleri ve yüzey alanı ölçümleri karakterizasyon çalışmaları ile incelenmiştir. FTIR spektrumu incelendiğinde, MIP’nin yapısındaki 1714 cm-1, 1658 cm-1'de amid bantlarını ve ayrıca NIP’nin yapısındaki 1725 cm-1, 1661 cm-1'de amid bantlarını gösterir. 3000–2900 cm-1 civarındaki değeri aromatik ve alifatik C–H esneme bantlarına karşılık gelir. 3400–3200 cm-1 bölgesinde bulunan geniş bantlar, MIP'deki HEMA'nın O–H germe bantlarına karşılık gelir. FTIR-ATR spektrumlarında amid bantlarının varlığı, MIP yapısına metal şelatlayıcı monomerlerin dahil edildiğini ayrıca kompleksin başarıyla sentezlendiğini göstermektedir. Hazırlanan mikrokriyojellerin yüzey morfolojisi taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve yapısal morfolojisi mikroskop ile incelenmiştir. SEM sonuçlarına göre mikrokriyojellerin, polimerik yapıdaki makrogözenek boyutlarının 20 µm’den büyük olduğu bulunmuştur. Bu makrogözeneklerin dolayısı ile kanalların kriyojel yapıda birbirleriyle bağlantılı olduğu belirlenmiştir. Farklı ilaç yükleme oranlarına sahip mikrokriyojellerin yüzey alanı ve şişme davranışlarını göstermektedir. Darunavir yükleme miktarının artması ile hem şişme 51 oranının hem de yüzey alanının önemli miktarlarda arttığı görülmüştür. . Bu artışın sonucunda mikrokriyojellerin yapısına giren su miktarı da artmıştır. MIP ve NIP mikrokriyojellerin yapısından Cu (II) iyonların sızmasını kontrol edildi, Analizler sonucundan elde edilen raporlarda her bir pH çözeltisinde herhangi bir Cu (II) iyonu tespit edilmemiştir ve ön-kompleksin kararlı olduğu ayrıca ilaç salım uygulamalarında Cu (II) iyonlarının mikrokriyojellerin yapısından salımı söz konusu olmayarak herhangi bir toksik etkiye neden olamayacağı açıklanmıştır. Üçüncü aşamada farklı oranlardaki, Cu(II) iyonunun, ilaç yükleme miktarının, çapraz bağlayıcının ve ortam pH’nın D.V salım hızına etkisi in vitro salım deney çalışmaları ile incelenmiştir. MAH fonksiyonel monomerin mol oranı sabit tutularak Cu(II) iyonlarının miktarı sırasıyla MAH-1Cu(II)-D.V, MAH-2Cu(II)-D.V, ve MAH-3Cu(II)-D.V, 1:1, 1:2, ve 1:3 olarak değiştirildi. Elde eden sonuçlardan dolayı darunavırın salım hızının 1:1:1 mol oranında daha kontrollü ve %62 olduğundan tez boyunca kullanılacak olan MAH- Cu(II)-D.V mol oranı 1:1:1 olarak seçilmiştir. PHEMA mikrokriyojellere 0.5-1.75 mg/mL darunavir ilacı yüklenerek farklı D.V baskılanmış mikrokriyojeller hazırlanmıştır. D.V baskılanmış mikrokriyojellerin ilaç miktarının artmasıyla D.V salım oranı artmaktadır. D.V yükleme miktarı 0.5 mg D.V/mg mikrokriyojel olduğunda D.V salım oranı % 25 elde edilmiştir. Bu oran 1.0, 1.5, ve 1.75 mg D.V yüklü mikrokriyojeller için %40, %70, ve %85, sırasıyla elde edilmiştir. Farklı oranlarda çapraz bağlayıcı ve monomer oranının etkisini görmek amacıyla molce üç farklı oranda MBAAm (nHEMA/nMBAAm = 4, 6, 8) mikrokriyojeller hazırlandı. D.V'nin kontrollü salınımı, MBAAm miktarı, çapraz bağlayıcı yoğunluğu artırılarak azalmıştır. İlaç salım çalışmalarının geri kalanı için n:4 seçildi çünkü en yavaş ve kontrollü salım hızı bu oranda elde edildi. Ortam pH’ının darunavir salım hızına etkisini incelemek için 6.0, 7.0, 7.4 ve 8.0 olarak farklı ortam pH’larda MIP mikrokriyojellerden darunavir salımı incelenmiştir. sonuçlara göre en fazla ve kontrolü ve yavaş miktarda ilaç salımı pH 7.4’de gerçekleşmektedir. Mikrokriyojellerden D.V salım kinetiği incelendiğinde, yapıdaki D.V yükleme miktarı azaldıkça ilaç difüzyonunun Fickian olmayan difüzyon gösterdiği bulunmuştur. 