T. C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ PANKREAS KANSERİNDE NEKTİN AİLESİ MOLEKÜLLERİ İLE NK HÜCRE FONKSİYONLARI ARASINDAKİ İLİŞKİ Uzm. Biol. Rukiye ABANOZ Tümör Biyolojisi ve İmmünolojisi YÜKSEK LİSANS TEZİ ANKARA 2025 T. C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ PANKREAS KANSERİNDE NEKTİN AİLESİ MOLEKÜLLERİ İLE NK HÜCRE FONKSİYONLARI ARASINDAKİ İLİŞKİ Uzm. Biol. Rukiye ABANOZ Tümör Biyolojisi ve İmmünolojisi YÜKSEK LİSANS TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Füsun ÖZMEN ANKARA 2025 iii T. C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Pankreas Kanserinde Nektin Ailesi Molekülleri ile NK Hücre Fonksiyonları Arasındaki İlişki Öğrenci: Rukiye Abanoz Danışman: Prof. Dr. Füsun ÖZMEN Bu tez çalışması 06.01.2025 tarihinde jürimiz tarafından “Tümör Biyolojisi ve İmmünolojisi Programı”nda yüksek lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Jüri Başkanı: Prof. Dr. Bilkay Baştürk Başkent Üniversitesi Tez Danışmanı: Prof. Dr. Füsun Özmen Hacettepe Üniversitesi Üye: Prof. Dr. Ayşen Özcan Hacettepe Üniversitesi Üye: Doç. Dr. Begüm Kocatürk Hacettepe Üniversitesi Üye: Dr. Öğr. Üyesi Göksemin Fatma Şengül Ankara Medipol Üniversitesi Bu tez Hacettepe Üniversitesi Lisansüstü Eğitim-Öğretim ve Sınav Yönetmeliğinin ilgili maddeleri uyarınca yukarıdaki jüri tarafından uygun bulunmuştur. 21 Ocak 2025 Prof. Dr. Müge Yemişçi Özkan Enstitü Müdürü iv YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI Enstitü tarafından onaylanan lisansüstü tezimin/raporumun tamamını veya herhangi bir kısmını, basılı (kağıt) ve elektronik formatta arşivleme ve aşağıda verilen koşullarla kullanıma açma iznini Hacettepe Üniversitesine verdiğimi bildiririm. Bu izinle Üniversiteye verilen kullanım hakları dışındaki tüm fikri mülkiyet haklarım bende kalacak, tezimin tamamının ya da bir bölümünün gelecekteki çalışmalarda (makale, kitap, lisans ve patent vb.) kullanım hakları bana ait olacaktır. Tezin kendi orijinal çalışmam olduğunu, başkalarının haklarını ihlal etmediğimi ve tezimin tek yetkili sahibi olduğumu beyan ve taahhüt ederim. Tezimde yer alan telif hakkı bulunan ve sahiplerinden yazılı izin alınarak kullanılması zorunlu metinlerin yazılı izin alınarak kullandığımı ve istenildiğinde suretlerini Üniversiteye teslim etmeyi taahhüt ederim. Yükseköğretim Kurulu tarafından yayınlanan “Lisansüstü Tezlerin Elektronik Ortamda Toplanması, Düzenlenmesi ve Erişime Açılmasına İlişkin Yönerge” kapsamında tezim aşağıda belirtilen koşullar haricince YÖK Ulusal Tez Merkezi / H.Ü. Kütüphaneleri Açık Erişim Sisteminde erişime açılır. o Enstitü / Fakülte yönetim kurulu kararı ile tezimin erişime açılması mezuniyet tarihimden itibaren 2 yıl ertelenmiştir. (1) o Enstitü / Fakülte yönetim kurulunun gerekçeli kararı ile tezimin erişime açılması mezuniyet tarihimden itibaren ... ay ertelenmiştir. (2) o Tezimle ilgili gizlilik kararı verilmiştir. (3) 06/01/2025 Rukiye ABANOZ 1“Lisansüstü Tezlerin Elektronik Ortamda Toplanması, Düzenlenmesi ve Erişime Açılmasına İlişkin Yönerge” (1) Madde 6. 1. Lisansüstü tezle ilgili patent başvurusu yapılması veya patent alma sürecinin devam etmesi durumunda, tez danışmanının önerisi ve enstitü anabilim dalının uygun görüşü üzerine enstitü veya fakülte yönetim kurulu iki yıl süre ile tezin erişime açılmasının ertelenmesine karar verebilir. (2) Madde 6. 2. Yeni teknik, materyal ve metotların kullanıldığı, henüz makaleye dönüşmemiş veya patent gibi yöntemlerle korunmamış ve internetten paylaşılması durumunda 3. şahıslara veya kurumlara haksız kazanç imkanı oluşturabilecek bilgi ve bulguları içeren tezler hakkında tez danışmanının önerisi ve enstitü anabilim dalının uygun görüşü üzerine enstitü veya fakülte yönetim kurulunun gerekçeli kararı ile altı ayı aşmamak üzere tezin erişime açılması engellenebilir. (3) Madde 7. 1. Ulusal çıkarları veya güvenliği ilgilendiren, emniyet, istihbarat, savunma ve güvenlik, sağlık vb. konulara ilişkin lisansüstü tezlerle ilgili gizlilik kararı, tezin yapıldığı kurum tarafından verilir *. Kurum ve kuruluşlarla yapılan işbirliği protokolü çerçevesinde hazırlanan lisansüstü tezlere ilişkin gizlilik kararı ise, ilgili kurum ve kuruluşun önerisi ile enstitü veya fakültenin uygun görüşü üzerine üniversite yönetim kurulu tarafından verilir. Gizlilik kararı verilen tezler Yükseköğretim Kuruluna bildirilir. * Tez danışmanının önerisi ve enstitü anabilim dalının uygun görüşü üzerine enstitü veya fakülte yönetim kurulu tarafından karar verilir. v ETİK BEYAN Bu çalışmadaki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, kullandığım verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı, yararlandığım kaynaklara bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu, tezimin kaynak gösterilen durumlar dışında özgün olduğunu, Prof. Dr. Füsun Özmen danışmanlığında tarafımdan üretildiğini ve Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tez Yazım Yönergesine göre yazıldığını beyan ederim. Uzm. Biol. Rukiye ABANOZ vi TEŞEKKÜR Bana inanarak her zaman ve her şekilde destekleyerek bilgeliği ve merhametiyle tanıştığıma ve öğrencisi olduğuma minnettar olduğum değerli tez danışmanım Prof. Dr. Füsun Özmen’e bana bu fırsatı tanıdığı için teşekkür ederim. Kendisi ile çalışmış olma deneyimini yaşamak, gelecekte benim için dünyadaki olumsuzluklara karşı her zaman bir umut olacaktır. Enerjisi, kararlılığı ve güçlü duruşu ile bana ilham veren, bilgisini paylaşmaktan ve bana her durumda yardımcı olmaktan asla çekinmeyen sevgili Doç. Dr. Begüm Kocatürk’e teşekkür ederim. Bana laboratuvarda yolumu gösteren ve yardımını hiçbir zaman esirgemeyen Melek Günindi Korkut'a harika bir ekip arkadaşı olduğu için, Mualla İlknur Gündüz'e yüksek lisansımın ilk gününden beri yanımda olup beni desteklediği için çok teşekkür ederim. Yüksek lisans süresince engin bilgisiyle tüm sorularıma cevap veren, beni aydınlatan Dr. Nil Kılıç’a teşekkür ederim. Ayrıca Temel Onkoloji Anabilim Dalı hocaları, doktora ve yüksek lisans öğrencilerine de teşekkür ederim. Sevgili annem Nuriye Abanoz ve babam Mustafa Abanoz'a her zaman benim arkamda oldukları için, özlemime katlandıkları için ve onlara yaşattığım tüm zorluklara rağmen beni sevmeye devam edip destekledikleri için teşekkür ederim. Biricik ablama, kız kardeşime aramızdaki mesafelerin yükünü benimle paylaştığı için teşekkür ederim. Sevgili Ayşe Katı'ya her birinin bende yeri ayrı olan yeğenlerim Talha, Burak ve Hifa'nın anneleri olduğu ve beni teyze olmanın mutluluğu ile tanıştırdığı için minnettarım. Arkadaşlığı benim için paha biçilemez olan Nihan Kabalak'a kendisi olduğu için teşekkür ederim. Müthiş bir karaktere sahip olduğu ve bunca yıl yanımda olup yaşadığım en büyük zorluklarda bile tereddüt etmeden beni desteklediği için çok şanslı hissediyorum. Tüm süreçte benimle birlikte olan, bana sonsuz desteğini gösteren ve hiçbir zaman yorulmadan yanımda olup her kararımda destekçim olan Furkan Öçsoy'a çok teşekkür ederim. Varlığından her zaman güç aldım. Onsuz başaramazdım. vii ÖZET Abanoz, R. Pankreas Kanserinde Nektin Ailesi Molekülleri ile NK Hücre Fonksiyonları Arasındaki İlişki, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tümör Biyolojisi ve İmmünolojisi Programı Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2025. Pankreas kanseri, geç tanı ve sınırlı tedavi seçenekleri nedeniyle en öldürücü kanser türlerinden biridir. Bu kanserde tümör mikroçevresi, immün hücreler ve stromal yapıların karmaşık bir bileşiminden oluşarak hem tümör gelişimini hem de immün sistemin savunma mekanizmalarını etkiler. Doğal öldürücü (NK) hücreleri, özellikle sitotoksik aktiviteleriyle tümör hücrelerine karşı savunmada önemli bir rol oynar. Ancak pankreas kanserinin immün baskılayıcı mikroçevresi, NK hücrelerinin işlevselliğini kısıtlayabilir. Bu nedenle, NK hücrelerinin tümörle etkileşimlerinin anlaşılması, yeni tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Bu çalışmada, NK-92 hücreleri ile pankreas kanseri hücre hattı BxPC-3'ün etkileşimi altı günlük bir ko-kültür modelinde incelenmiştir. Ko-kültür sürecinde, Nektin ailesi ve PVR moleküllerinin gen ekspresyon seviyeleri ile NK hücre reseptörleri (DNAM-1 TIGIT, PVRIG ve CD96) ve sitotoksisite molekülleri (CD107a, Perforin, Granzim B) incelenmiştir. DNAM-1 ailesi reseptörleri ve ligandlarının ko-kültür sırasında ilk 36 saat ve sonrasında farklı davranışlar sergilediği gözlemlenmiştir. Aktivasyon reseptörü DNAM-1’in ekspresyonu, ilk beş gün boyunca artarken, inhibitör reseptörler TIGIT ve CD96’nın ekspresyonları 36. saatten itibaren azalmıştır. PVRIG ekspresyonu ise zamanla azalış göstermiştir. Ko-kültür boyunca NK hücrelerinin sitotoksisitesi 72. saate kadar yüksek iken ardından düşüşe geçmiştir. Bu değişimler, NK hücre yüzey reseptörlerinin ve kanser hücrelerindeki ligandların ekspresyonları arasındaki korelasyonlarla ilişkilendirilmiştir. Çalışmamız, DNAM-1 ailesi reseptörlerinin ve ligandlarının kompleks bir etkileşim içinde olduğunu ve NK hücre fonksiyonlarının bu ilişkilere bağlı olarak düzenlendiğini göstermektedir. Sonuç olarak, DNAM-1 TIGIT ve CD96 reseptörlerinin ortak ligandı olan PVR molekülünün NK hücre fonksiyonlarının düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı tespit edilmiştir. Bu bulgularla, pankreas kanserine yönelik NK hücre bazlı terapiler için yeni hedeflerin belirlenmesine katkı sağlamak amaçlanmaktadır. Anahtar Kelimeler: NK Hücresi, Pankreas Kanseri, DNAM-1 Ailesi, Nektin Ailesi PVR viii ABSTRACT Abanoz, R. The Relationship Between Nectin Family Molecules and NK Cell Functions in Pancreatic Cancer, Hacettepe University Graduate School of Health Sciences, Tumor Biology and Immunology Program Master Thesis, Ankara, 2025. Pancreatic cancer is one of the most lethal cancers due to late diagnosis and limited treatment options. In this cancer, the tumor microenvironment consists of a complex combination of immune cells and stromal structures, affecting both tumor development and immune defense mechanisms. Natural killer (NK) cells play an important role in the defense against tumor cells, especially through their cytotoxic activity. However, the immunosuppressive microenvironment of pancreatic cancer may limit the functionality of NK cells. Therefore, understanding the interactions of NK cells with tumors is critical for the development of novel therapeutic approaches. In this study, the interaction of NK-92 cells and pancreatic cancer cell line BxPC-3 was examined in a six-day co-culture model. During the co-culture process, gene expression levels of Nectin family and PVR molecules, NK cell receptors (DNAM-1 TIGIT, PVRIG and CD96) and cytotoxicity molecules (CD107a, Perforin, Granzyme B) were analyzed. It was observed that DNAM-1 family receptors and ligands exhibited different behaviors during the first 36 hours and beyond during co-culture. The expression of the activation receptor DNAM-1 increased during the first five days, while the expression of the inhibitory receptors TIGIT and CD96 decreased after 36 hours. PVRIG expression decreased over time. The cytotoxicity of NK cells during co-culture was high until 72 hours and then decreased. These changes were associated with correlations between the expression of NK cell surface receptors and ligands on cancer cells. Our study demonstrates that DNAM-1 family receptors and ligands interact in a complex manner and that NK cell functions are