T.C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KOJİK ASİT TÜREVİ MANNICH BAZLARININ SENTEZİ VE İNSAN MELANOMA HÜCRELERİNE ETKİSİ İLE ANTİTİROZİNAZ AKTİVİTELERİNİN ARAŞTIRILMASI Uzm. Ecz. Gülşah KARAKAYA Farmasötik Kimya Programı DOKTORA TEZİ ANKARA 2017 T.C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KOJİK ASİT TÜREVİ MANNICH BAZLARININ SENTEZİ VE İNSAN MELANOMA HÜCRELERİNE ETKİSİ İLE ANTİTİROZİNAZ AKTİVİTELERİNİN ARAŞTIRILMASI Uzm. Ecz. Gülşah KARAKAYA Farmasötik Kimya Programı DOKTORA TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Mutlu AYTEMİR ANKARA 2017 vi TEŞEKKÜR Doktora tezimin hazırlanmasında ve her aşamasında bana yol gösteren ve yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen, zorluklarla karşılaştığımda hep yanımda olan sevgili hocam Prof. Dr. Mutlu Dilsiz AYTEMİR’e, Aramızdan vakitsiz ayrılan kıymetli hocam başta Prof. Dr. Ünsal ÇALIŞ olmak üzere, Farmasötik Kimya eğitimimin her aşamasında bana katkı sağlayan tüm değerli hocalarıma, Kütle spektrumlarının alınmasındaki yardımlarından dolayı Prof. Dr. Erhan PALASKA’ya, NMR spektrumlarının alınmasındaki yardımlarından dolayı Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi öğretim üyesi Prof. Dr. Hakan GÖKER’e, Biyokimya Anabilim Dalı’nda yürütülen çalışmalardan dolayı Doç. Dr. Ayşe ERCAN ve Uzm. Bio. Selin ÖNCÜL’e, Tüm eğitim hayatım boyunca her zaman yanımda olan aileme, Desteği ve sevgisi için eşime, Doktora tez döneminde aramıza katılan, varlıklarıyla bana neşe ve dayanma gücü veren oğlum MAHMUT METE ve kızım NURTEN ECE’ye, Çok teşekkür ederim. vii ÖZET Karakaya, G., Kojik Asit Türevi Mannich Bazlarının Sentezi ve İnsan Melanoma Hücrelerine Etkisi ile Antitirozinaz Aktivitelerinin Araştırılması, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Farmasötik Kimya Programı Doktora Tezi, Ankara, 2017. Malign melanom; cilt, göz ve saçın rengini belirleyen melanin pigmentini üreten melanositlerin malign tümörü olup görülme sıklığı hızla artış gösteren ve mortalitesi yüksek olan bir kanser türüdür. Tirozinaz ise melanositlerde melanin oluşumundan sorumlu enzim olup ciltteki pigmentasyon ile meyve ve sebzelerdeki kararmalardan sorumludur. Anormal düzeyde melanin oluşumu, malign melanom başta olmak üzere hiperpigmentasyon, postinflamatuvar pigmentasyon, melazma ve cilt yaşlanması süreci gibi sorunların nedenidir. Tirozinazın inhibisyonu melanin üretimini büyük ölçüde etkilemektedir. Kojik asit (5-hidroksi-2- hidroksimetil-4H-piran-4-on) antitirozinaz özelliği çok iyi bilinen ve yaygın olarak kullanılan bir bileşiktir. Ancak dayanıklılık ve ciltte tahriş sorunlarından dolayı, uygun hidrofilik ve lipofilik dengeye sahip türevlerin ve daha iyi endüstriyel uygulamaların elde edilmesi bir gereksinim olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu amaçla, tez kapsamında kojik asit üzerinde modifikasyonlar yapılarak 2-sübstitüe-3-hidroksi-6- hidroksimetil/klorometil/metil/morfolinometil/piperidinilmetil/pirolidinilmetil-4H- piran-4-on yapısında kırk sekiz adet yeni bileşik sentezlenmiş, IR, 1H-NMR, 13C-NMR, kütle spektroskopisi ve elemental analiz yöntemleriyle yapıları aydınlatılmıştır. Ayrıca, bu bileşiklere yapıca benzer ve daha önce yayın haline getirilen bileşikler de ilave edilerek toplamda altmış adet bileşiğin mantar tirozinaz inhibisyonları ile A375 insan melanoma hücreleri, HGF-1 gingival hücre hattı ve MRC-5 hücre hattı üzerinde sitotoksik etkileri araştırılmıştır. Etkin olan bazı bileşiklerin A375 hücrelerinde melanogenez üzerine etkilerini belirlemek için spektrofotometrik yöntem kullanılarak hücrede melanin içeriği incelenmiştir. Böylelikle antitirozinaz etki, antikarsinojen etki ve melanogenez inhibisyonu arasındaki ilişki aydınlatılmaya çalışılmıştır. Anahtar kelimeler: Kojik asit, Mannich reaksiyonu, mantar tirozinazı, melanogenez, sitotoksisite Bu çalışma Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi (Proje No: THD-2015-7392) ve TÜBİTAK (Proje No: 315S067) tarafından desteklenmiştir. viii ABSTRACT Karakaya, G., Synthesis of Mannich Bases of Kojic Acid and Research of Their Antityrosinase Activity and Effects on Human Melanoma Cells. Hacettepe University Health Sciences Institute Ph.D. Thesis in Pharmaceutical Chemistry, Ankara, 2017. Malign melanoma is malign tumour of melanin pigment, which gives colour of skin, eyes and hair. It has an increasing rate of incidence and high mortality. Tyrosinase is the enzyme responsible for melanin production in melanocytes and thereby pigmentation of skin and browning of fruits and vegetables. Abnormal production of melanin causes many problems, especially malign melanoma, hyperpigmentation, post-inflammatory pigmentation, melasma and skin aging. Inhibition of tyrosinase effects melanin production on a large scale. Kojic acid (5- hydroxy-2-hydroxymethyl-4H-pyran-4-one) is a commonly used compound and well known with its antityrosinase property. However, there is need for better industrial applications and derivatives having optimal hydrophilic and lipophilic balance. For this purpose, within the scope of the thesis new fortyeight compounds having structure of 2-substituted-3-hydroxy-6-hydroxymethyl/chloromethyl/methyl/ morpholinomethyl/piperidinylmethyl/pyrrolidinylmethyl-4H-pyran-4-one were synthesized by modifying kojic acid, their structures were identified by using techniques IR, 1H-NMR, 13C-NMR, mass spectroscopy and elementary analysis. Also, some compounds having similar structure and published as a manuscript before, were included the study and totally sixty compounds examined for their mushroom tyrosinase inhibition and cytotoxic effects on A375 human melanoma cells, HGF-1 gingival cell line and MRC-5 cell line. Some of active compounds were also examined for indicating their effects on melanogenesis via intra-cellular melanin content in A375 cells by using a spectrophotometric method. Hereby, the relationship between antityrosinase activity, anticarcinogenic activity and melanogenesis inhibition was tried to clarified. Keywords: Kojic acid, Mannich reaction, mushroom tyrosinase, melanogenesis, cytotoxicity This study is supported by Hacettepe University Scientific Research Fond (Project no: THD-2015- 7392) and TÜBİTAK (Project No:315S067). ix İÇİNDEKİLER ONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN SAYFASI v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER ve KISALTMALAR xi ŞEKİLLER xii TABLOLAR xix 1. GİRİŞ ve AMAÇ 1 2. GENEL BİLGİLER 10 2.1. Kimyasal Çalışmalar 10 2.1.1. Kojik Asit ve Türevlerinin Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri 10 2.1.2. Klorokojik Asit ve Türevlerinin Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri 32 2.1.3. Allomaltol ve Türevlerinin Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri 42 2.2. Spektral Özellikler 47 2.2.1. IR Spektrumları 47 2.2.2. 1H-NMR Spektrumları 47 2.2.3. 13C-NMR Spektrumları 47 2.2.4. Kütle Spektrumları 48 2.3. Biyolojik Aktivite Çalışmaları 49 2.3.1. Mantar Tirozinaz İnhibisyonu 49 2.3.2. Melanogenez ve Malign Melanom 66 2.3.3. Melanom Hücrelerine Sitotoksik Etkiler 68 2.3.4. Diğer Biyolojik Aktiviteler 72 2.4. Biyolojik Aktivite Tayin Yöntemleri 76 2.4.1. Mantar Tirozinaz İnhibisyonu 76 2.4.2. Hücre Kültürü ve Sitotoksisite Çalışmaları 77 2.4.3. Melanogenez Ölçüm Yöntemi 78 x 3. GEREÇ ve YÖNTEM 79 3.1. Kimyasal Çalışmalar 79 3.1.1. Gereç 79 3.1.2. Sentez Yöntemleri 79 3.1.3. Analitik Yöntemler 80 3.1.4. Spektrometrik Kontroller 80 3.1.5. Elemental Analizler 81 3.2. Biyolojik Aktivite Çalışmaları 82 3.2.1. Mantar Tirozinaz Enzim İnhibisyonunun Ölçülmesi 82 3.2.2. Hücre Kültürü Çalışmaları ve SRB Deneyi 83 3.2.3. Melanogenez Ölçüm Yöntemi 85 4. BULGULAR 86 4.1. Kimyasal Çalışmalar 84 4.2. Biyolojik Aktivite Çalışmaları 140 4.2.1. Mantar Tirozinaz İnhibisyonu 140 4.2.2. Hücre Kültürü ve Sitotoksisite Çalışmaları 147 4.2.3. Melanogenez Çalışmaları 167 5. TARTIŞMA 168 5.1. Kimyasal Kısım 168 5.2. Spektral Kısım 174 5.2.1. IR Spektrumları 174 5.2.2.1H-NMR Spektrumları 175 5.2.3. 13C-NMR Spektrumları 179 5.2.4. Kütle Spektrumları 181 5.3. Biyolojik Aktivite Çalışmaları 186 6. SONUÇ ve ÖNERİLER 194 7. KAYNAKLAR 195 8. ÖZGEÇMİŞ xi SİMGELER ve KISALTMALAR ATCC American Type Culture Collection CDI Carbonyldiimidazole CIR The Cosmetic Ingredient Review DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMF Dimetilformamit DMSO Dimetilsülfoksit EC Enzyme Commission EMA European Medicines Agency ESI Elektrosprey İyonizasyon FBS Fetal Bovine Serum FDA Food and Drug Administration HMDSO Hexamethyldisiloxane HGF-1 Human Gingival Fibroblast-1 IC50 Inhibitor Concentration L-DOPA L-3,4-dihidroksifenilalanin MRC-5 Medical Research Council cell strain 5 NCI National Cancer Institute PMB para-Metoksibenzil ROS Reactive Oxygen Species SCCP Scientific Committee on Consumer Products SEER Surveillance, Epidemiology and End Results SRB Sülforodamin B TCA Trikloroasetik asit TFA Trifloroasetik asit THF Tetrahidrofuran THP Tetrahidropiran xii ŞEKİLLER Şekil Sayfa 1.1. Malign melanom tedavisinde kullanılan bazı ilaç etkin maddeleri. 2 1.2. Doğa kaynaklı ve sentetik bazı tirozinaz inhibitörleri. 3 1.3. Bileşiklerin genel sentez şeması. 7 2.1. Kojik asitin yapısı. 