52 Son aşama, sitotoksisite çalışmalarında mikrokriyojellerin Fare fibroblast hücre hattı L929 üzerinde sitotoksik etkisi olmadığı gözlenmiştir. Uygulamadan sonra, D.V miktarının artması ile birlikte 12 ve 24 saat sonra görüntülerde MIP, NIP ve PHEMA mikrokriyojelleri için hücre çizgilerinin canlılığı gözlemlenmiştir.Artış gösteren hücre canlılığı değerlerine bakılarak,biyouyumluluğun oldukça yüksek olmasından söz edilebilir. 53 6. KAYNAKLAR Arshady, R., Mosbach, K., 1981. Synthesis of Substrate-selective Polymers by Host- Guest Polymerizatioa 692, 687–692. Aslıyüce Çoban, S., Protein A Baskılanmış Süpermakrogözenekli Poli (Hidroksietil- Metakrilat) Kriyojeller, Yüksek Lisans Tezi, Hacettepe Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara, 2015. Augustine, R., Levin, D., Sverdlov, R., Zlobin, V., Shofti, R., Sosnik, A., 2018. Acta Biomaterialia Nanoparticle-in-microparticle oral drug delivery system of a clinically relevant darunavir / ritonavir antiretroviral combination. Acta Biomater. 74, 344–359. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2018.04.045 Babac, C., Yavuz, H., Galaev, I.Y., Pişkin, E., Denizli, A., 2006. Binding of antibodies to concanavalin A-modified monolithic cryogel. React. Funct. Polym. 66, 1263– 1271. https://doi.org/10.1016/j.reactfunctpolym.2006.03.007 Bajpai, A.K., Shukla, S.K., Bhanu, S., Kankane, S., 2008. Responsive polymers in controlled drug delivery. Prog. Polym. Sci. 33, 1088–1118. https://doi.org/10.1016/j.progpolymsci.2008.07.005 Bakhshpour M., Aslıyüce S., Idil N., Mattiasson B., Denizli A., 2021. Molecular Imprinted Nanocomposites for Green Chemistry. In: Thomas S., Balakrishnan P. (eds) Green Composites. Materials Horizons: From Nature to Nanomaterials. Springer, Singapore Bakhshpour, M., Bereli, N., Şenel, S., 2014. Preparation and characterization of thiophilic cryogels with 2-mercapto ethanol as the ligand for IgG purification. Colloids Surfaces B Biointerfaces 113, 261–268. https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2013.09.018 Bakhshpour, M., Derazshamshir, A., Bereli, N., Elkak, A., Denizli, A., 2016. [PHEMA/PEI]-Cu(II) based immobilized metal affinity chromatography cryogels: Application on the separation of IgG from human plasma. Mater. Sci. Eng. C 61, 824–831. https://doi.org/10.1016/j.msec.2016.01.005 Bakhshpour, M., Göktürk, I., Bereli, N., Denizli, A., 2020a. Molecularly imprinted cryogel cartridges for the selective recognition of tyrosine. Biotechnol. Prog. 36. https://doi.org/10.1002/btpr.3006 Bakhshpour, M., Idil, N., Perçin, I., Denizli, A., 2019b. Biomedical applications of polymeric cryogels. Appl. Sci. 9. https://doi.org/10.3390/app9030553 Bakhshpour, M., Topcu, A.A., Bereli, N., Alkan, H., Denizli, A., 2020b. Poly(Hydroxyethyl methacrylate) immunoaffinity cryogel column for the purification of human immunoglobulin M. Gels 6. https://doi.org/10.3390/gels6010004 Bakhshpour, M., Yavuz, H., Denizli, A., 2018. Controlled release of mitomycin C from PHEMAH – Cu ( II ) cryogel membranes. Artif. Cells, Nanomedicine, Biotechnol. 46, S946–S954. https://doi.org/10.1080/21691401.2018.1439840 Baydemir, G., Bereli, N., Andaç, M., Say, R., Galaev, I.Y., Denizli, A., 2009. Supermacroporous poly(hydroxyethyl methacrylate) based cryogel with 54 embedded bilirubin imprinted particles. React. Funct. Polym. 69, 36–42. https://doi.org/10.1016/j.reactfunctpolym.2008.10.007 Bereli, N., Yavuz, H., Denizli, A., 2020. Protein chromatography by molecular imprinted cryogels. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 43, 1–14. https://doi.org/10.1080/10826076.2020.1780606 Byrne, M.E., Salian, V., 2008. Molecular imprinting within hydrogels II: Progress and analysis of the field. Int. J. Pharm. 364, 188–212. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2008.09.002 Caro, E., Masqué, N., Marcé, R.M.