regulated depending on these relationships. In conclusion, the PVR molecule, a common ligand of DNAM-1 TIGIT and CD96 receptors, was found to play an important role in the regulation of NK cell functions. With these findings, we aim to contribute to the identification of new targets for NK cell-based therapies for pancreatic cancer. Keywords: NK Cell, Pancreatic Cancer, DNAM-1 Family, Nectin Family, PVR ix İÇİNDEKİLER ONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER ve KISALTMALAR xii ŞEKİLLER xiv TABLOLAR xvii 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1 Pankreas Kanseri 3 2.3 Pankreas Kanserine İmmünoterapötik Yaklaşım 4 2.3. Pankreas Kanseri İmmün Mikroçevresi 6 2.3.1. T Hücreleri 8 2.3.2. Makrofajlar 8 2.3.3. Dendritik Hücreler 8 2.3.4. MDSC 9 2.4 Doğal Öldürücü Hücreler (NK) 9 2.4.1 NK Hücre Sitotoksisitesi 12 2.4.2 NK Hücrelerinde Bulunan İnhibitör ve Aktivatör Reseptörler 13 2.5 DNAM-1 Ailesi 14 2.5.1 DNAM-1 (CD226) 16 2.5.2 TIGIT 17 2.5.3 PVRIG (CD112R) 19 2.5.4 CD96 (TACTILE) 20 2.6 DNAM-1 Ailesi Ligandları 21 2.6.1 Nektin-1 23 2.6.2 Nektin-2 24 2.6.3 Nektin-3 25 2.6.4 Nektin-4 26 x 2.6.5 PVR 27 3. GEREÇ VE YÖNTEM 29 3.1 Materyaller 29 3.1.1 Kullanılan Hücre Hatları 29 3.1.2 Kullanılan Kimyasallar 29 3.1.3 Kullanılan Sarf malzemeler 29 3.1.4 Kullanılan Kit ve Antikorlar 30 3.1.5 Kullanılan Cihazlar 30 3.2 Yöntem 30 3.2.1 Çalışmada Kullanılan Çözeltiler 32 3.2.2 In vitro Deneyler 32 3.2.3 Hücre Sayımı 34 3.2.4 NK-92 Hücreleri ile Kanser Hücrelerinin Ko-kültürü 34 3.2.5 Kullanılan Hücre Sayısının Optimizasyonu 36 3.2.6 Hücrelerin Yüzey Boyaması 38 3.2.7 Yüzey Reseptörlerinin Ölçümü 38 3.2.8 Kapılama Stratejisi 38 3.2.9 Sitotoksisite Deneyi 39 3.2.10. Sitotoksisite Ölçümü 41 3.2.11. Kapılama Stratejisi 41 3.2.12 Ko-kültüre Alınmış Hücrelerden RNA İzolasyonu 42 3.2.14. RNA Konsantrasyon Tayini 43 3.2.15. RT-PCR 43 3.2.16. Primer Dizileri 44 3.2.17. qPCR ile Gen Ekspresyonu Değerlendirilmesi 44 3.2.18. Mikoplazma Testi 46 3.3. Biyoinformatik Analiz 47 3.4 İstatistiksel Analiz 47 4. BULGULAR 48 4.1. Ön Çalışma Bulguları 48 4.1.1 Pankreas Kanserinde NK Hücre İnfiltrasyonu 48 4.1.2 Pankreas Kanseri Hücrelerinde Nektin ve PVR Moleküllerinin Ekspresyon Düzeyleri 48 4.1.3. Pankreas Kanserinde Nektin ve PVR Moleküllerinin Sağkalıma Etkisi 49 xi 4.1.4. Deneylerde Kullanılacak Hücre Hattının Belirlenmesi 51 4.2. In vitro Deney Bulguları 51 4.2.1 Hücre Morfolojileri 51 4.2.2. NK Hücre Reseptörlerinin Ekspresyon Analizleri 53 4.2.3 Ko-kültür Boyunca NK-92 Hücrelerindeki DNAM-1 Ailesi Reseptörleri Arasındaki Korelasyon 57 4.2.4 NK-92 Hücre Sitotoksisite Analizleri 58 4.2.5 Ko-kültür Sonrası NK-92 Hücrelerindeki DNAM-1 Ailesi Reseptörleri ve Sitotoksisite Moleküleri Arasındaki Korelasyon 61 4.2.6 BxPC-3 Hücre Ligandlarının Ekspresyon Analizleri 66 4.2.7 Ko-kültür Boyunca BxPC-3 Hücrelerindeki Ligandlar Arasındaki Korelasyon 71 4.2.8. Ko-kültür Boyunca BxPC-3 Hücrelerindeki Nektin Ailesi ve PVR Ligandlarının NK-92 Hücrelerindeki DNAM-1 Ailesi ile Arasındaki Korelasyon 72 4.2.9. Ko-kültür Sonrası BxPC-3 Hücrelerindeki Nektin Ailesi ve PVR Ligandlarının NK-92 Sitotoksisite Moleküleri Arasındaki Korelasyon 77 5. TARTIŞMA 80 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 86 7. KAYNAKLAR 88 8. EKLER 102 EK 1. Tez Çalışması Orijinallik Raporu 102 EK 2. Dijital Makbuz 103 9. ÖZGEÇMİŞ 104 xii SİMGELER ve KISALTMALAR NK Doğal öldürücü PC Pankreas kanseri PDAK Pankreas duktal adenokarsinomu PanNET Pankreatik nöroendokrin tümör Ig İmmünoglobulin IgSF İmmünoglobulin süper ailesi PanIN Pankreatik intraepitelyal neoplazi IPMN İntraduktal papiller müsinöz neoplazm ICI İmmün kontrol noktası inhibitörleri CAR-NK Kimerik antijen reseptörü taşıyan NK MDSC Miyeloid türevli baskılayıcı hücreler DNAM-1 DNAX aksesuar molekülü-1 TIGIT Ig ve ITIM bölgelerine sahip T hücresi immünoreseptörü PVRIG Poliovirüs reseptörü ile ilişkili immünoglobulin bölgesi içeren protein PVR Poliovirüs Receptorü CCLE Kanser hücre hattı ansikopedisi CXCR3 C-X-C motifli kemokin reseptörü 3 NKG2D Doğal katil grup 2, üye D IFN-γ İnterferon γ TNF-α Tümör nekroz faktörü α IDO İndolamin 2,3-dioksijenaz MICA MHC sınıf I polipeptit ilişkili sekans A PGE2 Prostaglandin E2; HCC Hepatoselüler karsinom CIS Sitokin ile indüklenebilir SH2-kontaing protein TGF-β Dönüştürücü büyüme faktörü-β HMGB1 Yüksek hareketlilik grubu kutusu 1 HIF-1α Hipoksi ile indüklenebilir faktör-1α 27-HC 27-hidroksikolesterol GM2 β-N-asetilhekzosaminidaz TCR T hücre reseptörü xiii TCGA Kanser Genom Atlası Programı MFI Ortalama florasan yoğunluğu xiv ŞEKİLLER Şekil Sayfa 2.1. Pankreas duktal adenokarsinoma gelişimi (9) 3 2.2. NK hücreleri ve hücre dışı matriks arasındaki karmaşık etkileşim (51) 10 2.3. NK hücrelerinin tümör mikroçevresindeki diğer immün hücreler ile etkileşimi (64) 12 2.4 DNAM-1 ailesi reseptörlerinin Nektin ve Nektin benzeri moleküllerle karmaşık etkileşimi (75) 15 2.5. Nektinler, Necls ve Afadinin moleküler yapıları ve etkileşim şekilleri (102) 22 3.1. İş akış şeması 31 3.2. Hedef:Efektör oranlarının değişimi üzerine ko-kültürün 144. saatinde sırasıyla DNAM-1, TIGIT ve PVRIG ekspresyonlarını gösteren histogram grafikleri 36 3.3. Ko-kültürün 144. saatinde BxPC-3 hücrelerindeki Nektin ailesi ve PVR molekül ekspresyonları 37 3.4. NK-92 hücrelerinin yüzey reseptör kapılama stratejisi 38 3.5. NK-92 hücrelerinde CD107a, Perforin ve Granzim B için kapılama stratejisi 41 4.1. Pankreas kanserinde NK hücre infiltrasyonu 48 4.2. Nektin ailesi ve PVR moleküllerinin tüm hücre hatlarında birbirleri ile olan korelasyonu 49 4.3. a) Nektin-1, b) Nektin-2, c) Nektin-3, d) Nektin-4, d) PVR moleküllerinin tümöre infiltre olan NK hücre yoğunluğuna bağlı sağkalım grafikleri 50 4.4. 55 hücre hattına göre BxPC-3 hücre hattındaki Nektin ailesi ve PVR ekspresyon profili 51 4.5 a)Süspanse karakterdeki ko-kültüre alınmamış NK-92 hücreleri (4X Büyütme) b)Adherent karakterdeki ko-kültüre alınmamış BxPC-3 hücreleri (20X Büyütme) 52 4.6. Ko-kültüre alınmış NK-92 ve BxPC-3 hücreleri (4X Büyütme) 52 4.7. NK-92 hücrelerinde hücrelerde eksprese olan DNAM-1 ailesi reseptörleri 53 4.8. DNAM-1 ekspresyonunun zamana bağlı histogram(a) ve keman(b) grafikleri 54 4.9. TIGIT ekspresyonunun zamana bağlı histogram histogram(a) xv ve keman(b) grafikleri 55 4.10. PVRIG ekspresyonunun zamana bağlı histogram histogram(a) ve keman(b) grafikleri 56 4.11. CD96 ekspresyonunun zamana bağlı histogram histogram(a) ve keman(b) grafikleri 57 4.12. NK-92 hücrelerindeki DNAM-1 ailesi reseptörlerinin ko-kültür süresi boyunca ekspresyon düzeylerinin birbirleri ile korelasyonları 58 4.13. Ko-kültür boyunca analiz edilen NK-92 hücrelerinin CD107a ekspresyon düzeyleri 59 4.14. Ko-kültür boyunca analiz edilen NK-92 hücrelerinin Perforin ekspresyon düzeyleri 60 4.15. Ko-kültür boyunca analiz edilen NK-92 hücrelerinin Granzim B ekspresyon düzeyleri 61 4.16. Ko-kültürün ilk 36 saatinde NK-92 hücrelerindeki DNAM-1 ailesi reseptörleri ile sitotoksisite ilişkili moleküllerin korelasyonları 62 4.17. Ko-kültürün 36 ve 144. saatleri boyunca NK-92 hücrelerindeki DNAM-1 ailesi reseptörleri ve sitotoksisite ile ilişkili moleküllerin korelasyonları 63 4.18. Ko-kültür boyunca DNAM-1 reseptör ekspresyonunun sitotoksisite ile ilişkisi 64 4.19. Ko-kültür boyunca TIGIT reseptör ekspresyonunun sitotoksisite ile ilişkisi 64 4.20. Ko-kültür boyunca PVRIG reseptör ekspresyonunun sitotoksisite ile ilişkisi 65 4.21. Ko-kültür boyunca CD96 reseptör ekspresyonunun sitotoksisite ile ilişkisi 65 4.22. BxPC-3 hücrelerindeki Nektin ailesi ve PVR ligandlarının ekspresyon oranları 66 4.23. Nektin-1 ligandının zamana bağlı gen ekspresyon grafiği 67 4.24. Nektin-2 ligandının zamana bağlı gen ekspresyon grafiği 68 4.25. Nektin-3 ligandının zamana bağlı gen ekspresyon grafiği 69 4.26. Nektin-4 ligandının zamana bağlı gen ekspresyon grafiği 70 4.27. PVR ligandının zamana bağlı gen ekspresyon grafiği 71 4.28. BxPC-3 hücrelerindeki Nektin ailesi ve PVR ligandlarının ko-kültür süresi boyunca birbirleri ile olan korelasyonları 72 4.29. Ko-kültürün ilk 36 saati boyunca BxPC-3 hücrelerindeki Nektin ailesi ile xvi PVR ligandlarının DNAM-1 ailesi reseptörleri ile korelasyonları 73 4.30. Ko-kültürün 36. saat ve 144. saati arasında BxPC-3 hücrelerindeki Nektin ailesi ile PVR ligandlarının DNAM-1 ailesi reseptörleri ile korelasyonları 74 4.31. Ko-kültür boyunca DNAM-1 ekspresyonunun ligandları Nektin-2 ve PVR ile olan ilişkisi 75 4.32 Ko-kültür boyunca TIGIT ekspresyonunun ligandları Nektin-2, Nektin-3, Nektin-4 ve PVR ile olan ilişkisi 75 4.33. Ko-kültür boyunca PVRIG ekspresyonunun ligandı Nektin-2 ile olan ilişkisi 76 4.34. Ko-kültür boyunca CD96 ekspresyonunun ligandları Nektin-1 ve PVR ile olan ilişkisi 76 4.35. Ko-kültürün ilk 36 saati boyunca BxPC-3 hücrelerindeki Nektin ailesi ile PVR ligandlarının sitotoksisite ile ilişkili moleküllerle korelasyonları 78 4.36. Ko-kültürün 36. saat ve 144. saati arasında BxPC-3 hücrelerindeki Nektin ailesi ile PVR ligandlarının sitotoksisite ile ilişkili moleküllerle korelasyonları 79 xvii TABLOLAR Tablo Sayfa 3.1. cDNA sentezi reaksiyon karışımı 43 3.2. Primer dizileri 44 3.3. Nektin-2 hariç primerler için RT-PCR reaksiyon karışımı 45 3.4. Nektin-2 primeri için RT-PCR reaksiyon karışımı 45 1 1. GİRİŞ Pankreas kanseri, günümüzde en öldürücü kanser türlerinden biri olarak kabul edilmekte olup, genellikle geç dönemde tanı konulması ve sınırlı tedavi seçenekleri nedeniyle kötü prognoza sahip bir hastalıktır. Pankreas kanserindeki tümör mikroçevresi immün hücreler, stromal hücreler ve matriks komponentlerinden oluşan kompleks bir ortama sahiptir. Bu mikroçevre, hem tümör progresyonunu hem de immün sistemin tümörü hedefleme yeteneğini belirlemede kritik bir öneme sahiptir. Doğal öldürücü (NK) hücreleri, immün sistemin tümöre karşı savunmasında önemli bir yer tutar. Bu hücreler, özellikle sitotoksik aktivite ve sitokin salınımı yoluyla tümör hücrelerini hedeflemektedir. Bununla birlikte, pankreas kanserinin immün baskılayıcı mikroçevresi, diğer sitotoksik hücrelerin ve NK hücrelerinin fonksiyonunu olumsuz etkileyerek çalışmalarını engelleyebilmektedir. NK hücrelerinin tümör mikroçevresiyle olan etkileşimlerini anlamak, yeni terapötik yaklaşımlar geliştirilmesi için önemlidir. NK-92 hücreleri, bir Non-Hodgkin lenfoma hastasından izole edilmiş olup, NK hücrelerinin önemli bir modeli olarak kullanılmaktadır (1). NK-92 hücreleri, doğal NK hücrelerinin sitotoksik aktivitelerini taşımaktadır ve laboratuvar ortamında daha uzun süre çoğaltılabilmesi, genetik olarak kolayca manipüle edilebilmesi ve kontrollü şekilde tümör hedefleme yeteneğinin artırılabilmesi gibi avantajlara sahiptir. Pankreas kanseri çalışmalarında NK-92 hücreleri hem temel bilim araştırmalarında hem de potansiyel terapötik uygulamalarda çok yönlü bir model olarak öne çıkmaktadır. Özellikle pankreas tümörü mikroçevresinde NK-92 hücrelerinin aktivasyon profili ve tümörün bu hücrelere verdiği yanıt, tümörün immün baskılayıcı stratejilerini anlamak açısından önemlidir. DNAM-1 (DNAX aksesuar molekülü-1) ailesi, TIGIT, DNAM-1, CD96 ve PVRIG reseptörlerini içeren bir immünoglobulin süper ailesi (IgSF) grubudur. NK hücrelerinin etkili bir sitotoksik yanıt oluşturmasında kilit bir rol oynamaktadırlar. 