10 2.2. Çeşitli hidroksipiron türevleri. 11 2.3. 3-Hidroksi-4H-piran-4-on halkasının tautomerik şekilleri. 11 2.4. Kojik asitin asitliğinin bazı bileşiklerle karşılaştırılması. 12 2.5. Kojik asitin pKa değerleri. 12 2.6. Kojik asitin moleküller arası hidrojen bağları ve bağ uzunlukları. 13 2.7. Kojik asitten hareketle klorokojik asit ve allomaltolün eldesi. 14 2.8. Kojik asit türevi Mannich bazlarının sentezi. 14 2.9. Kojik asitin piperazinilkinolon türevleri ile Mannich reaksiyonu. 15 2.10. Kojik asitin N,N-dietiletilendiamit ile Mannich reaksiyonu. 15 2.11. Kojik asitin çeşitli aminoasitlerle Mannich reaksiyonu. 16 2.12. Kojik asitin 1,4,7-triazasiklononan Mannich reaksiyonu. 17 2.13. Sıcaklığın Mannich reaksiyonuna etkisi. 17 2.14. Kojik asitin 2-etilhekzanal ile reaksiyonu. 17 2.15. Kojik asitten aldol reaksiyonu sonucu elde edilen ürünler. 18 2.16. Piridinon türevi Mannich bazının sentezi. 18 2.17. Kojik asitten piridinon türevlerinin sentezi. 18 2.18. Kojik asitten hareketle piridin karboksilat türevinin sentezi. 18 2.19. Kojik asitten piridinon sentezi. 19 2.20. Kojik asitten hareketle piridintiyon türevlerinin sentezi. 20 2.21. 4-Okso-1,4-dihidropiridazin türevinin sentezi. 20 2.22. Kojik asitten dikarboksilik asit türevlerinin sentezi. 20 2.23. Kojik asitten kiral türevlerin sentezi. 21 2.24. Kojik asitten hareketle antidiyabetik etkili indolil türevlerinin sentezi. 21 2.25. Kojik asitten funikon türevlerinin sentezi. 22 2.26. Kojik asitin pironil akrilik asitle esterleştirilmesi. 22 2.27. Kojil-APPA türevlerinin sentezi. 22 2.28. Enolik hidroksil grubunun O-alkilasyonuna örnek. 23 2.29. Enolik hidroksil grubunun β-diazopropiyonatlar O-alkilasyonu. 23 xiii 2.30. Sinnamat türevi depigmentasyon bileşikleri. 23 2.31. Kojik asitten hareketle nitril türevlerinin sentezi. 24 2.32. Antikanser etkili kojik asit türevlerinin sentezi. 24 2.33. Tirozinaz inhibitörü kojik asit türevlerinin sentezi. 25 2.34. Kojik amin dimerlerinin sentezi. 26 2.35. Kojik asit esterleri. 26 2.36. Kojik asit-tripeptit yapısındaki bileşiklerin sentezi. 27 2.37. Kojik asit-fenilalanin amit yapısındaki bileşiklerin sentezi. 27 2.38. Kojik asit türevi doğal olmayan α-aminoasitin sentezi. 28 2.39. Kojik asitin Ru komplekslerinin sentezi. 29 2.40. Kojik asit vanadyum kompleksinin yapısı. 30 2.41. Kojik asitin çeşitli metallerle komplekslerinin sentezi. 30 2.42. Kojik asitin NO dağıtıcı özellikteki kompleksi. 31 2.43. Kojik asitin radyoprotektör özellikteki kompleksleri. 32 2.44. Klorokojik asitin sentezi. 32 2.45. Klorokojik asitin nükleofilik sübstitüsyonu. 33 2.46. Klorokojik asitin tautomerleri. 33 2.47. Mannich bazı yapısı taşıyan türevler. 34 2.48. Klorokojik asitten hareketle Mannich bazlarının sentezi. 34 2.49. Klorokojik asitten hareketle kojik aminin sentezi. 34 2.50. Klorokojik asitten hareketle pestisit/insektisit türevlerin sentezi. 35 2.51. Klorokojik asitten hareketle kükürtlü türevlerin sentezi. 35 2.52. Klorokojik asitin çeşitli nükleofillerle reaksiyonu. 36 2.53. 6-Bromoklorokojik asitin sentezi. 36 2.54. Klorokojik asit türevi kondanse bileşiklerin sentezi. 37 2.55. Klorokojik asit türevi imidazol ve benzimidazol tuzlarının sentezi. 37 2.56. 2-Merkapto-1-metilimidazol türevlerinin sentezi. 38 2.57. Çeşitli tirozinaz inhibitörlerinin sentezi. 39 2.58. Hipoglisemik etkili türevlerin sentezi. 40 2.59. Klorokojik asitin Fe ile kompleksi. 41 2.60. Klorokojik asitin kitosanla konjugasyonu. 41 2.61. Allomaltolün sentezi. 42 2.62. İyodokojik asitten hareketle allomaltol eldesi. 42 2.63. Allomaltol türevi Mannich bazları. 43 xiv 2.64. Allomaltol türevi ve piridinon türevi Mannich bazları. 43 2.65. Allomaltol türevlerinin Claisen düzenlenmesi. 44 2.66. Allomaltolün iyonik sıvılardaki reaksiyonlarına örnekler. 44 2.67. Allomaltolden piridinonlara geçiş. 45 2.68. Analjezik ve antiinflamatuvar etkili piridinon türevleri. 45 2.69. Allomaltol türevlerinin Ru kompleksleri. 46 2.70. Allomaltol ve tiyoallomaltolün Mannich bazlarının kompleksleri. 46 2.71. Allomaltolün Rh kompleksleri. 47 2.72. Kojik asitin moleküler parçalanması. 48 2.73. Tirozinaz enziminin binükleer bakır aktif merkezi (C). 50 2.74. Melanin pigmentinin biyosentetik yolağı. 50 2.75. Tirozinaz enziminin öngörülen katalitik mekanizması. 51 2.76. Güncel sentetik tirozinaz inhibitörleri. 53 2.77. Güncel doğa kaynaklı tirozinaz inhibitörleri. 55 2.78. Antitirozinaz etkili bazı kojik asit türevleri. 57 2.79. Kojil-APPA. 58 2.80. Kojik asit-peptit türevi. 58 2.81. Etilen köprüsü içeren tirozinaz inhibitörü. 59 2.82. Tirozinaz inhibitörü tasarımına örnek. 60 2.83. Kojik asit-metimazol türevi. 60 2.84. Kojik asit-aminoasit amit türevi. 61 2.85. Kükürt içeren tirozinaz inhibitörleri. 61 2.86. Bacillus subtilis ile elde edilen kojik asit esteri. 61 2.87. Bazı ester türevlerinde yapı-etki ilişkisi. 62 2.88. Troloks grubu içeren kojik asit türevi. 62 2.89. Kojik asit monooleat. 63 2.90. Piridinon türevi tirozinaz inhibitörü. 63 2.91. Piridinon türevinin aminoasit konjugatı. 63 2.92. Allomaltol türevi esterler. 64 2.93. Kojik asit-fenilalanin amit yapısındaki bileşiğin metal kompleksi. 64 2.94. Melanosit ve keratinosit hücrelerinin derideki gösterimi. 66 2.95. Kojik asitin stiril ve kinolin türevleri. 72 2.96. Dopakinonun eldesi. 77 3.1. Işık mikroskobunda görüntülenen A375 hücreleri (10X). 83 xv 3.2. Işık mikroskobunda görüntülenen HGF-1 hücreleri (10X). 84 4.1. Mantar tirozinazının artan kojik asit dozlarına karşı inhibisyon grafiği. 140 4.2. Bileşik 3 ve kojik asitin mantar tirozinazı üzerine inhibitör etkisi. 140 4.3. Bileşik 43, 45, 53, 55 ve klorokojik asitin mantar tirozinazı üzerine 141 inhibitör etkisi. 4.4. Bileşik 21, 23, 25 ve allomaltolün mantar tirozinazı üzerine 141 inhibitör etkisi. 4.5. Mantar tirozinaz inhibisyonu yüksek olan Bileşik 3, 23, 53’ün 142 kojik asit ile inhibisyon etkisinin kıyaslanması. 4.6. Vemurafenibin A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 149 görüntüleri. 4.7. Vemurafenibin HGF-1 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 149 görüntüleri. 4.8. Vemurafenibin A375 ve HGF-1 hücrelerindeki % canlılık grafikleri. 149 4.9. Bileşik 13’ün A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 150 görüntüleri. 4.10. Bileşik 13’ün HGF-1 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 150 görüntüleri. 4.11. Bileşik 13’ün A375 ve HGF-1 hücrelerindeki % canlılık grafikleri. 150 4.12. Bileşik 43’ün A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 151 görüntüleri. 4.13. Bileşik 43’ün HGF-1 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 151 görüntüleri. 4.14. Bileşik 43’ün A375 ve HGF-1 hücrelerindeki % canlılık grafikleri. 151 4.15. Bileşik 14’ün A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 152 görüntüleri. 4.16. Bileşik 14’ün HGF-1 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 152 görüntüleri. 4.17. Bileşik 14’ün A375 ve HGF-1 hücrelerindeki % canlılık grafikleri. 152 4.18. Bileşik 18’in A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 153 görüntüleri. 4.19. Bileşik 18’in HGF-1 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 153 görüntüleri. 4.20. Bileşik 18’in A375 ve HGF-1 hücrelerindeki % canlılık grafikleri. 153 4.21. Bileşik 53’ün A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 154 xvi görüntüleri. 4.22. Bileşik 53’ün HGF-1 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 154 görüntüleri. 4.23. Bileşik 53’ün A375 ve HGF-1 hücrelerindeki % canlılık grafikleri. 154 4.24. Bileşik 11’in A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 155 görüntüleri. 4.25. Bileşik 11’in HGF-1 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 155 görüntüleri. 4.26. Bileşik 11’in A375 ve HGF-1 hücrelerindeki % canlılık grafikleri. 155 4.27. Bileşik 20’nin A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 156 görüntüleri. 4.28. Bileşik 20’nin HGF-1 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 156 görüntüleri. 4.29. Bileşik 20’nin A375 ve HGF-1 hücrelerindeki % canlılık grafikleri. 156 4.30. Bileşik 17’nin A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 157 görüntüleri. 4.31. Bileşik 17’nin HGF-1 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 157 görüntüleri. 4.32. Bileşik 17’nin A375 ve HGF-1 hücrelerindeki % canlılık grafikleri. 157 4.33. Bileşik 3’ün A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 158 görüntüleri. 4.34. Bileşik 3’ün HGF-1 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 158 görüntüleri. 4.35. Bileşik 3’ün A375 ve HGF-1 hücrelerindeki % canlılık grafikleri. 158 4.36. Bileşik 58’in A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 159 görüntüleri. 4.37. Bileşik 58’in HGF-1 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 159 görüntüleri. 4.38. Bileşik 58’in A375 ve HGF-1 hücrelerindeki % canlılık grafikleri. 159 4.39. Bileşik 23’ün A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 160 görüntüleri. 4.40. Bileşik 23’ün HGF-1 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 160 görüntüleri. 4.41. Bileşik 23’ün A375 ve HGF-1 hücrelerindeki % canlılık grafikleri. 160 xvii 4.42. Klorokojik asitin A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 161 görüntüleri. 4.43. Klorokojik asitin HGF-1 hücreleri üzerine etkisinin 161 mikroskop (10X) görüntüleri. 4.44. Klorokojik asitin A375 ve HGF-1 hücrelerindeki % canlılık 161 grafikleri. 4.45. Kojik asitin A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 162 görüntüleri. 4.46. Kojik asitin A375 hücrelerindeki % canlılık grafiği. 162 4.47. Allomaltolün A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 163 görüntüleri. 4.48. Allomaltolün A375 hücrelerindeki % canlılık grafiği. 163 4.49. Dakarbazinin A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 164 görüntüleri. 4.50. Dakarbazinin A375 hücrelerindeki % canlılık grafiği. 164 4.51. Temozolomidin A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop 165 (10X) görüntüleri. 4.52. Temozolomidin A375 hücrelerindeki % canlılık grafiği. 165 4.53. Lenalidomidin A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop 166 (10X) görüntüleri. 4.54. Fotemustinin A375 hücreleri üzerine etkisinin mikroskop (10X) 166 görüntüleri. 4.55. Bazı bileşiklerin A375 hücrelerinde melanin içeriğinin 167 kontrol grubu ve vemurafenible kıyaslanması. 5.1. Klorokojik asitin sentez mekanizması. 169 5.2. Klorokojik asit ve allomaltolün oksidasyon sayıları. 170 5.3. Mannich bazlarının sentez mekanizması. 171 5.4. Morfolin, piperidin ve pirolidin türevlerinin sentezi. 172 5.5. Morfolin, piperidin ve pirolidin türevlerinin sentez mekanizması. 173 5.6. Bileşik 23’e ait FT-IR spektrumu. 174 5.7. Bileşik 23’ün DMSO-d6 içinde alınan 1H-NMR spektrumu. 177 5.8. Bileşik 23’ün fenil hidrojenlerine ait pikler ve yarılmaları. 178 5.9. Bileşik 33, 43 ve 53’e ait 1H-NMR spektrumlarındaki 179 xviii aromatik bölgeler. 5.10. Bileşik 23’ün DMSO-d6 içinde alınan 13C-NMR spektrumu. 180 5.11. Bileşik 23’ün DMSO-d6 içinde alınan 13C-NMR spektrumundaki 181 kimyasal kayma değerleri. 5.12. Bileşik 1'in ESI-MS tekniği ile alınan kütle spektrumu. 182 5.13. Bileşik 1’in ESI-MS kütle spektrumunda öngörülen 183 parçalanma ürünleri. 5.14. Bileşik 53'ün ESI-MS tekniği ile alınan kütle spektrumu. 184 5.15. Bileşik 30 ve 40'ın ESI-MS tekniği ile alınan kütle spektrumları. 185 5.16. Tez kapsamındaki bileşiklerin genel yapısı. 186 5.17. Tirozinaz inhibisyonunda en aktif bileşikler. 188 5.18. Sentezlenen bileşiklerin mantar tirozinaz enzim inhibisyonu 189 IC50 değerlerinin grafikle gösterimi (µM). xix TABLOLAR Tablo Sayfa 1.1. Bileşiklerin yapıları, kapalı formülleri, molekül ağırlıkları 8 ve erime dereceleri. 4.1. Bazı bileşikler, klorokojik asit ve allomaltolün 492 nm’de ölçülen 142 absorbans, %inhibisyon ve ortalama değerleri 4.2. Sentezlenen bileşiklerin mantar tirozinaz enzim inhibisyonu IC50 146 değerleri (µM) 4.3. Bileşiklerin A375 hücrelerine karşı sitotoksisite IC50 değerleri 147 (µM) 4.4. Bileşiklerin A375, HGF-1 ve MRC-5 hücre hatlarına karşı 148 sitotoksisite IC50 değerleri (µM) 5.1. Tez kapsamında sentezlenen bileşiklerin yapılarının ve 193 numaralarının toplu gösterilişi. 1 1. GİRİŞ ve AMAÇ Melanin, cilt renginden sorumlu pigment olup ultraviyole (UV) ışınlarının hasarına karşı cildin korunmasında önemli bir rol oynamaktadır. İnsanlar dışında mikroorganizmalar, bitkiler ve hayvanlara kadar birçok canlıda bulunan önemli pigmentlerden biridir. Melanosit adlı hücrelerde üretilip melanozomlarda depolanmakta ve keratinosit adlı hücrelerin çekirdekleri üzerinde toplanmaktadırlar. Cildi, güneş ışınlarını absorbe ederek ve reaktif oksijen türlerini (ROS) uzaklaştırarak fotokarsinogeneze karşı korumaktadırlar (1-4). Dolayısıyla bu pigmentler, güneş ışığının UV ışımasına aşırı maruziyet sonucu meydana gelen melanin üretiminde patolojik artış gibi zararlı etkilere karşı önemli savunma rolü üstlenmektedir (5). Pek çok hastalık durumunda, melanositlerin fonksiyonlarının bozulması sonucu melanin biyosentezinde değişiklikler meydana gelmektedir. Buna bağlı olarak hiperpigmentasyon veya depigmentasyon denilen durumlar oluşabilmektedir. Melanin pigmentasyonunun aşırı düzeyleri, hiperpigmentasyon içeren yaşa bağlı lentigo, melazma, postinflamatuvar melanoderma, çil ve yaşlılık lekeleri gibi estetik sorunları da beraberinde getiren çeşitli dermatolojik bozukluklara neden olmaktadır (4, 6). Malign melanom, melanositler ve nevüs (ben) hücrelerinin malign tümörü olup deri kanserlerinin yaklaşık %2’sini oluşturmaktadır. Tüm dünyada görülme sıklığı hızla artış gösteren ve mortalitesi yüksek olan bir kanser türüdür. Günümüzde melanomun standart tedavisinde dakarbazin, temozolomit, fotemustin, sisplatin, karboplatin, vinka alkaloitleri ve taksanlar gibi kemoterapötik ajanlar kullanılmaktadır. Ancak bu ilaçların hem sınırlı etkileri hem de önemli yan etkilerinden dolayı, son zamanlarda bunların yanı sıra interlökin-2 ve interferonlar da tedavi rejimlerinde yer almaktadır (7). Avrupa İlaç Dairesi-European Medicines Agency (EMA) 2011 yılında ipilimumab, 2012 yılında da vemurafenib etkin maddelerini içeren ilaçları, melanomun tedavisinde kullanılmak üzere onaylamıştır (Şekil 1.1.). Ayrıca, ileri düzeydeki melanomların tedavisi için genetik olarak modifiye edilmiş herpes simplex virüsü “talimogene laherparepvec (T-VEC)” de 2015 yılında FDA tarafından onaylanmış ilk ve tek onkolitik viral tedavi ürünüdür (8). 2 N N H NH N N CH3 CH3 O NH2 Dakarbazin N N N N N O NH2 H3C O Temozolomit Cl N O N H CH3 P O OO CH3 CH3 N O Fotemustin N N H Cl O HN S CH3 O O F F Vemurafenib Şekil 1.1. Malign melanomun tedavisinde kullanılan bazı ilaç etkin maddeleri. Coğrafi konumu nedeni ile ülkemizde güneşe maruziyetin yüksek olduğu ve özellikle kırsal kesimde açık alanda çalışmanın (tarım/çiftçilik vb.) yoğun olduğu dikkate alınırsa nüfusun melanom açısından önemli bir risk taşıdığı söylenebilir. Melanom ile mücadelede hastalık hakkında toplumda farkındalık yaratmak ve riskli grupları, koruyucu önlemleri tanımlamak ve halka tanıtmak gereklidir. Tirozinaz (EC 1.14.18.1, polifenol oksidaz) bakteriler, funguslar, yüksek yapılı bitkiler (özellikle mantar, muz, elma, armut, patates, avokado ve şeftali gibi) ve hayvanlar dahil olmak üzere doğada yaygın olarak bulunan ve melanin adlı pigmentin biyosentezinden sorumlu enzimdir (9). İnsanlarda pigmentasyon bozuklukları ve diğer melanin ile ilgili sağlık sorunlarının önlenmesi ve tedavisinde, gerek sentetik gerekse doğa kaynaklı olmak üzere güvenli ve etkili tirozinaz inhibitörleri kullanılması bilinen bir yöntemdir (2). Hiperpigmentasyonu gidermek amacıyla kullanılan tirozinaz inhibitörlerinin çoğu, yapısal olarak tirozin veya L-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA)’ya benzeyen fenol veya kateşol türevleridir (Şekil 1.2.) (2, 4). 3 Doğa kaynaklı inhibitörler Sentetik inhibitörler O O OH HO Kojik asit Azelaik asit HO O O OH Anisaldehit L-Mimozin CHO OCH3 O OH NH2 HOOC OH OH OMe O Metil gentisat HO HO OH HO HO OH HO Resveratrol Oksiresveratrol O OH HO HO OH O OH Arbutin OH OH Hidrokinon OH O HO Glikolik asit Kaptopril Tropolon N COOHO HS CH3 O OH Dopastin N H O N NO OH Şekil 1.2. Doğa kaynaklı ve sentetik bazı tirozinaz inhibitörleri. Tirozinaz inhibisyonu çalışmalarında mantar (mushroom) tirozinazı, araştırmacılar tarafından, ticari olarak kolay erişilebilir olduğundan yaygın olarak kullanılmaktadır. Agaricus bisporus adlı mantardan elde edilen bu enzim kolaylıkla saflaştırılabilmektedir. İnhibisyon gücü, mekanizması, kimyasal yapıları veya inhibitörlerin kaynakları açısından ayırt edilmeksizin çok farklı türde inhibitör, mantar tirozinazı üzerine yapılan çalışmalarla araştırılmaktadır (10-12). Melanin sentezinde meydana gelen değişiklikler, hızla artan sıklığa sahip malign melanoma özgü, klinik ve histopatolojik özelliklerden sorumlu olabilmektedir. Bu nedenle cilt kanserlerinin ve melanin hiperpigmentasyonuyla ilişkili bazı dermatolojik bozuklukların tedavisinde tirozinaz inhibitörlerinin klinik olarak faydalı olabileceği düşünülmektedir. 4 Endüstrideki önemine bağlı olarak kojik asit (5-hidroksi-2-(hidroksimeti1)- 4H-piran-4-on) üretimi giderek artmakta, biyosenteziyle ilgili kayda değer sayıda çalışma yürütülmekte ve birçok yayında, kojik asitin kimyasal ve biyolojik özellikleri incelenmektedir. Kozmetik, tıp, gıda, tarım ve kimya endüstrilerinde çok geniş bir alanda kojik asitin uygulamaları bulunmaktadır. Kozmetik sektöründe hem antioksidan işleviyle hem de UV ışımadan koruyan ve pigmentasyona neden olan tirozinaz enziminin aktivitelerini önleyen bir inhibitör madde olarak kullanılmaktadır (13). Özellikle yüz ve boyun kremleri, pudralar ve losyonlar gibi durulanmayan ürün formülasyonlarında bulunan kojik asit için Kozmetik Bileşenleri Derleme Uzman Paneli-Cosmetic Ingredient Review (CIR) Expert Panel tarafından belirtildiği üzere bitmiş üründe %0,1 ile %2 konsantrasyonlarında kullanılmaktadır (14). Tıp alanında ise güçlü bir antibakteriyel, antimikrobiyal, antiviral, antilösemik ve antifungal aktivite gösterdiği kaydedilmiştir (15-23). Kanser tedavisinde A375 insan malign melanom hücreleri kullanılarak kojik asitin genotoksisitesi ve söz konusu hücrelerin büyüme inhibisyonu üzerine etkisi incelenmiştir. Kojik asit konsantrasyonunun artmasıyla bu hücrelerin büyümelerinin de direkt olarak inhibe olduğu gösterilmiştir (24). Başka bir çalışmada ise A375 hücre hattında kojik asitin antikanserojen etkisini incelemek