2 DNAM-1, tümör hücreleri ve viral enfekte hücrelerde bulunan ligandlarını tanıyarak NK hücrelerinin aktivasyonunu destekler. Bu reseptör, NK hücrelerinin hedef hücrelere bağlanmasını ve granül salınımı yoluyla sitotoksik etkilerini gerçekleştirmesini kolaylaştırır. DNAM-1, bağışıklık sistemini destekleyen uyarıcı bir reseptör olarak görev yaparken, TIGIT ve PVRIG bağışıklık yanıtını baskılayan inhibe edici reseptörlerdir. CD96 ise NK hücrelerinde adezyon ve sitotoksisiteye aracı olan bir rol oynamaktadır (2, 3). Özellikle pankreas kanseri gibi immün baskılayıcı mikroçevrelerde, DNAM-1 aracılı yanıtın desteklenmesi NK hücre bazlı terapilerde yeni hedef potansiyelleri oluşturabilir. Pankreas kanseri hücre hattı olan BxPC-3 hücreleri (4) ile ko-kültüre edilen NK-92 hücrelerinin sitotoksik aktivitesi, DNAM-1 ailesi aktivatör ve inhibitör reseptörleri ile kanser hücrelerindeki ligandlar arasındaki etkileşimlerden etkilenmektedir. Özellikle DNAM-1’in ekspresyonunun desteklenmesi, NK-92 hücrelerinin pankreas kanseri hücrelerine karşı anti-tümör yanıtını artırabilir. Çalışmamızda, NK-92 hücrelerinin BxPC-3 hücreleri ile birlikte kültür edildiğindeki anti-tümör yanıtını ve kanser hücrelerinin immün kaçışta rol oynayan ilgili ligandlarının arasındaki ilişkiyi araştırmayı amaçladık. NK hücreleri üzerindeki önemli aktivatör reseptörlerden olan DNAM-1’in ve inhibitör reseptörler olan TIGIT PVRIG ve CD96’nın NK hücre sitotoksisitesi ile arasındaki ilişkiyi ve kanser hücrelerindeki ligandlarının NK hücre fonksiyonuna gösterdiği etkiyi incelemeyi hedefledik. Bu amaç ile NK-92 hücreleri ile BxPC-3 hücreleri altı gün boyunca ko-kültüre alınmıştır. Ko-kültür boyunca periyodik aralıklarla NK-92 hücreleri üzerindeki DNAM-1 ailesi ekspresyonları incelenmiş, NK hücrelerinin fonksiyonunun ölçülmesi amacı ile CD107a, Perforin ve Granzim B moleküllerinin ekspresyon seviyeleri analiz edilmiştir. Ayrıca ko-kültür boyunca NK hücreleri ile etkileşime girmiş olan BxPC-3 hücrelerindeki Nektin ailesi ve PVR ligandlarının gen ekspresyon seviyeleri de incelenmiştir. 3 2. GENEL BİLGİLER 2.1 Pankreas Kanseri Pankreas kanseri oldukça agresif bir hastalıktır ve en ölümcül malignitelerden biri olarak kabul edilmektedir. Kötü prognozu ile dünya genelindeki tüm kansere bağlı ölümlerin yaklaşık %5'ini oluşturmaktadır (5). Pankreas kanseri için risk faktörleri genel olarak üç kategoriye ayrılmaktadır: bireysel özellikler, yaşam tarzı ile çevre ve hastalık durumu. Bireysel özelliklerle ilgili faktörler arasında yaş, cinsiyet, ırk, aile öyküsü ve genetik mutasyonlar bulunmaktadır. Yaşam tarzı ve çevresel riskler arasında diyet, eser elementlere maruz kalma, sigara, alkol tüketimi, fiziksel aktivite ve obezite yer almaktadır. Hastalıkla ilgili faktörler ise kronik pankreatit, diyabet ve enfeksiyonlar gibi durumları içerir (6). Pankreas kanserlerinin yaklaşık %90'ı pankreas duktal adenokarsinomu (PDAK) olarak ortaya çıkmaktadır ve 5 yıllık genel sağkalım oranı %10 civarındadır (7). Genellikle PDAK'ın bu yüksek ölüm oranın en önemli sebebi, hastalığın ilerleyip uzak metastaz yaptıktan sonra tespit edilmesidir. Hastaların %80'i, günümüzde etkili bir tedavi seçeneğinin bulunmadığı ileri evrelerde tanı almaktadır (8). Şekil 2.1. Pankreas duktal adenokarsinoma gelişimi (9) Pankreatik duktal adenokarsinom, pankreasın ekzokrin dokusundan oluşmaktadır. Asiner ve duktal hücrelerin her ikisinde de onkojenik mutasyonların 4 kazanılması ve/veya tümör baskılayıcı işlevin kaybı, bu hücrelerin pankreatik duktal adenokarsinom için köken hücre olma potansiyeline yol açmaktadır. PDAK’ın iki öncü lezyonu bulunur. Bunlar, pankreatik intraepitelyal neoplazi (PanIN'ler) ve intraduktal papiller müsinöz neoplazmlar (IPMN'ler) olarak adlandırılan kistik lezyonlardır. Her iki öncü lezyonda da KRAS geninde aktive edici mutasyonlar gözlenmektedir. KRAS mutasyonlarına ek olarak, G-proteini alfa alt birimi Gαs'ı (GNAS) kodlayan gendeki aktive edici mutasyonlar ve tümör baskılayıcı genlerden biri olan RING tipi E3 ubikitin ligazın (RNF43) işlev kaybı özellikle IPMN'lerle ilişkilendirilmiştir. Bu öncü lezyonlar düşük dereceliden yüksek dereceli lezyonlara ilerledikçe tümör baskılayıcı genler CDKN2A veya SWI/SNF kromatin yeniden şekillendirme komplekslerinin bileşenlerinde kayıplar meydana gelir. Ayrıca, tümör baskılayıcı genlerden SMAD4 ve TP53’ün delesyonları ya da inaktive edici mutasyonları, prekürsör lezyonların PDAK’a dönüşüm sürecine eşlik etmektedir (10- 16). 2.3 Pankreas Kanserine İmmünoterapötik Yaklaşım Günümüze dek immünostimülatör sitokinler, onkolitik virüsler, adoptif hücre transferi ve tümör hedefleyici (bi-spesifik) antikorlar gibi çeşitli immünoterapi yöntemleri geliştirilmiştir ve bunların hepsi hali hazırda bulunan immün sisteminin anti-neoplastik etkisini artırmayı hedeflemektedir (17). Tüm immünoterapiler arasında, immün kontrol noktası inhibitörleri (ICI) olarak da bilinen kanser veya immün hücreler üzerindeki immünosupresif sinyalleri inhibe eden monoklonal antikorlar (mAb'ler), solid tümörlerde birden fazla FDA onayı almıştır. Günümüzdeki klinik uygulamalarda sıkça kullanılmakta olan bu tedavi yöntemi çeşitli hastalıklarda umut verici sonuçlar göstermiştir (18). Bunun yanında mevcut ICI'ların terapötik etkinliği sınırlıdır ve potansiyel olarak etkili karsinomlarda yanıt oranları %20-40 oranındadır (19). İmmün kontrol noktası inhibitörlerine yanıtla ilişkilendirilen önemli bir faktör, tümör mutasyon yüküdür. PDAK’ta genel olarak az sıklıkla yüksek mutasyon yükü görülmektedir. Dolayısı ile bu, PDAK’ta ICI kullanımını sınırlandırmaktadır (18). 5 ICI kullanımının sınırlı olmasının yanında PDAK tümör hücrelerinin, tümör sağkalımını, proliferasyonunu ve metastazını artırmak için tümör mikroçevresini (TME) şekillendiren adaptif yanıtlar ile birlikte desmoplastik bir stroma ile çevrili olduğu da bilinmektedir. Ayrıca, karsinomla ilişkili fibroblastlar, immünosupresif miyeloid hücreler veya düzenleyici T hücreler gibi hücreler arasındaki iletişim, immün yanıtı etkili bir şekilde susturma kapasitesine sahiptir ve bu da tedavi direncine katkıda bulunmaktadır. PDAK'ın tümör mikroçevresindeki bu hücre tipleri üzerine yapılan araştırmalar, PDAK'taki tedavi yaklaşımlarının etkisizliğine işaret etmektedir. Diğer kanser türlerinde elde edilen başarılı sonuçların yanında şimdiye dek immün kontrol noktası inhibitörlerinin, eşzamanlı kemoterapi verilip verilmemesinden bağımsız olarak, ileri evre pankreas kanseri hastalarıyla yapılan çalışmalarda dikkat çekici bir etkisi olduğu kanıtlanamamıştır. Çalışmalarda bildirilen sağkalım genellikle bir kemoterapötik olan Gemsitabin’in tek başına kullanımından daha iyi sonuç vermemiştir. İmmün kontrol noktası olan ve tedavilerde sıkça hedeflenen PD-L1’in yüksek mikrosatellit instabilitesi ve yüksek tümör mutasyon yükü ile diğer kanserlerde önemli klinik yanıta sahip olsa da ilerlemiş PDAK'da nadiren eksprese olduğundan dolayı pankreas kanserindeki başarısı düşüktür (20). CAR-NK hücrelerinin solid tümörlerdeki aktivitesini sınırlayan en büyük engellerden biri, tümörün immünosupresif mikroçevresidir. Bu nedenle, solid tümör tedavisinde maksimum etkinlik sağlamak için CAR-NK tasarımlarının tümör mikroçevresini aşabilen veya iyileştirebilen stratejilerle geliştirilmesi gerekmektedir (21, 22). Bu bilgiler doğrultusunda, çeşitli CAR-NK tedavileri için klinik çalışmalar başlatılmıştır. Zhejiang Üniversitesi’nde yürütülmesi planlanan bir çalışmada, pankreas kanserinin tedavisinde endoskopik ultrason ile yönlendirilen intratümöral NKG2D CAR-NK hücre enjeksiyonunun uygulanabilirliği ve anti-tümör etkinliği değerlendirilecektir. Tek merkezli, tek kollu ve doz-eskalasyonlu olarak tasarlanan bu klinik araştırmada, tedavinin ilk gününde endoskopik ultrason rehberliğinde intratümöral CAR-NK enjeksiyonu yapılması, 4. ve 5. günlerde ise intravenöz CAR- 6 NK infüzyonlarının kombine bir şekilde uygulanması planlanmıştır. Aynı araştırma grubunun başka bir çalışmasında ise, hastaların her kemoterapi döngüsünden sonra, kemoterapinin kesilmesini takiben 2. ve 3. günlerde iki intravenöz CAR-NK infüzyonu alması öngörülmüştür. Bu çalışmanın amacı, NKG2D CAR-NK tedavisinin maksimum tolere edilen dozunu ve tedaviyle ilişkili yan etkileri belirlemektir (23, 24). Birbirinden farklı klinik araştırmalarda pankreas kanseri hastalarına intraperitoneal olarak TROP2 CAR-NK uygulaması (25), malign kanser dokularında immüno-histokimya ile tespit edilen ROBO1 ekspresyonu olanlarda ROBO1 spesifik BiCAR-NK uygulaması (26), MUC1 ekspresyonu olanlarda ise MUC1 spesifik CAR-pNK uygulamaları planlanmaktadır (27). Bu yöntemler, pankreas kanserine özel olarak belirlenen hedefler üzerinden ilerleyerek tedavi sürecinin tümöre spesifik olmasını ve dolayısıyla başarısını artırmayı hedeflemektedir. İmmünoterapilerde bu moleküllerin yanında alternatif ya da daha etkili hedef olabilecek diğer kontrol noktası moleküllerinin belirlenmesi veya kombine tedavi olarak kullanılması, kanser prognozunu iyileştirme açısından büyük önem taşımaktadır. 2.3. Pankreas Kanseri İmmün Mikroçevresi Pankreatik duktal karsinom, immünojenitesi son derece düşük olan tümörlerden biridir (28). Kanser hücrelerini çevreleyen mikroçevre, tümör büyümesi ve metastatik potansiyelin yanında PDAK'taki tedavi direncinin de önemli bir nedenidir (29). Pankreas kanserindeki primer tümör bölgelerinde desmoplazi olarak adlandırılan ve PDAK patolojisinde sıkça gözlenen yaygın bir fibrozis bulunmaktadır. Desmoplazinin klinik belirtileri, hücre dışı matriks proteinlerinin yüksek ekspresyonu ve fibroblastik tip hücrelerin miyofibroblastik fenotipe dönüşümü şeklindedir (30). Tümör mikroçevresindeki tümörle ilişkili hücreler, interlökinden (IL) IL-6, IL- 10, dönüştürücü büyüme faktörü-β (TGF-β), prostaglandin E2 (PGE2) ve idolamin 7 2,3-dioksijenaz (IDO) gibi NK hücre aktivasyonunu doğrudan veya dolaylı olarak önleyen faktörler üretmektedir (31, 32). TGFβ, fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2) ve bağ dokusu büyüme faktörü (CTGF) gibi belirli moleküllerin salgılanması, pankreas kanseri mikroçevresindeki desmoplaziyi teşvik edebilir. Bu faktörlerden TGFβ, kanserdeki dual yapısı ile dikkat çekicidir. Pankreatik intraepitelyal neoplazm-1 (PanIN-1) ve PanIN-2 sırasında neoplastik hücre büyümesini önleyebilirken, SMAD4’ün kaybı ve TGFβ yolunun kanonik kolu sebebi ile PanIN-3 sırasındaki büyümeyi teşvik edebilmekte ve ayrıca RAS-RAF-ERK yolağı ile çeşitli şekillerde etkileşime girmektedir (33-35). Birincil tümör odakları, hücre dışı matris proteinlerinin (laminin, kolajen ve fibronektin gibi) yüksek ekspresyonu ve fibroblastik hücrelerin aktivasyonu ile karakterize geniş fibrozis göstermektedir. Pankreatik tümör mikroçevresinde hem kanser hem de stromal olmak üzere çok sayıda hücre tipi bulunmaktadır; bunlar arasında pankreatik stellat hücreler, miyeloid türevli baskılayıcı hücreler (MDSC'ler) tümörle ilişkili makrofajlar ve düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) yer almaktadır. PDAK ile ilişkili yoğun fibrozis hem pankreas kanseri hem de stellat hücreleri tarafından anti- anjiyojenik faktörlerin (endostatin ve anjiyostatin gibi) salgılanmasıyla daha da kötüleşen PDAK'ın karakteristik bir özelliği olan tümör hipoksisine neden olmaktadır. Hipoksik bir tümör mikroçevresinin gelişimi, kanserin agresifliği ve ilerlemesinin yanı sıra kemoterapi direnciyle de ilişkilendirilmiştir. Pankreas kanserinin sahip olduğu desmoplazi, anti-anjiyojenik faktörlerin işlevlerini artırarak hipoksik bir mikroçevre oluşturabilmektedir. Yetersiz damarlanmanın neden olduğu hipoksi, metabolik yeniden programlama, apoptozun inhibisyonu, sürekli proliferasyon, tedavi direnci, invazyon ve metastaz dahil olmak üzere pankreas kanserinin agresifliğine çeşitli şekillerde katkıda bulunmaktadır. Kemoterapötiklere karşı direnç geliştirmenin yanı sıra, pankreatik tümör mikroçevresi yüksek oranda immünosupresiftir ve bu da immün aracılı kanser gözetiminin etkinliğini sınırlamaktadır (36-38). Tüm bu nedenlerden dolayı pankreas kanseri, çok sayıda güçlü baskılayıcı bağışıklık hücresi ve anti-tümör özelliklere sahip lenfositlerin sınırlı sayıdaki 8 infiltrasyonu ile karakterize edilen karmaşık ve heterojen bir immün mikroçevre oluşturacak şekilde gelişmektedir (39). 