amacıyla proteomik analiz yapılmış ve kojik asit uygulanan hücrelerde bazı proteinlerin kanser progresyonunda önemli rol oynadığı, dolayısıyla malign melanomun tanı ve tedavisinde önemli belirleyiciler olarak kullanılabileceği önerilmiştir (25). Ancak kojik asit ve birçok türevinin yağda çözünürlüğünün yani lipofilisitesinin düşük olması ve uzun süreli saklama koşullarında yüksek sıcaklığa karşı dayanıksız olmaları gibi stabilite problemleri bulunmaktadır. Lipofilisitesi yüksek bileşikler elde etmek amacıyla bileşiklerin Mannich bazlarının sentezlenmesi organik kimyada bilinen bir yöntemdir. Elde edilen hidrofobik yapı ile hücre içine permeabilitenin artması sağlanmıştır. Ayrıca antikanserojen özellikteki Mannich bazlarının hücresel hidroksil ve amin gruplarını alkillememelerinden dolayı klinik olarak kullanılan alkilleyici ajanlara göre mutajenisite ve genotoksisiteye neden olmamaları açısından üstünlükleri olduğu bilinmektedir (26). Fenolik Mannich bazlarının ise meme, böbrek, prostat, akciğer, kolon kanseri ve melanom gibi çeşitli kanser türleri üzerinde etkili oldukları 5 saptanmıştır (27). Dolayısıyla literatürde antikanserojen aktivitesi çalışılan çok sayıda Mannich bazı mevcuttur (28-32). Önemli farmakoforlar veya biyoaktif öncü moleküller olarak aminoalkil zincir taşıyan ve yüksek tıbbi değere sahip olması beklenen çeşitli moleküllerin sentezinde Mannich bazlarının, kullanılması amaçlanmaktadır. Klinik olarak kullanımı bulunan ve aminoalkil zincir taşıyan Mannich bazlarına ise kokain, fluoksietin, atropin, etakrinik asit, triheksilfenidil, prosiklidin, ranitidin ve biperiden örnek olarak verilebilir (33). Laboratuvarımızda başlatılan ve yirmi yılı aşkın süredir kojik asit, klorokojik asit (5-hidroksi-2-(klorometi1)-4H-piran-4-on) ve allomaltol (5-hidroksi-2-meti1-4H- piran-4-on) den hareketle sentezlediğimiz hidroksipiron türevi Mannich bazları üzerinde yürütülen çalışmalarda, bu maddelerin antikonvülsan, antibakteriyel, antifungal ve antiviral aktiviteler dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik aktiviteleri incelenmiştir. Söz konusu çalışmaların sonucunda elde edilen Mannich bazları, gerek aktivite gerekse sitotoksisite bakımından başlangıç maddelerinden daha etkili ve daha az toksik bileşikler olarak kaydedilmiştir (18-23, 34-39). Birçok çalışmada antikanserojen özellik gösteren bileşiklerin yapısında morfolin, piperidin, piperazin, pirol, piridin, pirolidin gibi heteroatom taşıyan siklik gruplar bulunduğu bilgisinden yola çıkılarak, tez çalışmaları kapsamında, kojik asitin 6 numaralı konumunda bulunan alkolik hidroksil grubunun biyoizosteri olarak amin grupları hedeflenmiştir. Bu doğrultuda, kojik asit, klorokojik asit ve allomaltolden hareketle sentezlenen Mannich bazlarının yanı sıra 2-sübstitüe-3-hidroksi-6- morfolinometil/piperidinilmetil/pirolidinilmetil-4H-piran-4-on yapısı taşıyan yeni kırk sekiz adet Mannich bazının sentezlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmada bütünlük sağlaması amacıyla yapıca benzer, daha önce yayın haline getirilmiş bileşikler de tez kapsamına alınıp yeniden sentezlenerek toplam altmış adet bileşiğin ve başlangıç maddeleri olan kojik asit, klorokojik asit ve allomaltolün A375 insan melanoma hücreleri üzerine sitotoksik etkileri ve tirozinaz enzim inhibisyonları araştırılmıştır. Melanom hücreleri üzerinde en fazla sitotoksik etki gösteren yirmi beş bileşiğin, sağlıklı insan hücre hatları olan HGF-1 (insan gingival fibroblast) ve MRC-5 (insan akciğer fibroblast) üzerindeki etkileri çalışılmıştır. Sentezi yapılan bileşiklerin yapıları IR, 1H-NMR, 13C-NMR ve kütle spektroskopisi yöntemleri ve elemental analiz 6 sonuçları ile kanıtlanmıştır. Bu bileşiklerin hücre canlılığı üzerine etkileri, A375 insan melanom hücrelerinde (ATCC CRL-1619) 48 saat inkübasyon sonrasında ELISA Plaka okuyucu ile sitotoksisite düzeyi spektrofotometrik olarak Sülforodamin B (SRB) testi ile belirlenmiştir. Tüm deneyler dört tekrar olacak şekilde çalışılmış, non-lineer regresyon grafikleri ve istatistik değerlendirme GraphPadPrism v. 5.03 kullanılarak yapılmıştır. Tirozinaz enzim inhibisyonları ise L-DOPA’nın substrat olarak kullanıldığı spektrofotometrik yöntemle tayin edilmiştir. Ayrıca seçilen bileşiklerin A375 hücrelerinde melanogenez etkinliğini belirlemek için spektrofotometrik yöntem kullanılarak hücrede melanin içeriği incelenmiştir. Çalışmadaki sentezin ilk basamağı; kojik asidin klorlanması sonucu klorokojik asidin sentezlenmesi ve klorokojik asitin çinko tozu ve hidroklorik asitle indirgenmesiyle allomaltolün elde edilişini kapsamaktadır. İkinci basamak olarak, elde edilen hidroksipiron türevi başlangıç maddelerinin her biri (kojik asit, klorokojik asit ve allomaltol), on adet farklı yapıdaki halojen substitüe benzil piperazin türevleri ile tepkimeye sokularak Mannich bazları sentezlenmiştir. En son aşama olarak da klorokojik asit türevi Mannich bazlarının klor atomlarının morfolin, piperidin veya pirolidin gruplarıyla yer değiştirmesiyle yeni türevlerin sentezlenmesi gerçekleştirilmiştir. Bileşiklerin genel sentez şeması aşağıda verilmiştir (Şekil 1.3.). Sentezi yapılan bileşiklerin yapıları, bileşiklere ait kapalı formül, molekül ağırlığı ve erime dereceleri ise Tablo 1.1.’de gösterilmiştir. 7 Ş ek il 1 .3 . B il eş ik le ri n g en el s en te z şe m as ı. OO O H H O S O C l 2 OO O H C l Z n /H C l -H 2 O OO O H H 3 C A ll o m a lt o l tr v . b il e şi k le r K o ji k a si t K lo ro k o ji k a si t A ll o m a lt o l OO O H H 3 C N N R ' m o rf o li n p ip e ri d in p ir o li d in M o r fo li n t ü r e v i b il e şi k le r P ip e r id in t ü r e v i b il e şi k le r P ir o li d in t ü r e v i b il e şi k le r OO O H N N N R ' OO O H N N N R ' OO O H N N N R ' O S u b st it ü e b e n z il p ip e ra z in e t rv ., fo rm a ld e h it M e O H OO O H N N R ' C l K lo r o k o ji k a si t tr v . b il e şi k le r S u b st it ü e b e n z il p ip e ra z in e t rv ., fo rm a ld e h it M e O H S u b st it ü e b e n z il p ip e ra z in e t rv ., fo rm a ld e h it M e O H OO O H N N R ' H O K o ji k a si t tr v . b il e şi k le r (B il e şi k 1 -1 0 ) (B il e şi k 1 1 -2 0 ) (B il e şi k 2 1 -3 0 ) (B il e şi k 3 1 -4 0 ) (B il e şi k 4 1 -5 0 ) (B il e şi k 5 1 -6 0 ) K 2 C O 3 D M F K 2 C O 3 D M F K 2 C O 3 D M F 8 Tablo 1.1. Bileşiklerin yapıları, kapalı formülleri, molekül ağırlıkları ve erime dereceleri. O O OH R N N R' Bileşik R R' Kapalı Formülü Molekül Ağırlığı (g/mol) Erime Derecesi (ºC) 1 -CH2OH 3-klorobenzil C18H21ClN2O4 364.82 170-1 2a -CH2OH 4-klorobenzil C18H21ClN2O4 364.82 Dek. 3b -CH2OH 3,4-diklorobenzil C18H20Cl2N2O4 399.27 180-1 4b -CH2OH 2,6-diklorobenzil C18H20Cl2N2O4 399.27 196-7 5 -CH2OH 4-florobenzil C18H21FN2O4 348.37 187-8 6 -CH2OH 2,5-diflorobenzil C18H20F2N2O4 366.36 176-7 7a -CH2OH 3-triflorometilbenzil C19H21F3N2O4 398.38 183-4 8a -CH2OH 4-triflorometilbenzil C19H21F3N2O4 398.38 186-7 9 -CH2OH 2-floro-6-klorobenzil C18H20ClFN2O4 382.81 184-5 10 -CH2OH 2-floro-4-bromobenzil C18H20BrFN2O4 427.26 Dek. 11c -CH2Cl 3-klorobenzil C18H20Cl2N2O3 383.27 147-8 12d -CH2Cl 4-klorobenzil C18H20Cl2N2O3 383.27 168-9 13e -CH2Cl 3,4-diklorobenzil C18H19Cl3N2O3 417.71 147-8 14d -CH2Cl 2,6-diklorobenzil C18H19Cl3N2O3 417.71 167-9 15e -CH2Cl 4-florobenzil C18H20ClFN2O3 366.81 157-8 16d -CH2Cl 2,5-diflorobenzil C18H19F2N2O3 384.81 151-2 17d -CH2Cl 3-triflorometilbenzil C19H20ClF3N2O3 416.82 161-2 18d -CH2Cl 4-triflorometilbenzil C19H20ClF3N2O3 416.82 150-1 19 -CH2Cl 2-floro-6-klorobenzil C18H19Cl2FN2O3 401.26 158-9 20 -CH2Cl 2-floro-4-bromobenzil C18H19BrFN2O3 445.71 167-8 21f -CH3 3-klorobenzil C18H21ClN2O3 348.82 158-9 22g -CH3 4-klorobenzil C18H21ClN2O3 348.82 165-7 23 -CH3 3,4-diklorobenzil C18H20Cl2N2O3 383.27 160-2 24 -CH3 2,6-diklorobenzil C18H20Cl2N2O3 383.27 165-6 25 -CH3 4-florobenzil C18H21FN2O3 332.37 168-70 26 -CH3 2,5-diflorobenzil C18H20F2N2O3 350.36 163-5 27 -CH3 3-triflorometilbenzil C19H21F3N2O3 382.38 171-2 28 -CH3 4-triflorometilbenzil C19H21F3N2O3 382.38 171-2 29 -CH3 2-floro-6-klorobenzil C18H20ClFN2O3 366.81 153-5 30 -CH3 2-floro-4-bromobenzil C18H20BrFN2O3 411.27 180-1 31 morfolinometil 3-klorobenzil C22H28ClN3O4 433.93 137-8 32 morfolinometil 4-klorobenzil C22H28ClN3O4 433.93 143-5 33 morfolinometil 3,4-diklorobenzil C22H27Cl2N3O4 468.37 142-4 34 morfolinometil 2,6-diklorobenzil C22H27Cl2N3O4 468.37 158-9 35 morfolinometil 4-florobenzil C22H28FN3O4 417.47 156-7 36 morfolinometil 2,5-diflorobenzil C22H27F2N3O4 435.46 107-8 37 morfolinometil 3-triflorometilbenzil C23H28F3N3O4 467.48 142-4 38 morfolinometil 4-triflorometilbenzil C23H28F3N3O4 467.48 162-3 39 morfolinometil 2-floro-6-klorobenzil C22H27ClFN3O4 451.92 144-5 40 morfolinometil 2-floro-4-bromobenzil C22H27BrFN3O4 495.11 159-61 a (40), b (41), c (42), d (23), e (22), f Ticari olarak satılmaktadır, CAS registry number: 1324058-46-9, g (43) 9 Tablo 1.1. (Devamı) Bileşiklerin yapıları, kapalı formülleri, molekül ağırlıkları ve erime dereceleri. Bileşik R R' Kapalı Formülü Molekül Ağırlığı (g/mol) Erime Derecesi (ºC) 41 piperidinilmetil 3-klorobenzil C23H30ClN3O3 431.96 145-7 42 piperidinilmetil 4-klorobenzil C23H30ClN3O3 431.96 165-6 43 piperidinilmetil 3,4-diklorobenzil C23H29Cl2N3O3 466.40 151-2 44 piperidinilmetil 2,6-diklorobenzil C23H29Cl2N3O3 466.40 160-1 45 piperidinilmetil 4-florobenzil C23H30FN3O3 401.47 159-60 46 piperidinilmetil 2,5-diflorobenzil C23H29F2N3O3 433.49 102-4 47 piperidinilmetil 3-triflorometilbenzil C24H30F3N3O3 465.51 156-7 48 piperidinilmetil 4-triflorometilbenzil C24H30F3N3O3 465.51 160-1 49 piperidinilmetil 2-floro-6-klorobenzil C23H29ClFN3O3 449.95 140-2 50 piperidinilmetil 2-floro-4-bromobenzil C23H29BrFN3O3 494.40 163-4 51 pirolidinilmetil 3-klorobenzil C22H28ClN3O3 417.93 134-5 52 pirolidinilmetil 4-klorobenzil C22H28ClN3O3 417.93 168-9 53 pirolidinilmetil 3,4-diklorobenzil C22H27Cl2N3O3 452.37 143-4 54 pirolidinilmetil 2,6-diklorobenzil C22H27Cl2N3O3 452.37 147-9 55 pirolidinilmetil 4-florobenzil C22H28FN3O3 401.47 147-9 56 pirolidinilmetil 2,5-diflorobenzil C22H27F2N3O3 419.46 108-10 57 pirolidinilmetil 3-triflorometilbenzil C23H28F3N3O3 451.48 154-5 58 pirolidinilmetil 4-triflorometilbenzil C23H28F3N3O3 451.48 154-6 59 pirolidinilmetil 2-floro-6-klorobenzil C22H27ClFN3O3 435.92 120-1 60 pirolidinilmetil 2-floro-4-bromobenzil C22H27BrFN3O3 480.37 157-8 a (40), b (41), c (42), d (23), e (22), f Ticari olarak satılmaktadır, CAS registry number: 1324058-46-9, g (43) 10 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Kimyasal Çalışmalar 2.1.1. Kojik Asit ve Türevlerinin Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri Kojik asit, sahip olduğu çok fonksiyonlu heterosiklik yapısı ve fizikokimyasal özellikleri ile birçok reaksiyona olanak sağlayan, değişik biyolojik aktivitelere sahip ve önemli merkezler içeren fungal bir metabolittir (17, 44). Bu yüzden 20. yüzyılın başlarından beri, kojik asit ilgi çeken araştırma konularından biri olmuş ve birçok türevi sentezlenmiştir. Kojik asitin ana iskeleti, yapısında iki adet çifte bağ taşıyan karbon halkasından oluşan monosiklik piron halkasıdır (Şekil 2.1.). Fiziksel özellikleri açısından bakıldığında beyaz kristaller veya açık sarı kristal yapıdaki tozlardan oluşan ve kokusuz özellikteki bir maddedir. Erime derecesi 153-4°C, pKa değeri ise 7,90 ve 8,03 olarak verilmektedir. Su (43,85 g/L), aseton, etil asetat ve piridinde çözünür, etanolde az çözünür, dietil eter, kloroform veya benzende ise çözünmez özelliktedir. Piron halkasının 5 numaralı konumunda bulunan hidroksil grubu zayıf asidik özellik göstermektedir. Çoklu işleve sahip heterosiklik yapısından dolayı, katım, alkilasyon, açilasyon, oksidasyon, halka açılması, nükleofilik ve elektrofilik substitüsyon gibi çok çeşitli reaksiyon türlerini kapsayan önemli reaksiyon merkezlerini içermektedir (9). O O OH HO 1 2 3 4 5 6 Şekil 2.1. Kojik asitin yapısı. Kojik asit, 1907 yılında Saito tarafından, buharda pişirilmiş pirinç üzerindeki Aspergillus oryzae miselleri üzerinde keşfedilmiş, bundan sonra da yapısı 1924 yılında Yabuta tarafından aydınlatılmıştır. 1930’da D-glukozdan kimyasal sentez yoluyla elde edilmiştir. Kojik asit; klorokojik asit, allomaltol ve piromekonik asit (5-hidroksi-4H- piran-4-on) gibi potent türevlerin geliştirilebildiği, modifikasyonlara uygun bir yapıya sahiptir (45). 11 O O OH Klorokojik asit O O OH Allomaltol H3CO O OH Kojik asit HO Cl O O OH Piromekonik asit Şekil 2.2. Çeşitli hidroksipiron türevleri. 3-Hidroksi-4H-piran-4-on halkasının düzlemsel olması ve 6 elektronu taşıması nedeniyle aromatik özelliğe sahip olduğu, çeşitli elektrofilik bileşiklerle yapılan reaksiyonlar sonucunda hidroksil grubuna göre orto konumundan elektrofilik sübstitüsyona uğradığı, düşük elektron yoğunluğu nedeniyle para konumundan nükleofilik reaksiyona girdiği bildirilmiştir (46). Kojik asitin genel iskeletinin iki adet tautomerik şekli vardır. Nötral moleküllerde en kararlı tautomer şekli, enol şeklinin olduğu ve bu yapıların molekül içi hidrojen bağıyla kararlı hale getirildiği bulunmuştur. Keto şekillerinin ise gaz fazındaki konsantrasyonuna kıyasla protik çözücülerde daha çok oluştuğu gözlenmiş, bunun nedeni olarak da çözücüyle molekül arasında oluşan etkileşimlerin, molekülü daha dayanıklı kılması olarak belirtilmiştir. Eğer yapıda bir protonlanma olacak ise de bunun halka içi oksijen yerine, keton oksijeni üzerinden gerçekleşeceği teorik çalışmalar sonucu açıklanmıştır (47). O O OH 3-hidroksi-4H-piran-4-on O O O 2H-piran-3,4-dion Şekil 2.3. 3-Hidroksi-4H-piran-4-on halkasının tautomerik şekilleri. Kojik asitin yapısında iki farklı hidroksil grubu vardır. Biri 5 numaralı konumda bulunan ve moleküle fenol benzeri özellik ve zayıf asidik karakter sağlayan hidroksil grubu, diğeri ise 2 numaralı konumdaki primer alkol gibi davranan hidroksil grubudur. Asitliği fenolle (pKa=9,82) kıyaslandığında daha asidik bir yapı olduğu, bunun nedeninin de yapıdaki karbonil grubu olduğu öne sürülmüştür, ancak birçok reaksiyonda fenol gibi davrandığı saptanmıştır (48, 49). 12 Kojik asitin (II) asitliği, 4-hidroksimetil fenol (I) ve 4-hidroksi-2H-piran-2-on (III) bileşikleri ile kıyaslandığında I’e göre daha asidik olduğu ve bunun da karbonil grubunun eksi yükü dağıtarak molekülü daha kararlı hale getirmesinden kaynaklandığı öne sürülmüştür. Ancak III numaralı bileşiğe göre daha az asidik olduğu ortaya çıkmıştır. Bu durum, kojik asitte 4. ve 5. konumlar arasında molekül içi hidrojen bağının oluşmasıyla açıklanmıştır. Kojik asitin dissosiye olma ihtimali olan 2 tane hidrojeni vardır ancak proton kaybedilmesi sırasında tercih edileni halkaya doğrudan bağlı olan 5. konumdaki hidroksile ait hidrojendir (47, 50). HO OH O O OH O O HO OH I II III Şekil 2.4. Kojik asitin asitliğinin bazı bileşiklerle karşılaştırılması. Kojik asit, iki adet protolitik denge oluşturabilecek oksijene sahiptir. Katyondan nötral forma geçerken oluşan denge sabiti pKa1 -1,50 dir. Bu değer, karbonil oksijeninin alifatik keton ya da aldehitteki eşdeğer karbonilden daha bazik olduğunu göstermektedir. pKa2 ise 7,80 olup tropolon (pKa 6,69) ve asetilaseton (pKa 8,86) ile kıyaslanabilir. Kojik asitin iyi bir anyonik bidentat ligand olmasının nedeni karbonil oksijeninin bazikliği, hidroksil grubunun da asitliğidir (51). O OH HO OH O O HO OH O O HO OpK a1 pK a2 Şekil 2.5. Kojik asitin pKa değerleri. Bir bileşiğin yağda çözünme eğiliminin ölçüsü yani lipofilisitesinin göstergesi olan partisyon katsayısının logaritmik değeri log P değeri ise kojik asitte -0,66 olarak kaydedilmiştir (52). Kateşol yapısı taşıyan kojik asit türevlerinin, +2 ve +3 değerlikli çok sayıda metalle şelasyon yaptığı ve dayanıklı şekillerde M(Kojik asit)n (n= 2, 3) kompleksleri oluşturduğu bildirilmiştir (53-56). 13 Kimya endüstrisinde, kojik asitin nötral ya da hafif asidik ortamda eser miktardaki Fe3+ iyonları ile koyu kırmızı, Cu3+ ile açık yeşil renkli kompleks oluşturması özelliği ile katyonların tespit edilmesinde kullanıldığından dolayı kojik asit, analitik bir araç olarak da kabul edilmektedir. Au3+ ile verdiği kompleks pH= 5,7- 6,8 aralığında mavi-gri floresan verdiği, bu özelliğinden dolayı altının florometrik tayininde kullanıldığı bildirilmiştir (49, 51).                       Şekil 2.6. Kojik asitin moleküller arası hidrojen bağları ve bağ uzunlukları. Kojik asitin yapısının X-ışınları analizi ile aydınlatılmasıyla moleküller arasında iki tür hidrojen bağıyla düzlemsel yapının korunduğu belirtilmiştir (57). Kojik asitin sahip olduğu polifonksiyonel halkanın farklı reaktiviteleri bulunmaktadır. Bu fonksiyonel gruplar arasında karbonil grubu, enol grubu, primer alkol fonksiyonel grubu, dien ve ayrıca aromatik özellikler bulunmaktadır. Bu çeşitlilik sayesinde aldol, Mannich, diazo eşleme, Claisen, konjugat katımı gibi çok çeşitli reaksiyon türlerine katılmaktadır. Kojik asitin en önemli reaksiyonlarından biri ise piridon ve piridin heterosiklik yapılarının sentezleridir. Ayrıca primer alkol grubu üzerinden yürüyen halojenasyon, oksidasyon ve diğer dönüşümler gibi tepkimeler sayesinde de yeni maddelerin sentezlenmesine elverişli türevlerin kazanılması sağlanmaktadır (45). Birçok araştırmacı tarafından yapılan sentez işlemlerinde kojik asitin 2-hidroksimetil grubunun oda sıcaklığında tiyonil klorür ile klorlanması sonucu klorokojik asit halka hidroksili etkilenmeden elde edilmiştir. Klorokojik asitin, derişik hidroklorik asit içerisindeki çinko tozu ile indirgenmesi sonucu allomaltol kazanılmıştır (18, 19, 39, 58). 