2.3.1. T Hücreleri PDAK hastalarından rezeke edilen dokularda T hücre infiltrasyonu gözlemlenmiştir ve bu durum, tümöre infiltre olan CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin anti- tümör potansiyelini işaret ederek pankreas kanserinde iyi bir prognoz ile ilişkilendirilmiştir (40). Bununla birlikte, PDAK ilerledikçe tümöre infiltre olan CD8+ T hücrelerinin sayısında azalma, CD4+ T hücre alt kümesindeki Treg yüzdesinde ise artış gözlenmektedir (41). Böylece, ilerleyen PDAK'ın immünojenitesi azalır ve anti- tümör yanıtı giderek zayıflar. 2.3.2. Makrofajlar Makrofajlar pankreas duktal adenokarsinomunda en çok bulunan immün hücreleri oluşturmaktadır (42). Makrofajlar, akut ve kronik enflamasyonda kritik bir role sahiptir. Normal koşullarda yaralanma veya enfeksiyon bölgelerindeki kalıntıları temizlemekle görevli olan makrofajlar, aynı zamanda B ve T gibi diğer immün hücrelerine antijen sunarak adaptif bağışıklık yanıtını başlatabilir. Bu hücreler, M1 ve M2 olarak adlandırılan iki farklı fenotipe farklılaşabilmektedir. M1 makrofajlar, pro- inflamatuar sitokinlerden biri olan TNF-α’yı üretirken, anti-inflamatuar fenotipteki M2 makrofajlar, immünosupresif bir sitokin olan IL-10’u salgılamaktadır (39). 2.3.3. Dendritik Hücreler Dendritik hücreler, naif ve hafıza T hücresi yanıtlarını etkinleştirmede son derece etkili olan güçlü antijen sunan hücrelerdir. Tümör kontrolünde karmaşık bir rol üstlenirler; CD4+ ve CD8+ T hücrelerini aktive etmenin yanı sıra, tümör immün gözetiminde NK hücreleriyle karşılıklı etkileşim kurabilir ve tümör hücrelerini doğrudan öldürme kapasitesine sahip olabilmektedirler (43, 44). 9 2.3.4. MDSC Miyeloid türevli baskılayıcı hücreler, olgunlaşmamış monositleri granülositleri ve dendritik hücreleri içeren heterojen bir immünosupresif hücre popülasyonudur. Bu hücreler, hem CD4+ hem de CD8+ T hücrelerinin çoğalmasını engellemekte, apoptozu indüklemekte ve düzenleyici CD4+ T hücrelerini (Treg) ortama çekmek amacıyla yüksek miktarda immünosupresif sitokinlerden olan IL-10 ve TGF-β salgılamaktadır. Bunun yanında, NK ve NKT hücrelerinin tümöre infiltrasyonunu azaltmada önemli bir role sahiptirler (45). 2.4 Doğal Öldürücü Hücreler (NK) Doğal öldürücü (Natural killer) hücreler, hem doğrudan kanser veya enfekte hücreleri öldürerek hem de dolaylı olarak antikorlar ve T hücrelerinin aracılık ettiği yanıtları geliştirerek güçlü anti-tümör ve anti-viral yanıtlara aracılık edebilen doğuştan gelen bağışıklığın temel unsurlarıdır. NK hücresi aracılı sitotoksisite ve sitokin salınımı, doğuştan gelen diğer immün hücrelerinin (dendritik hücreler, makrofajlar ve nötrofiller) aktivitesini etkilemekte ve NK hücrelerine, antijene özgü ve HLA kısıtlamalı T ve B hücre yanıtlarını şekillendirme yeteneği kazandırarak düzenleyici bir rol üstlenmelerini sağlamaktadır. NK hücrelerinin, sitotoksik T hücrelerinden farklı olarak, efektör işlevlerini yerine getirebilmek için önceden antijene maruz kalmalarının gerekmediği bilinmektedir. Bununla birlikte son araştırmalar, NK hücrelerinin tam efektör potansiyellerine ulaşabilmesi için çözünebilen faktörler gibi çeşitli uyaranlar tarafından aktive edilmeye ihtiyaç duyduğunu ortaya koymuştur (46). Sitotoksik CD8+ T lenfositleri (CTL) ile birlikte NK hücreleri, dönüştürülmüş hücrelerin lizisini spesifik olarak indükleme kapasiteleri sayesinde kanser gelişimine karşı kritik bir rol oynamaktadır. Ancak NK hücreleri, antijene özgü T hücresi reseptörü ifade etmeyen doğuştan gelen lenfositlerdir ve CTL ile CD4+ yardımcı T hücrelerinin işlevlerine paralel olarak tanımlanan beş prototipik alt gruptan oluşan doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC'ler) arasında yer alır. İşlevsel özellikleri ve gelişimsel yörüngelerine göre NK hücreleri, ILC1 ile birlikte grup 1 ILC'lere dahil 10 edilir. NK hücreleri ve ILC1, interferon (IFN)-γ üretme kapasitelerinin yanı sıra ILC1’in gelişiminde gerekli olan transkripsiyon faktörü T-bet'in ekspresyonunda ortak özellikler taşır. Ancak, dokuda yerleşik ILC1 hücrelerinden farklı olarak NK hücreleri sitokin üretimine ek olarak sitotoksik bir işlev üstlenen dolaşımdaki hücrelerdir. Sitoplazmik granüllerinde depoladıkları Perforin ve Granzim B'yi hedef hücrelere salarak virüsle enfekte olmuş veya dönüştürülmüş hücrelerde apoptoz indüklemektedirler (47-50). NK hücrelerinin hücre dışı matriksteki komşu hücrelere, moleküllere ve metabolitlere maruz kalması gelişimlerini, olgunlaşmalarını, aktivasyonlarını ve işlevlerini etkiler (Şekil 2.2). Şekil 2.2. NK hücreleri ve hücre dışı matriks arasındaki karmaşık etkileşim (51) 11 NK hücreleri insanlarda dolaşımdaki lenfositlerin %5-20'sini temsil etmektedir (52). İnsan NK hücreleri, NK, T, B ve diğer lenfoid hücrelerin ortak öncüleri olan CD34+ hematopoetik kök hücrelerden (HSC'ler) türetilen ortak lenfoid progenitör (CLP) hücrelerden gelişir (53, 54). CD122 (IL-2Rβ/IL-15R) ifadesi, NK hücrelerine farklılaşmaya başlayan CLP'leri işaret etmektedir (55). Nöral hücre adezyon molekülünün (CD56) ortaya çıkması ise olgun olmayan NK hücrelerinin olgun NK hücrelerine geçişini göstermektedir (56). CD56bright ekspresyonunun CD56dim'e dönüşmesi ve NK hücrelerinin bir alt kümesinde immünoglobulin süper ailesi üyesi olan CD16'nın (FcγRIII) ekspresyonu, NK hücrelerinin olgunlaşma sürecini tamamlar. CD16, IgG1 ve IgG3 antikorlarının Fc bölgesini bağlayabilen bir transmembran reseptörüdür ve bu özellik, NK hücrelerinin immünoglobulin işaretli hücreleri öldürmelerini sağlamaktadır (57). CD56'nın ifade düzeyleri, insan NK hücrelerinin işlevsel sınıflandırılmasını sağlar. Periferik kandaki insan NK hücrelerinin çoğu CD56'sızdır. (58). NK hücrelerinin olgunlaşması sırasındaki CD56'nın aşağı regülasyonu, CD56bright NK hücreleri güçlü inflamatuar sitokin üreticileri olduğundan anti-tümör sitotoksisitesinin kazanılmasıyla güçlü bir şekilde ilişkilidir. Bunun yanında, insan NK hücrelerinin sitolitik işlevi esas olarak CD56dim popülasyonunda bulunmaktadır (59). NK hücreleri hedef hücrelerle, hedef hücrenin yüzeyindeki ilgili ligandlara bağlanan aktive edici ve inhibe edici reseptörler aracılığıyla etkileşime girer. Bu ligand-reseptör etkileşimlerinin dengesine bağlı olarak, NK hücresi hedef hücreyi ortadan kaldırıp kaldırmayacağını belirler (60). CD56dim NK hücrelerinin granülleri, CD56bright NK hücrelerine kıyasla daha etkili sitoliz sağlayan çok daha fazla Perforin ve Granzim A içermektedir. Her iki NK hücre alt kümesinin sitolitik özellikleriyle ilgili belirgin farklılıklara ek olarak, TNF-α ve IFN-γ üretimi açısından da net bir ayrım bulunmaktadır. CD56bright NK hücreleri bu sitokinleri üretmede daha etkili olan hücrelerdir (59). 12 NK hücre sayısının hastalıklarda prognostik açıdan önem taşıdığı bulunmuştur. Hoshikawa ve ark. rezekte edilebilen PDAK hastalarından (evre Ib-III) alınan periferik kan mononükleer hücrelerinin hem ameliyat öncesi hem de sonrası akım sitometri analizi yoluyla, periferik kandaki NK hücrelerinin yüzdesi ile nükssüz sağkalım arasında pozitif bir korelasyon olduğunu ve yüksek NK seviyeleri olan hastaların daha geç hastalık nüksü gösterdiğini bulmuşlardır (61). 2000 yılında Japon genel popülasyonunda yapılan 11 yıllık bir takip çalışması, periferik NK hücrelerinin yüksek sitotoksik aktivitesinin kanser riskinin azalmasıyla pozitif ilişkili olduğunu ve bunun tersinin de geçerli olduğunu göstererek, tümörlere karşı doğal bağışıklık tepkisinin belirli bir önemi olduğunu ortaya koymuştur (62). 2.4.1 NK Hücre Sitotoksisitesi NK hücresi üzerindeki aktivatör - inhibitör reseptörler ve hedef hücreler arasındaki ilk etkileşimlerin ardından NK hücresine iletilen sinyallerin dengesi hücrenin aktivasyon durumunu belirler. Aktivasyon gerçekleşirse, NK hücresi hedef hücre ile immünolojik bir sinaps oluşturur. Bu sinaps, hücreler arasında kararlı bir yapışma sağlarken, sitotoksik granüllerin polarizasyonunu ve sonunda hedef hücrenin lizisini kolaylaştırmaktadır (63). Şekil 2.3. NK hücrelerinin tümör mikroçevresindeki diğer immün hücreler ile etkileşimi (64) 13 NK hücreleri, tümör hücrelerini doğrudan öldürme kapasitesine sahip olduğu gibi T hücrelerinin anti-tümör aktivitesini de destekler. NK hücreleri, IFN-γ salgılayarak tümör hücrelerinde insan lökosit antijeni (HLA) sınıf I ekspresyonunu artırır ve tümör antijenlerinin T hücrelerine sunumunu güçlendirir. Bu şekilde, NK hücreleri hücre reseptörleri (TCR) ile transdüklenmiş T hücrelerin, tümör infiltre eden lenfositlerin ve immün kontrol noktası inhibitörü tedavilerinin etkinliğini artırabilir. Ayrıca NK hücreleri, CC-kemokin ligand 5 (CCL5), XC-kemokin ligand 1 (XCL1) ve FMS-ilişkili tirozin kinaz 3 ligand (FLT3L) aracılığıyla dendritik hücrelerin tümör mikroçevresine toplanmasını ve olgunlaşmasını teşvik eder (65, 66). DC'ler, membrana bağlı IL-15 (mbIL-15) ve 4-1BBL ekspresyonu yoluyla NK ve T hücrelerini uyarır. Tümör hücrelerinin parçalanması sonucu açığa çıkan kanser antijenleri, DC'ler tarafından sunularak spesifik T hücresi proliferasyonunu destekler. Ayrıca NK hücreleri, MDSC'leri öldürerek kimerik antijen reseptörlü T hücreler dahil anti-tümör T hücreleri üzerindeki baskıyı hafifletmektedir (64) (Şekil 2.3). 2.4.2 NK Hücrelerinde Bulunan İnhibitör ve Aktivatör Reseptörler NK hücreleri somatik olarak yeniden düzenlenmiş antijen reseptörlerini değil, rastgele bir kombinasyonla aktive edici ve inhibe edici reseptörleri ifade etmektedir; bu çeşitli reseptörler aracılığıyla uyarıcı ve baskılayıcı sinyallerin dengesi, hedef hücrelere karşı bir yanıt veya toleransla sonuçlanmaktadır. Aktive edici reseptörlerin çapraz bağlanması, adaptör proteinlerde yer alan immünoreseptör tirozin bazlı aktivasyon motiflerinin (ITAM'lar) fosforilasyonunu tetikleyerek sinyal kaskadlarını başlatan çeşitli proteinlerin devreye girmesine neden olur. NK hücrelerinin en güçlü aktive edici reseptörü olan CD16, opsonize hücreler üzerindeki IgG antikorlarının Fc bölgelerini bağlayarak, antikora bağlı hücre aracılı sitotoksisite (ADCC) olarak bilinen bir süreçle NK hücrelerini aktive eder. CD16 diğer reseptörlerin katkısı olmaksızın NK hücrelerini bağımsız olarak aktive edebilme kapasitesine sahip tek reseptördür (67). CD16'ya ek olarak, NKp30, NKp40, NKp44 ve NKp46 gibi doğal sitotoksisite reseptör ailesinin üyeleri, NK hücrelerinde aktivasyon sinyallerini tetikleyebilir. Bu reseptörler viral, bakteriyel ve/veya tümörle ilişkili ligandlara doğrudan bağlanarak 14 sitokin üretimini ve hücre öldürme kapasitesini artırmaktadır (68). NKG2D ve NKG2C, terapötik hedefler olarak önemli translasyonel etkileri olan aktive edici reseptörler arasında yer almaktadır. NKG2D, MHC sınıf I polipeptit ilişkili sekans A (MICA), MICB ve RAET1/ULBP protein ailesi gibi insan tümörleri ve viral olarak enfekte olmuş hücrelerde bulunan ligandlara bağlanabilen homodimerik bir C-tipi lektin ailesi reseptörüdür. NKG2C ise CD94 ile bir dimer oluşturur ve aktivasyonu genellikle NK hücre inhibitör reseptörü NKG2A ile ilişkili baskılayıcı sinyalle bağdaştırılan HLA-E'ye bağlanmasına dayanmaktadır (69, 70). NK hücreleri ayrıca immünolojik öz-toleransı destekleyen ve aktive edici reseptörlerden gelen uyarıcı sinyalleri dengeleyen çeşitli inhibitör reseptör repertuarını eksprese etmektedir. Bu inhibitör reseptörler, negatif geri bildirim mekanizması ile NK hücre aktivitesini düzenler. NK hücre inhibitör reseptörlerinin farklı aileleri bulunmaktadır ve bunların ligandları genellikle HLA sınıf I molekülleridir (HLA-A HLA-B, HLA-C, HLA-E ve HLA-G). Bu reseptörlerin çoğu, aktive edici reseptör sinyallerini ve dolayısıyla NK hücre aktivasyonunu azaltan membran proksimal fosfatazlar için bağlanma bölgeleri olarak görev gören immünoreseptör tirozin bazlı inhibisyon motiflerini (ITIM'ler) içeren hücre içi alanlara sahiptir. Katil immünoglobulin benzeri reseptör (KIR) ailesi, 14 polimorfik reseptörden oluşmaktadır: Altısı aktive edici (2DS1-2DS5 ve 3DS1), yedisi inhibe edici (2DL1- 2DL3, 2DL5 ve 3DL1-3DL3) ve biri hem aktive edici hem de inhibe edici fonksiyonlara sahiptir (2DL4). HLA-E'ye bağlanabilen C-tipi lektin ailesi üyesi NKG2A, NK hücreleri tarafından ifade edilen önemli bir inhibitör reseptördür. KIR'ların aksine ne NKG2A ne de HLA-E polimorfik değildir. Bu durum, bu etkileşimleri hedefleyen terapötik ajanların geliştirilmesinde avantaj yaratmaktadır (71, 72). 2.5 DNAM-1 Ailesi DNAM-1 ailesi, TIGIT, DNAM-1, CD96 ve PVRIG reseptörlerini içeren bir immünoglobulin süper ailesi (IgSF) grubudur. Bu reseptörler, PVR/CD155 ve Nectin- 2/CD112/PVRL2 gibi ortak ligandlara bağlanmalarına rağmen, lenfosit fonksiyonları üzerinde farklı ve zıt etkiler yaratır. DNAM-1, bağışıklık sistemini destekleyen uyarıcı 15 bir reseptör olarak görev yaparken, TIGIT ve PVRIG bağışıklık yanıtını baskılayan inhibe edici reseptörlerdir. CD96 ise NK hücrelerinde adezyonu ve sitotoksisiteyi destekleyen bir rol oynamaktadır. TIGIT, özellikle tümör hücreleri ve antijen sunan hücreler tarafından eksprese edilen PVR ve Nectin-2 ligandlarına bağlanarak bağışıklık sisteminin düzenlenmesinde önemli bir yer tutar. Bu reseptör ailesi hem T hücreleri hem de NK hücreleri üzerinde eksprese edilerek bağışıklık yanıtlarının karmaşık bir şekilde düzenlenmesine katkıda bulunur (3, 73). Nektin ve Nektin benzeri (Necl) proteinler için bu reseptörler, son yıllarda kanser immünoterapisinde umut vadeden hedefler olarak öne çıkmıştır (74). Şekil 2.4 DNAM-1 ailesi reseptörlerinin Nektin ve Nektin benzeri moleküllerle karmaşık etkileşimi (75) 16 DNAM-1, TIGIT, CD96 ve PVRIG genel olarak aktive olmuş T hücreleri ve NK hücrelerinde eksprese edilmektedir. Bu moleküllerin ligandları olan PVR, Nectin- 1, Nectin-2, Nectin-3 ve Nectin-4 ise tümör hücreleri ve antijen sunan hücrelerde (APC) bulunmaktadır. TIGIT ve PVRIG, sitoplazmik alanlarındaki ITIM motifleri aracılığıyla inhibitör sinyalleri iletmektedir. TIGIT'ın ITT benzeri motifi negatif sinyalizasyonda rol oynarken DNAM-1, ITT/ITT benzeri bir motif aracılığıyla aktive edici sinyaller verir. PVRIG, ITIM motifi aracılığıyla inhibitör bir sinyal iletir. CD96 ise ITIM motifinin yanında bir YXXM motifi de içermektedir. CD96’nın inhibitör mü yoksa aktivatör mü olduğu konusu henüz netlik kazanmamıştır. TIGIT reseptörü, PVR, Nectin-2, Nectin-3 ve Nectin-4'e bağlanır. DNAM-1 reseptörü ise PVR ve Nektin-2 ile etkileşime girer. CD96, PVR ve Nektin-1'e bağlanmaktadır. DNAM-1, PVR’ye bağlanmak için hem TIGIT hem de CD96 ile ve Nektin- 2’ye bağlanmak için ise PVRIG ile rekabet etmektedir. TIGIT, PVR’ye bağlanmak için DNAM-1 ve CD96'dan daha yüksek bir afiniteye sahiptir. Nektin-2'nin PVRIG ile etkileşimi DNAM-1'e göre daha yüksek afiniteye sahiptir (75) (Şekil 2.4). 2.5.1 DNAM-1 (CD226) DNAM-1 reseptörü, CD3-CD56+ NK hücrelerinde (%97), CD3+ CD4+ T hücrelerinde (%90), CD3+ CD8+ T hücrelerinde (%80), CD3+ TCRγδ+ T hücrelerinde (%99), CD19+ B hücrelerinde (%3) ve monositlerde (%100) hücre yüzeyinde yapısal olarak eksprese edilen aktivatör bir immünoreseptördür (2). DNAM-1'in NK hücresi üzerindeki ana görevi sitotoksik fonksiyonun aktivasyonudur. Bununla birlikte ayrıca NK hücrelerinin olgunlaşma ve eğitimiyle de ilişkilidir. NK hücreleri, kemik iliğinde farklı ara aşamalardan geçerek kemik iliğinden çıkmadan ve perifere göç etmeden önce optimal fonksiyonel duruma ulaşan ortak lenfoid öncülerden meydana gelir (54, 76). Bu süreç boyunca NK hücreleri, spesifik inhibitör reseptörleri aracılığıyla kendi MHC-I moleküllerini tanıyarak sağlıklı hücreleri tolere etme yeteneği kazandıkları bir eğitim sürecinden geçerler. İnhibitör MHC-I-spesifik reseptörleri ifade etmeyen NK hücrelerinin alt kümesi eğitimsiz 17 olarak adlandırılır. Eğitimli NK hücreleri aynı zamanda enfekte veya dönüştürülmüş hücrelerde aynı MHC-I ifadesinin azaldığını "algılama" yeteneğini kazanarak sitotoksisiteyi tetiklemektedir (77). NK hücrelerinde DNAM-1 ifadesi eğitimli NK hücrelerinde eğitimsiz NK hücrelerine kıyasla daha yüksektir ve inhibitör reseptörlerin sayısı ve sitolitik potansiyeli ile ilişkilidir. Hedef tanıma üzerine DNAM-1, immünolojik sinapsta lenfosit fonksiyonu ile ilişkili antijen 1 (LFA-1) integrinin aktif formunun lokalizasyonunu kolaylaştırarak hedef hücreyi öldürmeyi desteklemektedir (78). Sitotoksik lenfositlerdeki DNAM-1 ve ligandları arasındaki etkileşim, integrin LFA-1 ile fiziksel ilişkisine bağlı olan bir aktive edici sinyali başlatır. DNAM-1 agregasyonu, sitoplazmik alanındaki bir serin kalıntısının protein-kinaz C bağımlı fosforilasyonu ile sonuçlanır. Bu fosforilasyon, LFA-1 ile birleşmeyi ve Fyn tirozin- protein kinazın aktivasyonunu teşvik eder ve bu da DNAM-1 sitoplazmik kuyruğundaki bir tirozin kalıntısını fosforile ederek sinyal iletimini başlatır (79-82). Yapılan çalışmalar TIGIT'ın DNAM-1'i doğrudan inhibe ettiğini ve yüksek TIGIT ekspresyonunun düşük DNAM-1 ekspresyonu ile ilişkili olabileceğini göstermiştir (83, 84). DNAM-1'in güçlü aktivasyon işlevi, bu reseptörün malignitelerin tedavisinde hedeflemek veya kullanmak için bir potansiyel hedef haline getirmiştir. DNAM-1+ hücrelerin kullanılması veya DNAM-1 CAR-T ve NK hücrelerinin geliştirildiği araştırmalar giderek artmaktadır (85, 86). 2.5.2 TIGIT TIGIT, Ig süper ailesine ait bir transmembran proteini olup, bir hücre dışı IgV alanı, bir transmembran alanı ve bir ITIM ile bir Ig kuyruk tirozin (ITT) benzeri motif içeren bir sitoplazmik kuyruk bulundurur. İmmünoglobulin değişken alanı, DNAM-1 CD96, Nectin-1, Nectin-2, Nectin-3, Nectin-4 ve PVR gibi PVR benzeri ailenin diğer üyeleriyle dizi homolojisi gösterir (87). 18 TIGIT, yardımcı T hücreleri, CD4+ Treg'ler, foliküler CD4+ T hücreleri sitotoksik CD8+ T hücreleri ve NK hücrelerinde yüksek oranda eksprese edilirken naif T hücrelerinde düşük oranda eksprese edilmektedir (88). TIGIT ifadesinin naif hücrelerde genellikle düşük olmasının yanında hem T hücrelerinin hem de NK hücrelerinin aktivasyonu sonrasında ekspresyonun arttığı gösterilmiştir (87). DNAM-1 ailesine mensup olan TIGIT'ın, T hücrelerinin yüzeyinde DNAM-1 ile etkileşime girme ve DNAM-1’in cis-homodimerizasyonunu bozma yeteneğini ortaya çıkararak, hücredeki DNAM-1 aracılı ko-stimülasyona müdahale ettiği gösterilmiştir (89). TIGIT reseptörü, DNAM-1 sinyalini önlemesinin yanı sıra, sitoplazmik kuyruğu aracılığıyla doğrudan inhibitör sinyaller de iletebilir. Hücre içi TIGIT sinyalizasyonunu araştıran bir çalışma, TIGIT ile transfekte edilmiş insan NK hücre hattı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sonucunda ITIM motifinin insan TIGIT sinyalizasyonu için gerekli olduğu bulunmuştur. Bu çalışmada, mutasyona uğramış veya kesilmiş ITIM motifine sahip insan TIGIT'ının NK hücre sitotoksik aktivitesini engelleyemediği ortaya koyulmuştur (90). Dolaşımdaki NK hücreleri, tümör öldürme aktivitesini etkileyen TIGIT ekspresyonu göstermektedir. Yapılan bir çalışmada, IL-12 uyarımından sonra, TIGIT- NK hücrelerindeki IFN-γ üretiminin TIGIT+ NK hücrelerindekinden önemli derecede daha yüksek olduğu bulunmuştur. Bu sonuç, TIGIT'ın NK hücrelerinin negatif bir düzenleyicisi olarak işlev gördüğünü göstermiştir. Ayrıca NK hücrelerindeki TIGIT ekspresyon seviyesi, farklı bireyler arasında IFN-γ üretme kapasiteleri ile ters orantılı olarak bulunmuştur. TIGIT'ın CD56dim NK hücrelerinde, CD4+ CD25high düzenleyici T hücrelerinde ve CD8+ CD45RO+ hafıza T hücrelerinde ifade edildiği gözlemlenmiştir. CD56dim NK hücreleri ise CD56bright NK hücrelerinden daha yüksek TIGIT ekspresyon düzeyine sahiptir (91). 19 TIGIT reseptörü PVR, Nektin-2 ve Nektin-3 ligandlarına bağlanabilir. Bunlardan PVR'ye kıyasla Nektin-2 ve Nektin-3’'e daha düşük afinite ile bağlanmaktadır (92). TIGIT, PVR için bir ligand olarak hücre dışı (ekstrinsik) bir rol üstlenebilir; DNAM-1 ko-stimülasyonunu engelleyerek hücre içi bir etki gösterebilmekte veya efektör hücreye doğrudan inhibitör sinyaller iletebilmektedir (87, 89, 90, 93). TIGIT'ın bloke edilmesinin kanser hastalarında T hücresi aktivitesini geri getirebileceğini öne süren çalışmalar bulunmaktadır. Akut miyeloid lösemide yapılan bir araştırmada, TIGIT ifadesinin siRNA ile susturulması, kandaki TIGIT+ CD8+ T hücrelerinin işlevsiz halini tersine çevirerek IFN-γ ve TNF-α üretiminin artmasına ve apoptozun azalmasına yol açmıştır (94). Melanomda yapılan bir başka çalışmada ise anti-TIGIT mAb'lerinin NY-ESO tümör peptidi ile in vitro uyarılan periferik kandaki CD8+ T hücrelerinin sitokin üretimini ve proliferasyonunu artırdığı gösterilmiştir. Bu etkinin TIGIT/PD-1 ko-blokajı ile arttığı görülmüştür (95). 2.5.3 PVRIG (CD112R) PVRIG, bir hücre dışı IgV alanı, bir transmembran alanı ve Nektin-2 için yüksek afiniteye sahip bir hücre içi ITIM benzeri motiften oluşan bir transmembran proteinidir (96). PVRIG reseptörü ağırlıklı olarak hafıza/efektör olan ancak naif olmayan CD8+ T hücrelerinde ve hem CD16+ hem de CD16- NK hücrelerinde düşük ve değişken düzeylerde ifade edilmektedir. Protein düzeyinde CD19+ B hücrelerinde, naif (CD45RA + CCR7+) veya yardımcı CD4+ T hücrelerinde, CD14+ monositlerde veya CD66b+ nötrofillerde ve DC’lerde tespit edilmemiştir. PVRIG, Nektin-2 ile güçlü bir şekilde etkileşime girer ve reseptör aracılı sinyalleri baskılayan ve immün hücrelerinin çoğalmasını engelleyen bir ko-inhibitör reseptör olarak görev yapar. PVRIG ve DNAM-1, Nektin-2 üzerinde ortak bir bağlanma bölgesini paylaşmaktadır. PVRIG, hücre üzerinde Nektin-2’ye bağlanmak için DNAM-1 ile rekabet eder ve inhibitör bir sinyale aracılık eder. PVRIG insanlarda 20 Nektin-2 için en yüksek afiniteye sahip reseptördür ve immün hücrelerin DC'ler ve tümör hücreleri ile etkileşiminde rol almaktadır (96). Yapılan bir çalışma, PVRIG veya TIGIT eksprese eden insan NK hücrelerinin sayısının, Nektin-2 pozitif meme kanserinde IFN-γ üretiminin azalmasıyla azaldığını böylece PVRIG'in ligandı Nektin-2 ile etkileşiminin NK hücre sitotoksisitesini baskıladığını göstermiştir. Xu ve arkadaşları, TIGIT ve CD112R'nin ayrı ayrı veya birlikte bloke edilmesinin, NK hücre aktivitesini artırarak trastuzumabın meme kanseri üzerindeki etkisini artırdığını göstermiştir (97). 