14 O O OH Klorokojik asit O O OH Allomaltol H3C O O OH Kojik asit HO Cl SOCl2 Zn/HCl Şekil 2.7. Kojik asitten hareketle klorokojik asit ve allomaltolün eldesi. Klasik Mannich reaksiyonu, üç bileşenli bir kondenzasyon reaksiyonu olup en az bir aktif hidrojen atomu taşıyan bir bileşik, aldehit ve amin bileşiğinin Mannich bazları olarak bilinen bileşikleri meydana getirdikleri reaksiyon türleridir. Mannich bazlarının pratikte sayısız uygulamaları vardır. En önemlisi medisinal kimya olmak üzere, deri, kağıt ve tekstil sanayi gibi doğal materyallerin işlenmesi, petrol endüstrisi tarafından katkı maddesi olarak kullanılan sentetik polimerlerin üretimi, analitik belirteçler, kozmetikler ve boyalar gibi çok çeşitli alanlarda kullanıma sahiptirler. Mannich bazları çok çeşitli biyolojik aktiviteleri göstermelerinin yanı sıra aminometilasyon işlemi sayesinde ilaçların vücuda dağılmasında önemli olup özellikle kontrollü hidrolitik koşullarda deaminometilasyon ve deaminasyon gibi işlemlerle ön- ilaç olarak tasarlanabilir. Ayrıca Mannich bazları, yapıya polar fonksiyonel grupların eklenmesiyle bileşikleri hidrofil haline getirirken aynı zamanda uygun amin substitüsyonuyla daha lipofilik hale de getirilebilir. İşte tüm bu avantajlarından dolayı Mannich bazları ile ilgili her yıl çok sayıda çalışma yapılmaktadır (27). Laboratuvarımızda kojik asitten hareketle çeşitli Mannich bazları hazırlanmış antikonvülsan, antibakteriyel, antifungal, antiviral, antitüberküler, yaşlanma karşıtı antioksidan, antitirozinaz ve antidermatofitik aktiviteleri incelenmiş, elde edilen sonuçlar ışığında umut vadeden maddelerin olduğu saptanmıştır (18-23, 39, 59, 60). Yüksek biyolojik aktivite görülen ve tez kapsamında da incelenen bazı bileşikler ise Türk Patent Enstitüsü’nde patent koruması altındadır (41). O O OH HO HCHO substitue sekonder amin+ + MeOH O O OH HO N Şekil 2.8. Kojik asit türevi Mannich bazlarının sentezi. 15 Bir çalışmada hem kojik asit hem de klorokojik asit, oda sıcaklığında 7- piperazinilkinolon türevleri ve formaldehitle metanol varlığında Mannich reaksiyonuna girmiş ve elde edilen Mannich türevlerinin antibakteriyel aktivite gösterdikleri saptanmıştır (54). O O OH Y X N R1 COOH O F N HN R2 HCHO X N R1 COOH O F N N R2 O O OH Y CH3 MeOH R1 = Et, c-Pr; R2 = H, Me; X=CH, COMe, N; Y=OH, Cl + Şekil 2.9. Kojik asitin piperazinilkinolon türevleri ile Mannich reaksiyonu. Nurchi ve ark. (61) tarafından yapılan çalışmada, kojik asit, formaldehit ve N,N-dietiletilendiamidin reaksiyonu sonucu elde edilen türevin ise potansiyel bir terapötik demir şelasyon ajanı olduğu saptanmıştır. O O OH HO H2N NEt2 HCHO EtOH, oda sıc. O O OH HO O O HO OH N NEt2 Şekil 2.10. Kojik asitin N,N-dietiletilendiamit ile Mannich reaksiyonu. Kojik asitin aminoasitler ve formaldehitle reaksiyonu O’Brien ve ark. (62) tarafından bildirilmiş olup aminoasitlerin yapılarındaki ve çözünürlüklerindeki farklılıklardan dolayı diğer amin türleriyle olan reaksiyonlar kadar basit çözümlenememiştir. Kojik asit birkaç aminoasitle formaldehit varlığında su/etanol karışımında reaksiyona sokulmuştur. Glisin, taurin, DL-lösin ve DL-izolösin varlığında amin grubundaki her iki hidrojen atomu yer değiştirerek bis-Mannich 16 türevleri elde edilmiştir. DL-valin, sarkozin, DL-metiyonin ve L-prolin aminoasitleriyle gerçekleştirilen reaksiyonda ise aminin sadece bir hidrojen atomu kojik asitle yer değiştirmektedir. Ayrıca aynı araştırmacılar tarafından yürütülen bir başka çalışmada, kojik asit; dimetil ve dietil amin, pirolidin, morfolin, piperidin, N- metilpiperazin gibi sekonder aminlerle reaksiyona girdiğinde, tek kojik asitli Mannich türevine benzer yapının, lauril ve stearilamin gibi aminlerle reaksiyonu sonucu ise bis- Mannich türevlerinin elde edildiği bildirilmiştir (63). + O O OH HO NH2 COOHR1 HCHO su, EtOH O O OH HO N H R1 COOH veya O O OH HO O O HO OHN HOOC R1 (a) (b) (a) R1: DL-valin, sarkozin, DL-metiyonin ve L-prolin (b) R1: Glisin, taurin, DL-lösin ve DL-izolösin Şekil 2.11. Kojik asitin çeşitli aminoasitlerle Mannich reaksiyonu. Kojik asitin, 1,4,7-triazasiklononan ve formaldehitin fazlasıyla, etanol varlığında yüksek sıcaklıkla muamelesi sonucunda aşağıdaki yapı elde edilmiş vermiş ve bu yapının daha sonra çeşitli metallerle kompleksleri hazırlanmıştır (64). 17 + O O OH HO HCHO ısı N H NH HN 3 N N N O O OH HO O O HO OH O O HO HO Şekil 2.12. Kojik asitin 1,4,7-triazasiklononan Mannich reaksiyonu. Kojik asit karışımı ile paraformaldehitin, potasyum bikarbonat ya da potasyum karbonat varlığında absolü etanol içerisinde reaksiyonunun farklı sıcaklık koşullarında yürütüldüğünde farklı türevlerin elde edildiği görülmüştür (65). O O OH HO 1.HCHO, KHCO3 2. EtOH, 75°C O O HO HO OH OH 1.HCHO, KHCO3 2. EtOH, oda sıc. O O HO HO OH Şekil 2.13. Sıcaklığın Mannich reaksiyonuna etkisi. Kojik asitin 2-etilhekzanal ile etanol içerisinde sodyum karbonat varlığında reaksiyonu sonucu elde edilen aldol türevi bileşik ise Ochiai ve ark. (66) tarafından sentezlenmiş olup yapısı aşağıda gösterilmiştir. O O OH HO 2-etilhekzanal, Na2CO3 EtOH, 95°, 24 sa O O O O OH OHHO HO CH3 CH3 Şekil 2.14. Kojik asitin 2-etilhekzanal ile reaksiyonu. 18 Kojik asitin alüminyum oksit kullanılarak aromatik ve alifatik aldehitlerle aldol reaksiyonu yüksek verimde gerçekleşmiş olup elde edilen ürüne nükleofilik sübstitüsyonla indol yapısı sübstitüe edilerek insülin-mimik etkiye sahip bileşikler sentezlenmiştir (67, 68). O O OH HO RCHO, Al2O3 dioksan/su, oda sıc. O O OH HO R OH Nu, Silika-H2SO4 CH3CN, 80° C, 2 sa O O OH HO Nu indol O O OH HO R HN O O OH HO OH Şekil 2.15. Kojik asitten aldol reaksiyonu sonucu elde edilen ürünler. Kojik asitin piridinon türevinden hareketle Mannich bazları elde etmek amacıyla kojik asitin metilaminle reaksiyonunu takiben formaldehit ve piperidinle muamelesi sağlanmış ve Mannich ürünleri kazanılmıştır. Bu türevlerin metal iyonları için yüksek afiniteli bidentat ligandlar olarak davrandıkları saptanmıştır (69). O O OH HO 1. MeNH2 2. piperidin, HCHO, EtOH/su N O OH HO N Me Şekil 2.16. Kojik asitten piridinon türevi Mannich bazının sentezi. Antikanserojen aktivite gösteren bir bileşik sentezlemek amacıyla kojik asitten hareketle piridin-2-karbaldehit yapısındaki bileşiğin sentezi dört basamaklı olarak gerçekleştirilmiştir. Bu sentez yolağının piridine geçiş yapılan kısmında ise kojik asit, potasyum hidroksit varlığında dimetil sülfat kullanılarak metillenmiş, daha sonra sıcakta amonyum hidroksit ile piridin yapısı elde edilmiştir (70). O O OH HO N H O OMe HO 1.Me2SO4 , %10 KOH 2.NH4OH , 90°C Şekil 2.17. Kojik asitten piridinon türevlerinin sentezi. 19 Farklı bir çalışmada, güçlü bir endotelin dönüştürücü enzim (Endothelin Converting Enzyme, ECE) inhibitörü ve antihipertansif bileşik olarak tasarlanan piridin türevinin eldesi için kojik asit, başlangıç maddesi olarak seçilmiştir. Sodyum metilat varlığında, enolik hidroksil grubu benzilklorür ile korunmuş, oluşan üründeki hidroksimetil grubu Jones reaktifi ile karboksilik asite oksitlenmiş ve piridon yapısı elde edilmiştir. Karboksil ve fenolik hidroksil grupları, trimetilsilildiazometan kullanılarak, metillenmiş ve daha sonra benzil eter grubunun Pd/C ile uzaklaştırılması sonucu piridin karboksilat türevi sentezlenmiştir (71). O O OH HO 1.BnCl, NaOMe 3.NH3, 90°C N H O OBn HO O 1.TMSCHN2 MeOH 2.H2, Pd/C N OH MeO2C OMe 2.CrO3 Şekil 2.18. Kojik asitten hareketle piridin karboksilat türevinin sentezi. Piridinon elde etmek için yapılan bir başka çalışmada ise, benzille korunmuş kojik asit türevi metil aminle reaksiyona sokulmuş, elde edilen türev tiyonil klorürle muamele edilerek yüksek verimle piridinon elde edilmiştir (72). O O OBn HO 1.MeNH2, EtOH/su 2. SOCl2, CH2Cl2 N O OBn Cl CH3 Şekil 2.19. Kojik asitten piridinon sentezi. Kojik asitten piridintiyonlara geçiş ise beş basamaklı olup Sakurai ve ark. tarafından açıklanmıştır. Öncelikle kojik asitin 5 numaralı konumunda bulunan hidroksil grubu korunarak sodyum hidrür varlığında alkil iyodürlerle muamele edilmiş, böylelikle o-alkillenmiş ürünler elde edilmiştir. Elde edilen ürünler, aminlerle reaksiyona sokulduktan sonra, hidrojen gazı altında Pd/C ile benzil grubu uzaklaştırılarak piridinonlar elde edilmiştir. Bu türevlerin HMDSO varlığında P2S5 ile reaksiyonu sonucu C=O çifte bağı C=S bağına dönüştürülmüştür (73). 20 O O OH HO 1.BnCl, NaOH 2. R1I, NaH O O OBn R1O 1. R2NH2 2. H2, Pd/C N O OH R1O R2 P2S5, HDMSO N S OH R1O R2 R1: metil, etil, n-propil, n-butil, R2: n-propil, n-butil, n-pentil, n-heksil Şekil 2.20. Kojik asitten hareketle piridintiyon türevlerinin sentezi. Zirak ve Eftekhari-Sis (45) tarafından belirtilen ve kojik asitin hidrazinlerle reaksiyonu araştırıldığı bir çalışmada kojik asit, önce hidrazin, sonra tiyonil klorür ile reaksiyona sokularak önce 4-okso-3,6-dikloro-1,4-dihidropiridazin elde edilmiş, bileşiğin Pd/C ile redüksiyonu sonucu 3,6-dimetil-4-okso-1,4-dihidropiridazin elde edilmiştir. O O OH HO 1.NH2NH2 2. SOCl2 H2, Pd/C N H N O Cl Cl N H N O H3C CH3 Şekil 2.21. 4-Okso-1,4-dihidropiridazin türevinin sentezi. Kojik asit, NaOH varlığında formaldehitle reaksiyona sokularak, bunu takiben NaOH ve Pd/C varlığında hava ile oksitlenerek 3-hidroksi-4-okso-4H-piran-2,6- dikarboksilik asit yapısındaki bileşik sentezlenmiştir (74). O O OH HO 1.HCHO, NaOH, MeOH, 4sa 2. NaOH, hava, Pd/C O O HOOC OH COOH Şekil 2.22. Kojik asitten dikarboksilik asit türevlerinin sentezi. Wang ve ark. (75) tarafından geliştirilen enansiyoselektif Michael katımı reaksiyonunda, kojik asit türevi, nitro olefinlerle bifonksiyonel kiral tiyoüre-tersiyer 21 aminin katalizör olarak kullanılarak ürün elde edilmiştir. Bu reaksiyonda kojik asit türevi ile nitro olefinden yüksek verim ve iyi enansiyoselektif özellikteki türevler elde edilmiştir (76). O O OH TBSO O O OH TBSO katalizör MeOH, -10°C  R NO2 R: XC6H4 (X: H, 4-F, 4-Cl, 4-Br, 4-NO2, 4-Me, 4-MeO, 2-Cl, 2-Br, 2-NO2, 3-Br) Şekil 2.23. Kojik asitten kiral türevlerin sentezi. Bir başka çalışmada indolil-kojik asit türevleri hazırlanarak antidiyabetik aktiviteleri incelenmiştir. Kojik asitteki hidroksimetil grubu tetrahidropiran ile korunarak indol türevi ile tepkimeye sokulmuş, daha sonra yüksek sıcaklıkta hedeflenen bileşikler elde edilmiştir (77). O O OH THPO + N CO2Me Br 1.Cs2CO3, DMF, oda sıc., 12 sa 2.Amberlist 15, MeOH, oda sıc., 3 sa O O O THPO N CO2Me toluen 190°C, 30 dk. O O OH THPO N CO2Me CH3 Şekil 2.24. Kojik asitten hareketle antidiyabetik etkili indolil türevlerinin sentezi. Başlangıç maddesi kojik asit olan funikon türevi bileşikler sentezlenmiş ve bu bileşiklerin sitostatik etkileriyle birlikte antiproliferatif özellikleri araştırılmıştır (78). 