2.5.4 CD96 (TACTILE) CD96 olarak da bilinen insan TACTILE, 1992 yılında keşfedilmiştir. CD96, Ig süper ailesine ait tek geçişli bir transmembran glikoproteinidir. Hücre dışı kısmında CD96, VN-term-V-CC-term sıralamasında üç Ig benzeri domainden ve prolin/serin/treonin bakımından zengin bir membran proksimal bölgeden oluşmaktadır (98). CD96 ifadesi NK hücreleri, NKT hücreleri ve T hücreleri (αβ ve γδ) gibi immün sistem hücreleriyle sınırlıdır. Ayrıca CD96, NK hücrelerinin PVR ve Nektin- 1 ligandlarını ifade eden hedef hücrelere yapışmasına aracılık etmektedir (99). CD96, sitoplazmik kısmında ligandıyla etkileşime girdikten sonra inhibitör sinyale aracılık eden ITIM benzeri bir alan içermektedir. Bunun yanında NKG2D gibi birkaç aktive edici reseptörünkine benzer bir YXXM motifi içermesine rağmen bunun işlevsel önemi tam olarak anlaşılamamıştır (100). CD96'nın I benzeri (varyant 1) ya da V benzeri (varyant 2) ikinci domaininin iki ek varyant halinde ifade edildiği bildirilmiştir. CD96'nın ikinci domaininin ikiye bölünmüş olan bu varyantlarından ligandlarıyla etkileşimine en dıştaki V benzeri alanın aracılık ettiği gösterilmiştir. Varyantların PVR'ye bağlanma afinitelerinin farklı olduğu ve bunun CD96’nın gösterdiği fonksiyonların farklılığı ile ilgisi olabileceği belirtilmiştir (101). 21 CD96 ve PVR arasındaki afinite PVR ve DNAM-1 arasındaki afiniteden daha yüksek iken PVR ve TIGIT arasındaki afiniteden daha düşüktür (87). 2.6 DNAM-1 Ailesi Ligandları Nektinler, dört üyeli bir aileden oluşan Ca2+'dan bağımsız immünoglobulin benzeri hücre adezyon molekülleridir (IgCAM). Hücre-hücre adezyonunun yanında hücre hareketi, hücrelerin çoğalması, hayatta kalması, farklılaşması, polarizasyonu ve virüslerin girişinde görev almaktadırlar (102). İnsanlarda dört adet Nektin tanımlanmıştır: Nektin-1 (CD111) (103), Nektin-2 (CD112) (104), Nektin-3 (CD113) (105) ve Nektin-4 (106). Aynı hücrenin yüzeyindeki iki Nektin molekülü önce cis-dimerler oluşturur, ardından cis-dimerler bitişik hücrelerde trans-etkileşime girer (107). Nektinler ayrıca, kendileri ile yakından ilişkili Nektin benzeri (Necl) moleküllerle ve daha az ilişkili diğer IgCAM'lerle de trans-etkileşime girmektedir (108). 22 Şekil 2.5. Nektinler, Necls ve Afadinin moleküler yapıları ve etkileşim şekilleri (102) Nektin ve Necl molekülleri, üç Ig benzeri döngüye sahip bir hücre dışı bölge bir transmembran segment ve bir sitoplazmik kuyruğa sahiptirler. Nektinler ve Necl'ler Afadin’i bağlayıp bağlayamadıklarına göre sınıflandırılır; Nektinler Afadin’i bağlarken Necl'ler bağlamamaktadır. Nektin ve Afadin arasındaki doğrudan bağlanmaya, Nektinlerin korunmuş C-terminal motifi ve Afadin’in PDZ alanı aracılık etmektedir (109). Aynı hücrenin yüzeyindeki iki Nektin veya Necl 23 molekülü önce cis-dimer oluşturmakta ve ardından bunu, cis-dimerlerin bitişik hücreler üzerinde trans-dimerizasyonu izlemektedir. Böylece hücre-hücre adezyonları gerçekleşir. Nektinler ve Kadherinler bunun için iş birliği yaparlar. Kadherinlerin aksine, Nektinler homofilik veya heterofilik trans-dimerler oluşturarak hücre-hücre temaslarını desteklemektedirler. Nektin-1 ve Nektin-3 arasında, Nektin-2 ve Nektin-3 arasında ve Nektin-1 ve Nektin-4 arasında heterofilik etkileşimler tespit edilmiştir. Ayrıca Nektinlerin heterofilik trans-etkileşimlerinin homofilik trans-etkileşimlerinden daha güçlü olduğu bilinmektedir (110). Nektinler üç alanlı bir yapıya sahiptir: 1- üç korunmuş Ig benzeri döngüden (bir IgV ve iki IgC döngüsü) oluşan hücre dışı alan, 2- bir transmembran alan ve 3- Afadin bağlayıcı motif içeren sitoplazmik alan (111). Nektin ailesi üyeleri transmembran bölgesinden yoksun bir protein olan Nektin-1γ hariç olmak üzere, üç Ig benzeri ilmekli bir hücre dışı bölgeye, tek bir transmembran bölgeye ve bir sitoplazmik kuyruk bölgesine sahiptir. Nektinlerdeki α varyantlarının ekspresyon seviyeleri diğer varyantlardan çok daha yüksektir. Ayrıca, Nektin-1β, -3γ ve -4 hariç, Nektinler C terminallerinde dört amino asit kalıntısından oluşan korunmuş bir motife sahiptir (E/A-X-Y-V, X herhangi bir amino asit olmak üzere). Bu motif Afadin’in PDZ alanını bağlayarak Nektinlerin aktin hücre iskeleti, diğer hücre-hücre adezyon sistemleri ve sinyal yolaklarıyla ilişkisine katkıda bulunmaktadır. Nektin-4 bu korunmuş motiften yoksun olmasına rağmen, C terminalinde Afadin’in PDZ alanını bağlamaktadır (102) (Şekil 2.5). 2.6.1 Nektin-1 Nektin-1’in üç splice varyantı vardır, bunlar; Nektin-1α, Nektin-1β, Nektin- 1γ’dır (102). Nektin-1'in hücre dışı bölgesinin ilk Ig benzeri döngüsü trans-dimerlerin oluşumu için gerekli iken cis-dimerler için gerekli değildir, bunun yanında ikinci Ig benzeri döngü cis-dimerlerin oluşumuna katkıda bulunmaktadır (112, 113). 24 Nektin-1 hücreler arası bağlantılarda yer alan ve sıkça eksprese edilen bir moleküldür. Adezyonun bozulduğu metastatik tümörlerdeki gibi patolojik durumlarda tanınabilecek kadar açığa çıkabilmektedir (34). Nektin-1 ekspresyonunun agresif tümör fenotipleri ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. PDAK hastalarının kanserle kanser-ilişkili fibroblastlarda yapılan bir çalışmada diffüz Nektin-1 ekspresyonu invazyon, metastaz ve daha düşük sağkalım süresi ile ilişkilendirilmiştir (114). Son yıllarda yapılan araştırmalar, Nectin-1’in NK hücreleri üzerindeki DNAM-1 ailesine mensup olan CD96 ile mikromolar afinite ile etkileşime girdiğini bulmuştur (115). Nektin-1, diğer Nektin ailesi üyelerinden Nektin- 4 ile trans-etkileşime girmektedir (106). 2.6.2 Nektin-2 Nektin-2’in iki splice varyantı vardır, bunlar; Nektin-2α ve Nektin-2δ’dır (102). Nektin-2 ince bağırsak, kan damarları ve kalp dahil olmak üzere çeşitli doku ve organlarda hücreler arası sınırlarda bulunur ve epitel hücreleri, endotel hücreleri ve kardiyomiyositlerin simetrik homotipik hücre-hücre adezyonunda rol oynar (108, 116). Bununla birlikte, immün hücrelerdeki Nektin-2 ekspresyonu, lenfositlerde çok az olmakla birlikte miyeloid hücrelerde bulunmaktadır (108). Nektin-2 ayrıca testisteki Sertori ve Leydig hücrelerinde yüksek ekspresyon ile karakterize edilmekte ve spermatogenezde rol oynamaktadır (117). Tümör hücrelerindeki araştırmalara göre, Nektin-2 tümör hücre hatlarının sitoplazmalarında eksprese edilmektedir. Ubikitin yolağının inhibisyonunun Nektin- 2’nin yüzey ekspresyonunu artırdığı ve NK hücre sitotoksisitesine karşı tümör hücresi duyarlılığını artırdığı gösterilmiştir (118). Kanser Genom Atlası Programı (TCGA) çeşitli kanserler için mRNA ekspresyon verilerini yayınlamış ve meme, yumurtalık, prostat, endometriyal, gastrik karaciğer, pankreas ve akciğer kanserlerinde Nektin-2’nin mRNA ekspresyonunun karsinom spesifikliği gözetmeksizin yüksek olduğunu bildirmiştir (119). Bir istisna 25 olarak, yapılan bir araştırmada yüksek Nektin-2 ekspresyon düzeyinin akut miyeloid löseminin daha iyi prognozu ile ilişkili olduğu dikkat çekmiştir (120). Nektin-2 ekspresyonu hem PD-L1 negatif hem de PD-L1 pozitif tümörlerde bulunmaktadır (119). Bunun yanında, pankreas kanseri vakalarının yaklaşık yarısında bulunurken iyi huylu lezyonlarda veya normal pankreas dokusunda bulunmaz (121). Bu özelliği ile pankreas kanserindeki hedef molekül arayışında önemli bir aday olarak göze çarpmaktadır. 2.6.3 Nektin-3 Nektin-3'ün üç splice varyantı bulunmaktadır. Bunlar; Nektin-3α, Nektin-3β ve Nektin-3γ’dır (102). Nektin-3 Nektin-1, Nektin-2 ve PVR ile trans-etkileşime girmektedir (106, 110). Ailesi içinde dikkat çekici bir özelliğe sahip olan Nektin-3, T lenfositleri ve NK hücreleri tarafından ifade edilen tek üyedir (122). Normal koşullar altında çeşitli dokularda yaygın olarak ifade edilir. Meme kanserleri ve pankreatik adenokarsinomlarda seviyeleri azalmakta, bu da metastaz ve invazyon gibi malign karakterlerin artmasına neden olmaktadır (34, 123). Nektin-3 ekspresyonu akciğer adenokarsinomlarında ve yumurtalık kanserlerinde artmaktadır. Nektin-3’ün artan seviyeleri, hücre göçü ve istilasının artmasına ve yumurtalık kanseri hücrelerinde matris metalloproteaz-2 ve -9'un yukarı regülasyonuna neden olmaktadır (124, 125). Buna karşın, Nektin-3 kaybının PDAK’ın kötü prognozu ile ilişkili olduğu, ancak lenf nodu metastazı, tümör boyutu veya vasküler tutulum gibi diğer klinikopatolojik özelliklerle ilişkili olmadığı daha önce yapılan bir çalışmada gözlemlenmiştir (123). Yapılan bir çalışmada, klinikopatolojik analizlerle birlikte pankreatik nöroendokrin tümörlerde (PanNET) Nektin-3 ekspresyonu immüno-histokimyasal olarak araştırılmıştır. Araştırmanın sonuçları Nektin-3'ün PanNET'lerin tümör agresifliğinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Dolayısıyla, Nektin-3 26 ekspresyonunun immüno-histokimyasal analizi PanNET'lerde tümör agresifliğini potansiyel olarak öngörebilir. Bu çalışma, PanNET'lerde Nektin-3'ün düşük membranöz ekspresyonunun daha büyük tümör boyutu, daha yüksek derece, lenfatik tutulum, daha yüksek Ki67 etiketleme indeksi, ileri pT faktörü, lenf nodu metastazı ileri tümör evresi, non-fonksiyone tümörler ve daha kısa hastalıksız sağkalım ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur. Bu sonuçlar Nektin-3'ün PanNET'lerin tümör agresifliğinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Araştırmacılar, Nektin-3 ekspresyonunun immüno-histokimyasal analizi PanNET'lerde tümör agresifliğini öngörmede faydalı olabileceği sonucuna varmaktadırlar (126). Böylece yapılan çalışmalarda Nektin-3’ün pankreas kanserindeki yeri hakkında birbirlerinden farklı sonuçlara ulaşıldığı söylenebilir. 2.6.4 Nektin-4 Nektin-4'ün iki splice varyantı bulunmaktadır bunlar; Nektin-4α ve Nektin- 4β’dır (106). Yapılan immüno-histokimyasal analizler Nektin-4’ün, deri, mesane, meme, özofagus, mide ve tükürük bezlerinin normal dokularında ilave zayıf-orta düzeyde ekspresyonun yanı sıra üreter, testis, larinks, hipofiz, uterus ve plasentada daha zayıf ekspresyon olduğunu göstermiştir (127). Nektin-4'ün aktivitesi invazyon, migrasyon, proliferasyon ve farklılaşma gibi hücre fonksiyonlarıyla ilişkilendirilmiştir. Pankreas, akciğer, mesane ve meme kanseri gibi bazı kanser türlerinde Nektin-4 ekspresyonunun artması ve yüksek ekspresyonunun kanser hastaları için daha kötü bir prognozla ilişkili olduğu belirtilmiştir (84, 128-131). Nektin-4 seviyelerindeki bu artış proliferasyon, metastaz ve anjiyogenez ile bağlantılıdır (132). Ayrıca, kanser hastalarında serum Nektin-4 seviyelerinin çoklu tümörler için bir tanı belirteci olabileceği önerilmiştir (133). Siddharth ve ark. tarafından yapılan çalışmalarda, Nektin-4'ün Wnt/β-Catenin sinyal kaskadını güçlendiren bir meme kanseri köklülük belirteci olabileceğini göstermiştir (133). Lattanzio ve arkadaşları da Nectin-4'ün meme kanserinin uzak nüksünde bir risk faktörü olduğunu bildirmiştir. Tek taraflı meme kanserine sahip 197 27 hastanın analiz edilmesiyle elde edilen veriler, yüksek Nektin-4 ekspresyonunun kötü uzak nükssüz sağkalım ile ilişkili olduğunu göstermiştir (134). Hao ve arkadaşları Nektin-4'ün AKT sinyal kaskadını aktive ederek EMT'yi desteklediğini bildirmiştir. Ayrıca, papiller tiroid kanseri hücrelerinde Nektin-4'ün aşağı regülasyonu EMT'yi baskılamış ve sonuç olarak hücre göçü ve invazyonu inhibe edilmiştir (135). Nanoformüle kinakrinin (NQC) Nektin-4'ün ADAM-17 aracılı proteazomal bölünmesini inhibe ettiği bildirilmiştir. Bu da Nectin-4-sitoplazmik-domainin nükleer translokasyonunun ve nihayetinde DNA onarımının engellenmesine yol açmakta olduğunu göstermektedir. Ayrıca NQC, Nectin-4-hücredışı-domain aracılı kanser anjiyogenezini de engellemektedir (136). 