22 O O OH HO 1.SOCl2, CH2Cl2 2. Ph3P, THF 3.CH3CHO, CH3CN, K2CO3 4. Tf2O O O OTf H3C Sn2Me6, Pd(OAc)2 Ph3P, LiCl O O SnMe3 H3C O O H3C O CO2Me MeO OMe Şekil 2.25. Kojik asitten funikon türevlerinin sentezi. Bu çalışma devamında aynı araştırmacılar tarafından elde edilen diğer bir tirozinaz inhibitörü ise aldehit türevinden pironil akrilik asitle esterleştirilmesi sonucu ester türevlerine geçilerek sentezlenmiştir (79). O O OPMB H O + P O MeO OMe CO2Me NaH THF O O OPMB MeO2C 1. LiOH(aq), THF 2. RI veya ROTs, K2CO3,DMSO 3.TFA, CH2Cl2 O O OH RO2C Şekil 2.26. Kojik asitin pironil akrilik asitle esterleştirilmesi. Kojik asitin 5 numaralı konumundaki enolik özellikteki hidroksil grubu pek çok çalışma için hedef olmuştur. Kojil-APPA olarak isimlendirilen ve in vivo tirozinaz inhibitör etkisi tespit edilen molekül, kojik asit ve 2-kloro-[1,3,2]oksazafosfafinan 2- oksit bileşiğinin trietilamin varlığında reaksiyona girmesi ve bunu takiben asidik koşullarda hidroliz sonucu elde edilmiştir. Ancak bu molekülün aynı aktivitede in vitro etkinliği tespit edilememiştir (80). O O OH HO + NH P O O Cl 1.Et3N, CHCl3, EtOH 2. H+, su, EtOH O O O HO P O O O NH3 Şekil 2.27. Kojil-APPA türevlerinin sentezi. 23 Enolik hidroksil grubunun O-alkilasyonu ise, kojik asit ile bromo butenolitlerin kuru dimetil formamit (DMF) içinde susuz potasyum karbonat varlığında reaksiyonu sonucu gerçekleştirilmiştir. Elde edilen ürünün, parazit özellikteki yabani bitkilerin tohumları için çimlenme uyarıcı etkiye sahip olduğu bulunmuştur (81). O O OH HO + K2CO3, DMF oda sıc., 18 sa. O O O HO O CH3 O Br O CH3 O Şekil 2.28. Enolik hidroksil grubunun O-alkilasyonuna örnek. Etil ve benzil β-diazopropiyonatlar potasyum hidroksit varlığında kojik asit ile oda sıcaklığında tepkimeye sokulmuş ve aşağıdaki türevler elde edilmiştir (82). O O OH HO KOH, MeOH N2CHCH2CO2R O O O HO CO2R Şekil 2.29. Enolik hidroksil grubunun β-diazopropiyonatlar O-alkilasyonu. Cho ve ark. (83) tarafından 2012 yılında yapılan bir çalışmada kojik asitin sinnamat türevleri sentezlenerek, bu bileşiklerin depigmente edici özellikleri saptanmıştır. O O OH HO Ar HOOC Ar ClOC Ar O PhSO3 Ar O O O EtO veya veya veya + O O O HO O Ar O O OH O O Ar Ar O O O Ar Şekil 2.30. Sinnamat türevi depigmentasyon bileşikleri. 24 Kojik asitin MnO2 ile yürütülen oksidasyonunda N,N-dimetilhidrazin ile reaksiyonu sonucu N,N-dimetilhidrazon yapısı elde edilmiştir. Elde edilen bu molekül meta-kloroperoksibenzoik asit ile reaksiyona sokularak %53-69 verimlerde nitriller sentezlenmiştir (84). O O OR HO 2.NH2NMe2 O O OR NMe2N MCBPA CH2Cl2 O O NC OR 1.MnO2 Şekil 2.31. Kojik asitten hareketle nitril türevlerinin sentezi. Bir çalışmada, bir grup kojik asit türevinin Cu (II) kompleksleri hazırlanarak bu maddelerin He-La hücre dizilerine karşı antiproliferatif etki gösterdikleri bulunmuştur. Brom içeren türevler, potasyum karbonat varlığında 8-hidroksikinolin ve rezorsinol ile muamele edilerek istenen türevlere ulaşılmıştır. Ayrıca, yapısında benzil taşıyan bromo türevinin, DMF içerisinde potasyum karbonat varlığında arilsülfonil piperazinle reaksiyona sokulmasını takiben, BBr3 kullanılarak yapılan deproteksiyon sonucu piperazin yapısı taşıyan türev elde edilmiştir (85). O O OR Br OHHO 2.BBr3, DCM 1.K2CO3, aseton O O OH OHO N OH 1.K2CO3, aseton 2.TFA, DCM, oda sıc. O O OH O N 2.BBr3, DCM 1.K2CO3, asetonHN N S O O Ph O O OH N N S O O Ph Şekil 2.32. Antikanser etkili kojik asit türevlerinin sentezi. 25 Lee ve ark. (86) tarafından melanin sentezi ve tirozinaz inhibitörü aktiviteye sahip kojik asit türevi, iki piron halkasının birleştirilmesiyle elde edilmiştir. Fosfonat bileşiği aldehitle sodyum hidrür varlığında oda sıcaklığında reaksiyona sokulmuştur. Enolik hidroksil grubunun korunması ve bunu takiben MnO2 ile oksidasyon sonucu komenik aldehit sentezlenmiştir. Bu yapı, elde edilen diğer halka ile birleştirilerek amaçlanan bileşik kazanılmıştır. Bu bileşiğin kojik asite göre sekiz kat daha güçlü tirozinaz inhibitörü etkiye sahip olduğu bulunmuştur. B16F10 melanoma hücrelerine karşı da daha etkili melanin sentez inhibitörü aktivite gösterdiği saptanmıştır. O O OH HO PMBCl, K2CO3 DMF O O OPMB HO 1. MsCl, Et3N, CH2Cl2 2. NaBr, DMF 3.P(OMe)3, toluen MnO2, CHCl3 O O HO O O OH O O OPMB O H + O O P OPMB O MeO MeO 1. NaH, THF 2. TFA, CH2Cl2 (A) (A) Şekil 2.33. Tirozinaz inhibitörü kojik asit türevlerinin sentezi. İskelet kası gevşetici ve civciv spinal kord nöronlarında kısmi agonist etkilere sahip 3-benzil-6-tosil kojik amin türevleri Atkinson ve ark. (87) tarafından daha önce sentezlenmiştir. Kojik asitin amonyak ile reaksiyonu sonucu kojik aminle birlikte dimerleri de elde edilmiştir. Korunan kısımlar asidik ortamda deproteksiyon ile uzaklaştırılmıştır (45). 26 O O OBn TsO NH3, MeOH CHCl3 O O OBn H2N + O O OBn O O BnO NH HBr-HOAc O O OH O O HO NH Şekil 2.34. Kojik amin dimerlerinin sentezi. Kojik asitin stabilite ve çözünürlük sorunlarını iyileştirmek amacıyla çok sayıda ester türevleri sentezlenmiştir. Bu sentezler, gerek enzimatik gerekse kimyasal yolaklarla gerçekleştirilmiştir. Fenolik ve alkolik hidroksil gruplarının her birinden ayrı ayrı ve ikisinden de olmak üzere üç farklı türde ester türevleri vardır. Fenolik hidroksil grubunun ise daha kolay esterleştiği bildirilmiştir (88-90). Bu ester türevlerinde depigmente edici etkiler araştırılmış ve bu bileşiklerin daha etkili oldukları bulunmuştur. Günümüzde piyasada mevcut kojik asit esterleri kojik dipalmitat ve kojik izopalmitat adlı maddeler kozmetik ürünlerde kojik asite oranla daha güvenle kullanılan, herhangi bir kısıtlama koşulu bulunmayan bileşiklerdir. O RO O OH 5 numaralı konumun esterleri O HO O O R O 7 numaralı konumun esterleri Monooleat Monopalmitat Monolaurat 7-O-vinil adipoil 7-O-hekzanoil O RO O O R O Her iki konumun esterleri Dipalmitat İzopalmitat Şekil 2.35. Kojik asit esterleri. Tirozinaz inhibitörü aktivite gösteren kojik asit-tripeptit yapısındaki bileşikler ise benzer yöntemlerle farklı araştırmacılar tarafından sentezlenmiştir. Bu amaçla 27 kojik asit, karbonildiimidazol (CDI) ile oda sıcaklığında reaksiyona sokulmuş, diğer bir taraftan da 2-klorotritil reçinesine tripeptitler katı-faz yöntemiyle tutturulmuştur. Elde edilen bu aminoasitli yapı, kojik asit türeviyle birleştirilerek %49-95 oranında değişen verimlerle antitirozinaz bileşikler elde edilmiştir (91). O O OH HO CDI THF, oda sıcaklığı, 24 saat O O OH ON O N O O HO O AA3-AA2-AA1-OH O Cl Cl AA3-AA2-AA1-OH Şekil 2.36. Kojik asit-tripeptit yapısındaki bileşiklerin sentezi. Kwak ve ark. (92) kojik asitten hareketle kojik asit-fenilalanin amit yapısındaki bileşiği sentezlemiş ve bunun çok iyi antitirozinaz etki gösterdiğini bulmuşlardır. Ayrıca daha sonra bu yapının CuCl2 ve Zn(OAc)2 ile metal komplekslerini hazırlayarak bu türevlerin de antitirozinaz etkileri incelenmiştir (93). O N H O H N O O O OH ON O N O O OH OHN O H2N O Şekil 2.37. Kojik asit-fenilalanin amit yapısındaki bileşiklerin sentezi. Güncel bir çalışmada, kojik asit türevi doğal olmayan α-aminoasit sentezlenmiştir. Öncelikle kojik asit, benzil bromür kullanılarak korunmuş, daha sonra elde edilen türev tiyonil klorürle diklorometan içerisinde klorokojik asit türevine 28 dönüştürülmüştür. Esterle reaksiyona sokulan madde, asidik ortamda hidrolize uğratılmış, ancak son basamakta benzil grubu uzaklaştırılamamıştır. Klorokojik asitle başarılı olamayan araştırmacılar bromokojik asitle yürütülen yolakta istedikleri ürünü sentezlemişlerdir (94). O O HO OH BnBr, NaOH MeOH, ısı,16 sa O O BnO OH SOCl2, CH2Cl2 oda sıcaklığı, 6 sa O O BnO Cl N-(difenilmetilen) glisin metil ester CH3CN, K2CO3 O O BnO COOMe N HCl, Et2O O O BnO COOMe NH2 Pd/C, H2 O O HO COOMe NH2 PBr3 O O BnO Br CH3CN, K2CO3 N-(difenilmetilen) glisin metil ester O O BnO COOMe N BBr3 O O HO COOMe N HCl, Et2O O O HO COOMe NH2 Şekil 2.38. Kojik asit türevi doğal olmayan α-aminoasitin sentezi. Kasser ve ark. (95) tarafından yürütülen bir çalışmada kojik asit, siklik sekonder amin ve %35’lik formaldehit çözeltisinin reaksiyonu aşağıdaki şemada gösterilen Mannich ürününü vermiştir. Bu ürünün rutenyum ile hazırlanan 29 kompleksinin ise yapılan araştırmalarda antikanser ajan ve antitümör aktivitelere sahip oldukları bulunmuştur. O O OH HO X H N R1R2 HCHO MeOH O O OH HO X N R1R2 O O O HO X N R1R2 Ru Cl1. NaOMe 2. [Ru Cl2 (cym)]2 R1, R2: H, Me; X: CH2, CHMe, O Şekil 2.39. Kojik asitin Ru komplekslerinin sentezi. Heterosiklik yapıda birçok bileşik, düşük molekül ağırlığına sahip olmaları, kolay sentezlenebilmeleri, çeşitli sübstituentlerle hidrofilik lipofilik dengeleriyle ayarlanabilir olmaları nedenleriyle iyi birer ligand olarak düşünülebilir. 