2.6.5 PVR PVR, hücre dışı bölgede immünoglobulin domaini V, C1 benzeri bir domain ve bir C2 domaininin varlığı ile tanımlanan immünoglobulin süper ailesinin bir üyesidir (102). PVR'nin dört farklı izoformu bulunmaktadır: α ve δ transmembran yapıdadır ve δ ITIM motifinden yoksundur; β ve γ ise transmembran alanlarından yoksun çözünebilir izoformlardır (137). PVR ayrıca Nektin-benzeri adezyon molekülleri (Necl) ailesinin bir üyesi olarak kabul edilmektedir. Bu aile, IgV alanındaki üç korunmuş motifi Nektinlerle paylaşmakta, ancak hücre içi alanı aracılığıyla F-aktin bağlayıcı protein Afadin’e bağlanmaması ile farklılık göstermektedir (102, 138). Ayrıca yapılan filogenetik analizler, PVR'nin Afadin’i bağlayamamasına rağmen Nektinlerle, Necl alt grubundan daha yakın ilişkili olduğunu ortaya koymaktadır (139). PVR ekspresyonu kolon kanseri, meme kanseri, akciğer adenokarsinomu, pankreas kanseri, melanom ve glioblastom gibi solid tümörlerde tümör migrasyonu, metastaz gelişimi, doku ve lenf nodu invazyonu, nüks ve daha kötü sağkalım ile ilişkili olduğu için olumsuz bir prognoz ile ilişkilendirilmiştir (78, 140-144). 28 Ayrıca yapılan çalışmalarda jinekolojik maligniteler, gastrointestinal ve akciğer kanseri dahil olmak üzere kanser hastalarının serumundaki çözünebilir PVR konsantrasyonunun sağlıklı donörlerin serumlarına göre arttığını göstermiştir (145, 146). PVR ligandı için bilinen reseptörler TIGIT, DNAM-1 ve CD96’dır. PVR'nin TIGIT'e bağlanması anti-tümör yanıtını baskılarken DNAM-1'e bağlanması anti- tümör yanıtını teşvik eder; CD96'ya bağlanması ise farklı kanser tiplerinde hem tümör bağışıklığını baskılamak hem de teşvik etmek üzere hareket etmektedir (147). TCGA'da temsil edilen kanser türleri arasında yapılan analiz, 33 kanserin 12'sinde PVR gen ekspresyonu ile sitolitik skor (Perforin1 ve Granzim A ekspresyonunun geometrik ortalaması alınarak hesaplanmaktadır) arasında negatif bir korelasyon ortaya koyarken, geri kalan kanserler nötr veya pozitif ilişkiler göstermiştir (148). Bunun yanında PVR ekspresyonunun tümörde komşu normal dokuya göre daha yüksek olduğu gösterilmiştir (149). NK hücrelerinde ise, DNAM-1 ve PVR etkileşiminin, NK hücresinin anti-tümör aktivitesi için önemli bir tetikleyici olduğu bildirilmiştir (150). 29 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1 Materyaller 3.1.1 Kullanılan Hücre Hatları Çalışmada kullanılan BxPC-3 hücre hattı Doç. Dr. Begüm KOCATÜRK tarafından hediye edilmiş, NK-92 ve K562 hücreleri ise arşivimizde bulunan hücre hatlarından kullanılmıştır. 3.1.2 Kullanılan Kimyasallar Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medyum, TexMACS (Miltenyi Biotec, 130-097-196) L-glutamin, sodyum piruvat, fetal sığır serumu (fetal bovine serum, FBS), 10x Tripsin–EDTA (Biological Industries, İsrail; Lonza, İsviçre; Biowest, Fransa). Etanol, kalsiyum ve magnezyumsuz fosfat tamponlu salin (phosphate buffered saline, PBS) (HYCLONE, SH30256.01),10 µg Recombinant Human IL-2 (carrier-free) (BIOLEGEND, 589102), (1,000X) 1 ml Monensin solüsyonu (BIOLEGEND, 420701) Polimeraz zincir reaksiyonlarında kullanılan primerler; Nektin-1 Nektin-3, Nektin-4, PVR (Bioligo, Ankara), Nektin-2 (QIAGENE, Almanya) 3.1.3 Kullanılan Sarf malzemeler Hücre kültürü flaskı 25 cm2 (SPL, 70025), Hücre kültürü flaskı 75 cm2 (SPL, 70075), 15 ml konik santrifüj tüp (Genaxy, GEN-CT-15ML), 15 ml konik santrifüj tüp (Genaxy, GEN-CT-50ML), 5 mL Kapaksız Polystyrene tüp (FALCON, 352052), 5 ml steril serolojik pipet (CORNING, 4487), 10 ml steril serolojik pipet (CORNING, 4488), düz tabanlı 12 kuyucuklu plaka (SPL, 30012) 30 3.1.4 Kullanılan Kit ve Antikorlar RNeasy Plus Mini Kit (QIAGENE, Almanya), QuantiTect Rev. Transcription Kit (50) (QIAGEN, Almanya), QuantiNova SYBR Green RT-PCR Kit (100) (QIAGEN, Almanya) FITC anti-human CD3 Antikoru (BIOLEGEND, 344804), APC anti-human CD56 (NCAM) Antikoru (BIOLEGEND, 318310), PE/Cyanine7 anti-human CD107a (LAMP-1) Antikoru (BIOLEGEND, 328618), PerCP/Cyanine5.5 anti-human Perforin (BIOLEGEND, 308114), PE anti-human/mouse Granzyme B Recombinant Antikoru (BIOLEGEND, 396406), Brilliant Violet 421™ anti-human CD226 (DNAM-1) Antikoru (BIOLEGEND, 338332), PE/Cyanine7 anti-human TIGIT (VSTM3) Antikoru ((BIOLEGEND, 372714), PE anti-human CD112R (PVRIG) Antikoru (BIOLEGEND, 301504), PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD96 (TACTILE) Antikoru (BIOLEGEND, 338412) 3.1.5 Kullanılan Cihazlar CO2 inkübatör (Thermo Incubator), Laminar flow kabin (Thermo, Hera Safe), Florasan Mikroskop, Elektoforez tankı, Akım sitometri cihazı (BDfACSCanto II), RT- PCR cihazı (Rotor Gene 6000), Su banyosu, Santrifüj (Thermo Scientific, Heareus) 3.2 Yöntem NK-92 hücrelerinin kanser hücre hatları ile ko-kültürü sonucunda NK hücrelerinin fonksiyonel analizlerinin belirlenmesi ve buna bağlı olarak kanser hücre hatlarında ligand ekspresyonlarındaki değişimin incelenmesi amacıyla tasarlanmış olan deney, akış şeması olarak gösterilmiştir (Şekil 3.1). 31 Şekil 3.1. İş akış şeması BxPC 3 Hücre Kültürü NK 92 Hücre Kültürü Ko kültür qRT PCR ile BxPC 3 Hücrelerinin RNA Ekspresyon Analizi Nektin 1 Nektin 2 Nektin 3 Nektin 4 PVR GAPDH Akım Sitometri ile NK 92 Hücrelerinin Reseptör Ekspresyon Analizi DNAM 1 TIGIT PVRIG CD96 Akım Sitometri ile NK 92 Sitotoksisite Analizi CD107a Perforin Granzim B İstatistiksel Analizler 32 3.2.1 Çalışmada Kullanılan Çözeltiler Fosfat Tamponlu Salin (PBS) Çözeltisinin Hazırlanması Ticari olarak temin edilen 10X PBS belirtilen protokole göre hazırlanmıştır. Buna göre, 10X konsantrasyonda olan PBS, distile su ile 1X konsantrasyona seyreltilmiştir. Ardından 121 °C’de 20 dakika otoklavlanmıştır. Steril edilen 1X PBS çözeltisi +4°C’de muhafaza edilmiştir. Fetal Sığır Serumunun (FBS) İnaktivasyonu Ticari olarak temin edilen FBS’in saklama koşulları -20°C’dir. İnaktivasyon için FBS oda sıcaklığına gelene kadar çözüldükten sonra 55°C’ye ayarlanmış olan su banyosunda 30 dakika bekletilmiştir. Ardından çalışmalarda kullanılmak üzere alikotlanarak -20°C’de muhafaza edilmiştir. Hücre kültürü besiyerlerinin hazırlanması BxPC-3 hücre hattının kültüründe RPMI 1640 Medyum kullanılmıştır. Besiyeri %10 FBS, %1 penisilin/streptomisin, %1 L-glutamin, %1 sodyum piruvat ve %1 1M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ile güçlendirilmiştir. NK-92 hücreleri %10 FBS, %1 penisilin/streptomisin, 100uM beta merkaptoetanol ve 500 UI IL-2 içeren TexMACS besiyeri içerisinde kültüre edilmiştir. Besiyerleri +4°C’de muhafaza edilmiştir. 3.2.2 In vitro Deneyler Sıvı nitrojen tankında dondurulmuş olarak saklanan BxPC-3 ve NK-92 hücreleri, kültüre alınmak üzere 37 °C su banyosu içerisinde çözdürülmüştür. Steril durumdaki laminar kabinin içine getirilip kendi besiyerleri içerisinde 10 mL’de resüspanse edilmişlerdir. BxPC-3 hücre hattı 1200 rpm’de 7 dakika, NK-92 hücre hattı 200 g’de 10 dakika olacak şekilde santrifüj edilmiştir. Santrifüjün ardından oluşan süpernatant, serolojik pipet ile çekildikten sonra BxPC-3 hücreleri kendi besiyerinden 15 mL içinde T-75 (75 cm2) flask içerisinde yatay şekilde kültüre edilirken NK-92 33 hücreleri, kendi besiyerinden 20 mL içinde T-75 flask içerisinde dikey şekilde 37 °C %5 CO2 içeren inkübatörde kültüre edilmiştir. Hücrelerin yoğunluk ve morfolojik yapıları invert mikroskopla takip edilmiş, besiyeri periyodik olarak kontrol edilerek pH dengesi gözetilmiştir. Bu indikatörlere bağlı olarak hücrelerin %80 oranında yoğunluğa ulaşması ile pasajlanması sağlanmıştır. Hücrelerin idamesi T-75 ve T-25’lik (25cm2’lik) flasklar içerisinde gerçekleştirilmiştir. BxPC-3 hücreleri adherent karakterlerinden dolayı flask yüzeyine yapışmaktadır. Pasajları için; hücreler %80 oranında yoğunluğa ulaştıktan sonra hücrelerin besiyeri çekilmiş, 5 mL PBS ile yıkanmış ve ardından 4 mL %0.25 Tripsin uygulaması yapılmıştır. Flask, 5-7 dakika boyunca 37 °C %5 CO2 inkübatörde bekletildikten sonra 8 mL besiyeri ile tripsinin inaktive olması sağlanmıştır. Ardından hücreler 1800 rpm’de 7 dakika boyunca santrifüj edilmiş, süpernatantları çekilip atıldıktan sonra 15 mL taze besiyeri içerisinde ekilmiştir. NK-92 hücreleri kültüre edildiklerinde birbirlerine yapışma eğilimi gösteren süspanse hücrelerdir. Pasajları için; hücreler %80 oranında yoğunluğa ulaştıktan sonra hücrelerin tamamı 200 g’de 10 dakika boyunca santrifüj edilmiştir. Süpernatantın çekilmesinin ardından 15 mL kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile yıkanarak santrifüj edilmiştir. Süpernatantın çekilmesinin ardından 15 mL PBS ile yıkanarak santrifüj edilmiş ve süpernatant tamamen uzaklaştırılmıştır. Hücreler T-75 flaska ekildiğinde 20 mL, T-25 flaska ekildiğinde 10 mL taze besiyeri içerisinde kültüre alınmıştır. Hücre hatlarının laboratuvardaki devamlılığının sağlanması adına stok alınarak ilerlenmiştir. Hücre dondurma işleminde %10 DMSO içeren FBS çözeltisi ile hücreler kryoviallere alınmış ve 1 gün -80°C de bekletilmesinin ardından sıvı nitrojen tankına aktarılmıştır. 34 3.2.3 Hücre Sayımı BxPC-3 hücrelerinin sayımında tripan mavisi boyası kullanılmıştır. Tripan mavisi mikroskopide hücre sayımı için yaygın olarak kullanılır. Boya dışlama testi, bir hücre süspansiyonunda bulunan canlı hücrelerin sayısını belirlemek için kullanılır. Prensibi, canlı hücrelerin tripan mavisi, eozin veya propidyum gibi belirli boyaları dışlayan sağlam hücre membranlarına sahip olduğu, ölü hücrelerin ise sahip olmadığı ilkesine dayanır (151). Flasktan kaldırılıp santrifüj sonrası tripsini uzaklaştırılan pellet halindeki hücreler besiyerinde çözülüp resüspanse edilmiştir. Bu hücrelerden 20 µl alınıp 20 µl tripan mavisi ile karıştırılmış ve Neubauer lamına yayılmıştır. Lamın alt ve üst bölmelerinde bulunan 16’ya bölünmüş karelerdeki tripan mavisinin içine girmediği canlı hücreler mikroskopta sayılmıştır. Sayılan karelerin aritmetik ortalaması alınmış ve hücrelerin sayımı yapılacak hale getirilene dek yapılan dilüsyon oranları göz önünde bulundurularak final canlı hücre sayısına ulaşılmıştır. Canlı hücre sayısı = Sayılan toplam hücre x Seyreltme faktörü x 10.000 hücre/ml Sayılan kare sayısı 3.2.4 NK-92 Hücreleri ile Kanser Hücrelerinin Ko-kültürü Plate yerleşimi NK-92 hücreleri BxPC-3 hücreleriyle Hedef:Efektör oranı olarak 1:1 oranda ko-kültüre alınmıştır. Düz tabanlı, 12 kuyucuklu deney kabı kullanılmış, her koşul 4’er kuyu olacak şekilde düzenlenmiş ve 3 kez tekrar edilmiştir. Ko-kültür 24.,36., 48., 72. 96.,120. ve 144. saat takipleri için ayrı ayrı yapılmıştır. Kontrol için kullanılan ko- kültüre alınmamış NK-92 hücreleri ayrı bir deney kabına alınmış ve ko-kültürdeki hücrelere uygulanan tüm işlemler bu hücrelere de uygulanmıştır. Her bir saat takibi için örnek deney kabı düzeneği Tablo 3.1’de gösterilmiştir. 35 Tablo 3.1. Ko-kültüre alınan ve alınmayan hücrelerin deney kabı yerleşimi 24. saat 1. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 2. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 3. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 36. saat 1. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 2. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 3. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 48. saat 1. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 2. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 3. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 72. saat 1. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 2. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 3. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 96. saat 1. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 2. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 3. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 120. saat 1. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 2. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 3. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 144. saat 1. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 2. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 3. BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 BxPC-3 – NK-92 NK NK-92 NK-92 NK-92 NK-92 NK-92 NK-92 NK-92 NK-92 NK-92 NK-92 NK-92 NK-92 36 3.2.5 Kullanılan Hücre Sayısının Optimizasyonu Ko-kültüre alınacak BxPC-3 ve NK-92 hücrelerinin sayısı, kültür süresinde ortama eklenecek besiyeri miktarı ve IL-2 takviyesi, ko-kültür süresi çeşitli optimizasyon deneyleri ile belirlenmiştir. Optimizasyon 1: Hedef:Efektör oranları 1:5, 1:2,5, 1:1, 1:0,75 ,1:0,5 şeklinde denenmiştir. Ko- kültürün altıncı gününde DNAM-1, TIGIT ve PVRIG ekspresyonları akım sitometri cihazında ölçülmüştür (Şekil 3.2). Şekil 3.2. Hedef:Efektör oranlarının değişimi üzerine ko-kültürün 144. saatinde sırasıyla DNAM-1, TIGIT ve PVRIG ekspresyonlarını gösteren histogram grafikleri Kültür süresince her 48 saatte bir 500 UI/mL IL-2’nin, buharlaşmanın önüne geçmek için 500 µl içinde eklenmesinin NK hücrelerinin sağlığı için gerekli olduğu sonucuna varılmıştır. Efektör hücrelerin miktarı azaldıkça yüzey reseptörlerindeki ekspresyon farkının belirginleştiği görülmüştür. Bunun yanında 1:5 (Hedef:Efektör) oranında ko-kültüre alınan NK-92 hücrelerinin BxPC-3 hücrelerini neredeyse tamamen öldürdüğü belirlenmiştir. Böylece deneye alınacak Hedef:Efektör hücre oranlarının 1:1 olmasına karar verilmiştir. 37 Optimizasyon 2: Hedef:Efektör oranları 1:1, 1:0,75, 1:0,5 olan hücrelerden NK-92 hücrelerinin DNAM-1, TIGIT ve PVRIG yüzey reseptörleri ko-kültürün 1., 2., 4. ve 6. gününde ölçülmüştür. Yüzey reseptörlerinin ko-kültürde geçen zamana bağlı olarak değiştiği belirlenmiş ve bu, altı gün içerisinde periyodik olarak ölçüm yapılması gerektiğini göstermiştir. Optimizasyon 3: Hedef:Efektör oranları 1:1, 1:0,75, 1:0,5 olan hücrelerden BxPC-3 hücrelerinin ko-kültürün altıncı gününde RNA izolasyonu yapılmıştır. cDNA sentezinin ardından yapılan qRT-PCR analizi kanser hücrelerindeki Nektin ailesi ve PVR ligandlarındaki değişimi göstermiştir (Şekil 3.3). Şekil 3.3. Ko-kültürün 144. saatinde BxPC-3 hücrelerindeki Nektin ailesi ve PVR molekül ekspresyonları RNA sonuçları, 144. saatinin sonrasında ko-kültüre alınmış ve alınmamış olan BxPC-3 hücreleri arasında fark olduğunu göstermiştir. 38 3.2.6 Hücrelerin Yüzey Boyaması Ko-kültürün belirli saatlerinde kuyucuklardan PBS ile yıkanarak FACS tüplerine alınan NK-92 hücreleri 200xg’de 10 dk santrifüj edilmiştir. Pellet üzerindeki süpernatant çekilip atıldıktan sonra 200 µl içinde 2 µl CD3, 3 µl CD56, 2,5 µl DNAM- 1 ve 3’er µl TIGIT, PVRIG ve CD96 antikorları ile yüzey boyaması gerçekleştirilmiştir. 40 dakika boyunca +4°C’deki inkübasyonun ardından 1 mL PBS ile yıkanıp santrifüj edilen hücrelerin akım sitometri cihazında analizi yapılmıştır. 3.2.7 Yüzey Reseptörlerinin Ölçümü 3.2.8 Kapılama Stratejisi BxPC-3 hücreleri ile olan ko-kültürünün ardından NK-92 hücreleri akım sitometri cihazında DNAM-1 ailesinin ekspresyonlarının ölçümü için işaretlenmiştir. Bunun için NK hücrelerinin kapılanmasında öncelikle debris hariç tüm hücreler seçilmiş ardından tek düşen hücrelerden CD3- CD56+ hücrelerden kapı alınmıştır. Ardından bu hücrelerdeki DNAM-1, TIGIT, PVRIG ve CD96 eksprese eden hücreler analiz edilmiştir (Şekil 3.4). Şekil 3.4. NK-92 hücrelerinin yüzey reseptör kapılama stratejisi 39 3.2.9 Sitotoksisite Deneyi NK hücreleri sitolitik etki gösteren immün hücrelerdir ve ana etki mekanizmaları degranülasyon adı verilen bir sürece dayanır. NK hücreleri sitoplazmalarında Perforin ve Granzim taşıyan sitotoksik granüller bulundurur ve hedef hücreyi tanıdıklarında granül içeriklerini immünolojik sinapsa salarak hedef hücrenin lizisine sebep olurlar (152, 153). Lizozomla ilişkili membran proteini-1 (CD107a veya LAMP-1), lizozomlarda bulunan yüksek oranda glikozillenmiş bir transmembran proteinidir. CD107a, NK hücreleri ve sitotoksik T hücrelerin litik granüllerinde yüksek oranda bulunan proteinlerdendir. Veziküllerin zarını kaplayan CD107a moleküllerinin yüksek oranda glikozillenmiş kısmı granülün luminal taraftında, kısa kuyruğu ise sitoplazmada bulunur. Degranülasyon sürecinde granüllerin dış zarı, NK hücre membranı ile birleşerek CD107a moleküllerinin yüzeye çıkmasını sağlar, dolayısıyla bu moleküller sitotoksisite göstergesi olarak kabul edilir (154, 155). K562 hücreleri, HLA sınıf I ekspresyonu azalmış ve aktivatör NK reseptörleri için ligand ekspresyonu artmış bir insan eritrolösemik hücre hattıdır, bu da onları NK hücre aracılı sitotoksisiteye özellikle duyarlı hale getirir (156). Bu, sitotoksisitenin araştırılmasında model hücre hattı olarak seçilmesindeki en önemli sebeptir. NK hücrelerinin sitotoksisitelerinin ölçümü için aşağıdaki protokol izlenmiştir; 1. Ko-kültürün belirli saatlerinde kuyucuklardan PBS ile yıkanarak 15 mL’lik falkon tüplerine alınan NK-92 hücreleri 200g’de 10 dk santrifüj edilmiştir. 2. Süpernatantı çekilip atılan hücreler K562 hücreleri ile ko-kültüre alınmak üzere 400 µl TexMACS (Miltenyi Biotec) içinde resüspanse edilmiştir. 3. Süspanse karakterdeki K562 hücreleri 15 mL’lik falkon tüplerine alınmış ve hücre sayımı gerçekleştirilmiştir. NK-92 hücreleri ile 1:1 oranda olacak şekilde hücreler ayrılıp 1800 rpm’de 5 dk santrifüj edildikten sonra süpernatantı 40 tamamen çekilip atılmıştır. Ko-kültüre alınacak K562 hücreleri 100 µl RPMI’da resüspanse edilmiştir. 4. 96 kuyucuklu plakların hücre yerleşimi Tablo 3.2’de gösterilmiştir. Tablo 3.2. 96 kuyucuklu plaklardaki hücre yerleşimi Negatif Kontrol Ko-kültür Pozitif kontrol Unstain NK-92 (1X106) 200 µl TexMACS NK-92 (1X106) K562 (1X106) 100 µl TexMACS 100 µl RPMI NK-92 (1X106) 0,4 µl Cell activation coctail 200 µl TexMACS NK-92 (1X106) 200 µl TexMACS 5. Her kuyucuğa 100 µl TexMACS içerisindeki 1X106 adet NK-92 hücresi dağıtılmıştır. 6. Ko-kültür koşuluna 100 µl RPMI içerisindeki 1X106 adet K562 hücresi eklenmiştir. 7. Unstain harici her kuyucuğa 1 µl CD107a eklenmiştir. 8. Negatif kontrol ve unstain koşullarına 100 µl besiyeri eklenerek total hacim 200 µl’e tamamlanmıştır. 9. Pozitif kontrol koşuluna 0,4 µl Cell activation coctail eklenmiş ve 37 °C %5 CO2 inkübatöre kaldırılmıştır. 10. Ko-kültürün 1. saatinin sonunda Monensin (1000x) 1:10 oranında besiyeri ile seyreltilmiş ve unstain koşulu hariç tüm kuyucukların her birine 2 µl eklenmiştir. Ardından 37 °C %5 CO2 inkübatöre kaldırılmıştır. 11. Ko-kültürün 4. saatinin sonunda koşulların hepsi PBS ile yıkanarak FACS tüpleri içine alınmış ve 200xg’de 10 dk santrifüj edilmiştir. Süpernatanttan dökülerek tamamen kurtulunmuştur. 12. Hücrelerin üzerine 100 µl fiksasyon ve permeabilizasyon solüsyonu eklenmiş ve +4°C’de 10 dk inkübasyona bırakılmıştır. 13. Ardından 1 mL PBS eklenmiş ve vortekslenmiştir. Hücreler 200g’de 10 dk santrifüj edilmiştir. Süpernatanttan dökülerek tamamen kurtulunmuştur. 14. Hücrelerin üzerine 100 µl Perm/wash buffer eklenmiş ve vortekslenmiştir. 41 15. Unstain koşulu hariç tüm koşullara 1 µl Granzim B, 1 µl Perforin eklenip vortekslenmiştir. Ardından +4°C’de 40 dk inkübasyona bırakılmıştır. 16. Tüplerin hepsine 1 mL PBS eklenmiş ve 200xg’de 10 dk santrifüj edilmiştir. 17. Süpernatantın tamamen dökülmesinin ardından 200 µl PBS içinde akım sitometri cihazında analiz edilmiştir. 3.2.10. Sitotoksisite Ölçümü 3.2.11. Kapılama Stratejisi BxPC-3 hücreleri ile olan ko-kültürünün ardından NK-92 hücreleri akım sitometri cihazında CD107a, Perforin ve Granzim B ekspresyonlarının ölçümü için işaretlenmiştir. Bunun için NK hücrelerinin kapılanmasında öncelikle debris hariç tüm hücreler seçilmiş ardından tek düşen hücrelerin CD3- CD56+ olan hücrelerden kapı alınmıştır. Ardından bu hücrelerdeki CD107a, Perforin ve Granzim B eksprese eden hücreler analiz edilmiştir (Şekil 3.5). Şekil 3.5. NK-92 hücrelerinde CD107a, Perforin ve Granzim B için kapılama stratejisi 42 3.2.12 Ko-kültüre Alınmış Hücrelerden RNA İzolasyonu NK-92 hücreleri ile ko-kültüre alınmış olan BxPC-3 hücrelerinden RNA izolasyonu yapılmıştır. Bunun için NK-92 hücreleri yüzeyden çekilip ayrı bir tüpe alınmış ve ardından yüzey 2 ila 3 kere PBS ile yıkanmıştır. NK-92 hücrelerinden arındırılmış BxPC-3 hücrelerinin üzerine mililitresinde 10 µl olan 200 µl RLT Lizis buffer eklenmiştir. 5 dakika sonra kuyucuklar pipetajla yıkanarak 1.5 mL’lik ependorf tüplere alınmıştır. Bu durumda RNA izolasyonuna devam edilmediğinde örnekler -80°C’ye kaldırılmıştır. RNA izolasyonu için lizis buffer içinde olan lizat; 1. 2 mL’lik tüplerin içine yerleştirilmiş olan gDNA eliminator spin kolonlarına aktarılmış ve 10.000 rpm’de 30 sn santrifüj edilmiştir. 2. Santrifüjün ardından elde edilen sıvının üzerine 1 volüm %75 etanol eklenmiş ve vorteks ve pipetaj ile karıştırılmıştır. Ardından 2 mL’lik tüplerin içine yerleştirilmiş olan RNeasy spin kolonlarına aktarılmış ve 10.000 rpm’de 15 sn santrifüj edilmiştir. 3. Santrifüjün ardından RNA filtreye tutunmuştur. Kalan sıvı atıldıktan sonra filtrenin üzerine 700 µl Buffer RW1 eklenmiş ve 10.000 rpm’de 15 sn santrifüj edilmiştir. 4. Kalan sıvı atıldıktan sonra filtrenin üzerine 500 µl Buffer RPE eklenmiş ve 10.000 rpm’de 15 sn santrifüj edilmiştir. 5. Kalan sıvı atıldıktan sonra filtrenin üzerine 500 µl Buffer RPE eklenmiş ve 10.000 rpm’de 2 dk santrifüj edilmiştir. 6. Filtrenin iyice kuruması için 10.000 rpm’de 1 dakika daha santrifüj edilmiştir. 7. Kalan sıvı atıldıktan sonra filtrenin üzerine 30 µl RNase-free water eklenmiş ve 5-7 dakika filtrenin ıslanması beklenmiştir. Yeni 1.5 mL’lik ependorflara yerleştirilen kolonlar 10.000 rpm’de 1 dakika daha santrifüj edilmiştir. Böylece RNA’nın filtreden sıvıya geçmesi sağlanmıştır. 8. Elde edilen RNA miktarı ve kalitesi NanoDrop cihazında ölçülmüştür. Tüm aşamalar sırasında filtrenin kuruduğuna dikkat edilmiştir. Elde edilen RNA örnekleri -80°C’ye kaldırılmıştır. 43 3.2.14. RNA Konsantrasyon Tayini İzole edilen RNA örnekleri buz üzerine alınarak konsantrasyon ve kalite ölçümü için NanoDrop spektrofotometre cihazı kullanılmıştır. A260/280 oranı 1,8-2,0; A260/230 oranı ise 2,0-2,2 aralığında olan RNA örnekleri ile çalışmaya devam edilmiştir. 3.2.15. RT-PCR Final konsantrasyonları 1000 ng/µl olacak şekilde hesaplanan RNA örneklerinin cDNA sentezi QuantiTect Reverse Transcription Kiti kullanılarak yapılmıştır (Tablo 3.3). Tablo 3.1. cDNA sentezi reaksiyon karışımı Reaksiyon Hacmi (µl) Quantitect Reverse Transcriptase 11 Quantitect Reverse Transcriptase buffer 5x 4 Quantitect primer mix 1 Quantitect gDNA Wipeout Buffer 7x RNase-free Water 2 Değişken RNA Değişken 1. Kullanılacak RNA örnekleri çözdürüldükten sonra -20°C metal bloklarda tutulmuş ve pipetaj yapılarak homojenize hale getirilmiştir. 2. NanoDrop cihazında yapılan ölçüm sonrası final konsantrasyonları 1000 ng/µl olacak şekilde hesaplanmıştır. 3. İki aşamalı