3-Hidroksipironlar, kojik asit de dahil olmak üzere, çinko ve vanadyum ile bidentat kompleks yapabilmektedirler. Bu komplekslerin kandaki glukoz miktarını düşürmesi nedeniyle Tip II (insüline direnç ve anormal insülin salgılanması ile karakterize) diyabet tedavisinde kullanılabilirliği araştırılmıştır. Vanadium sulfat (VOSO4) kandaki glukoz miktarını düşürmekte ancak biriken metal toksisiteye neden olmaktadır. Bu nedenle metalin bir şelat içinde verilmesi tasarlanmaktadır. Bu amaçla 3-hidroksipiron bileşiği kullanılarak, şelasyon nedeniyle metalin polarlığı azaltılmış ve böylece hücre zarından geçebilir duruma getirilmiştir (96). Vanadyum bileşikleri oral diyabet tedavisinde tamamlayıcı olarak büyük öneme sahiptir. İnorganik tuzları bağırsaktan çok az emildiğinden, kojik asit ve maltol gibi hidroksipiron yapısındaki ligandlarla kompleksleri oluşturularak insülin mimetik aktiviteleri iyileştirilmeye çalışılmış, yapıları da X ışınları ile aydınlatılmıştır (97). Diyabet hastalarında vanadyum komplekslerinin insülin mimetik aktiviteleri olduğu için (VO)+2 esaslı tedavide kojik asit kompleksleri kullanmaktadır (53, 98). 30 O O O OH O O O OH V O Şekil 2.40. Kojik asit vanadyum kompleksinin yapısı. Kojik asitin fenolik yapısından dolayı çok sayıda metalle kompleksleri hazırlanmış, bu bileşiklerin radyoprotektif etki ve glukoz düşürücü insülin mimetik etki gibi çok çeşitli biyolojik aktiviteleri incelenmiştir. Ayrıca piron halkasından piridinon halkasına geçiş yapıldıktan sonra da metal kompleksler hazırlanmıştır (54, 56, 58, 99-101). O O O HO O O O OH M M(OAc)2 M: Mn+2, Zn+2, Sn+2 O O O HO O O O OH Mo O O O O OH HO [Mo2O7]-2 O O OH O O O O O O M M: VO, Zn M+3 O O O OH M 3 M: Al, Ga, In N O N H OH M 3 M: Al, Ga, In 3RNH2 R Şekil 2.41. Kojik asitin çeşitli metallerle komplekslerinin sentezi. Kojik asitin şelasyon yapma yeteneğinden faydalanılarak kojik asitle uygun bileşikler kombine edilerek yeni makrosiklik şelatörler sentezlenmiş ve bunların tıbbi öneme sahip metallerle yaptığı şelatların, çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılması amaçlanmıştır. Sentezlenen bu yeni şelat yapıcıların, talasemi hastalarındaki demir detoksifikasyonunda da etkili olabileceği düşünülmüştür. Ayrıca ileri görüntüleme tekniklerinde, hedefe özgü radyodiagnostiklerin geliştirilmesi için metalik 31 radyonüklitlere ilgi büyüktür. Biyomoleküllerin, metalik radyonüklitlerle işaretlenmesi için ise güçlü kovalent bağ yapabilecek, sağlam kompleksler oluşturabilecek inert ve dayanıklı şelatörlere ihtiyaç vardır. Bu amaçla sentezlenen makrosiklik şelatörün galyum ve demirin yanında indiyum ile de kompleks yaptığı belirtilmiştir (64). Kojik asit metallere karşı yüksek affinite taşıması özelliğinden yararlanılarak bir çalışmada [RuNO]6 ile birebir oranda, metal-nitrozil kompleksleri hazırlanmıştır. Bu kompleksler, NO (nitrik oksit) dağıtıcı ajanlar olarak, kararlı bileşiklerden biyolojik hedeflere fotokimyasal NO salınımı sağlar. NO; nöral sinyalizasyon, kardiyovasküler kontrol, kanser azaltma gibi biyolojik olaylarda önemli rol oynar. Bu yüzden NO’in organizmada regülasyonu önemlidir (102). O O HO O H H Ru Cl Cl Cl N O K Şekil 2.42. Kojik asitin NO dağıtıcı özellikteki kompleksi. Radyoprotektör maddeler, iyonize radyasyonun toksik etkilerine karşı koruma sağlayan bileşiklerdir. Bu bileşikler, kanser hücrelerini öldürmek için normal dozda alınandan daha yüksek dozda radyasyon uygulanmasına olanak verirler. Emami ve ark., kojik asit ve kojik asitin mangan ve çinko komplekslerinin radyoprotektör aktivitelerini çalışmışlardır (54). O O OH HO Mn(OAc)2 .4H2O veya Zn(OAc)2 .2H2O EtOH O O O O O O M OH OH M: Mn(II), Zn Şekil 2.43. Kojik asitin radyoprotektör özellikteki kompleksleri. 32 2.1.2. Klorokojik Asit ve Türevlerinin Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri Kojik asitteki alkolik hidroksil grubunun klorlanması sonucu elde edilen klorokojik asit, araştırmacılar tarafından tercih edilen önemli bir başlangıç maddesi ve ara ürün olarak karşımıza çıkmaktadır. Kojik asidin tiyonil klorürle reaksiyonu sonucu oluşan klorokojik asit ilk kez 1924 yılında Yabuta tarafından sentezlenmiştir (Şekil 2.44.) (103). Daha sonra birçok araştırmacı tarafından aynı sentez yöntemi kullanılarak çeşitli çalışmalar yapılmıştır (18, 20, 22, 23, 58, 104). O O OH HO O O OH Cl Kojik asit Klorokojik asit SOCl2 Şekil 2.44. Klorokojik asitin sentezi. Beyaz renkte, toz kristaller şeklinde morfolojiiye sahip olup erime derecesi 166-7 ºC dir. Su, dietileter ve siklohekzanda çözünmez. Metanol, etanol, etil asetat ve benzende çözünür. Aseton ve kloroformda kolay çözünür. Klorokojik asitin antimikrobiyal, antidermatofitik ve antifungal etkiye sahip olduğu bilinmektedir (22, 36). Ayrıca bu bileşik, reaksiyona giren reaktiflere bağlı olarak sahip olduğu klor atomu sayesinde farklı nükleofilik sübstitüsyon reaksiyonlarına girebilmektedir. Klorokojik asit I-, N3- ve SCN- gibi nükleofillerle reaksiyona girdiğinde moleküldeki klor atomu söz konusu nükleofillerle yer değiştirmektedir. Bundan farklı olarak protonlanmış sekonder aminlerle reaksiyona girdiğinde 6 numaralı konumdaki karbon hedef alınarak 6-sübstitüe allomaltol türevleri oluşmaktadır (105). 33 O O OH Cl O O OH Nu O O H3C OH Nu Şekil 2.45. Klorokojik asitin nükleofilik sübstitüsyonu. Nötral ya da protonlanmış bileşiklerin kararsız protonları olduğundan değişik totomerik şekillerde bulunabilirler (47). Yapılan çalışmalar sonucunda nötral klorokojik asit ve azidokojik asitin enolik (I) formlarının en dayanıklı şekiller olduğu bildirilmiştir. Azidokojik asit ve klorokojik asitin tautomerleri incelendiğinde ise üç adet en düşük enerjili yapı saptanmıştır. Yapıların enerjileri kıyaslandığında, I en düşük enerjiye sahiptir; keto formu (III), II’den daha az dayanıklıdır. Nötral keto formu hariç, tüm katyonik ve nötral totomerlerde molekül içi hidrojen bağı mevcuttur. Nötral moleküllerdeki hidrojen bağının katyonlarda bulunan hidrojen bağlarına göre daha güçlü olduğu bildirilmiştir (106). O O OH Cl O O Cl OH O O Cl O I II III Şekil 2.46. Klorokojik asitin tautomerleri. Kojik asit ve klorokojik asidin, farklı sekonder amin türevleri kullanılarak Mannich bazları hazırlanmıştır. Klorokojik asit için morfolin ve piperidin kullanılırken, kojik asit için bunların yanında dimetilamin ve dietilamin gibi halkalı yapıda olmayan türevler de kullanılarak 6 numaralı konumdan mono-Mannich türevleri sentezlenmiştir. Ayrıca kojik asidin 5 numaralı konumundaki hidroksil grubunun korunduğu türevlerde ise Mannich reaksiyonunun yürümediği saptanmıştır (63, 107). 34 O O R OH N NH : Dimetilamin, dietilamin, piperidin, morfolin R: -OH, -Cl Şekil 2.47. Mannich bazı yapısı taşıyan türevler. Anabilim dalımızda tarafımızca klorokojik asitten hareketle çok sayıda Mannich bazı sentezlenerek çeşitli biyolojik aktiviteleri incelenmiştir. Literatürlerde “one pot reaction” (tek kapta reaksiyon) olarak tanımlanan bu reaksiyon türü klorokojik asit, formaldehit ve uygun sekonder amin yapısındaki bileşiğin aynı kap içerisinde tepkimeye sokulmasıyla oda sıcaklığında, hızlı ve yüksek verimlerle gerçekleştirilmiştir (20, 22, 23). HCHO MeOH O O OH Cl + O O OH Cl + HN R N R X X Mannich bazlarıSekonder amin türevleri (Piperazin/piperidin) Şekil 2.48. Klorokojik asitten hareketle Mannich bazlarının sentezi. Atkinson ve ark., klorokojik asiti dimetilformamit içerisinde sodyum azit ile reaksiyona sokarak 2-metilazit türevini, bu bileşiğin hidrobromik asit ile hidrolizi sonucu ise 2-aminometil-5-hidroksi-4H-piran-4-on (kojik amin) elde etmişlerdir (87). O O Cl OH NaN3 DMF HBr CH3COOH/C6H5OHO O N OH O O H2N OH NN Şekil 2.49. Klorokojik asitten hareketle kojik aminin sentezi. Bir çalışmada N,N-dialkilditiyokarbamik asit ve ditiyofosforik asitin O-alkil ve O,S-dialkil esterlerinin sodyum tuzları ile 5-sübstitüe-2-klorometil-4H-piran-4-on türevleri üzerinden yeni klorokojik asit türevleri sentezlenmiş ve bu bileşiklerin pestisit ve insektisit aktiviteleri gözlenmiştir (108). 35 O O OH Cl O O HO S O O HO S O O HO S P NR2 OR S S S OR OR X O O HO S P S OR OR X HO-CS-S- Na+ R2N-CS-S- Na+ RO R P X S- K+ P X S- Na+ (RO)2 R: Alkil, aril, piperidinil, morfolinidil X: O, S Şekil 2.50. Klorokojik asitten hareketle pestisit/insektisit türevlerin sentezi. Başka bir çalışmada ise tiyoeter, sülfoksit ve sülfon köprüleri taşıyan kojik asit türevleri sentezlenmiş, bunların antitirozinaz ve antiinflamatuvar aktiviteleri araştırılmıştır. Kojik asitin tiyonil klorürle reaksiyonunu takiben klorokojik asit elde edilmiş, tiyollerin potasyum tuzlarıyla muamele edilmiş ve kojil tiyoeter türevleri sentezlenmiştir. Sülfoksit türevleri ise kojil tiyoeterlerin m-kloroperbenzoik asit (MCPBA) ile oda sıcaklığında reaksiyonu sonucu oluşmuştur. Daha sonra kojil tiyoeter türevleri oksidasyonla sülfon yapılarına dönüştürülmüştür. Sülfoksit ve sülfon türevlerinde tirozinaz inhibitörü aktivite düşerken lipofilik, çeşitli alkil zincirler taşıyan kojil tiyoeter türevlerinde söz konusu aktivite artmıştır (109, 110). O O OH Cl RS-K+, DMF O O OH RS MCPBA CH2Cl2 MeOH, su O O OH RS O O O OH S O O R Oxone Şekil 2.51. Klorokojik asitten hareketle kükürtlü türevlerin sentezi. 36 Klorokojik asitteki klor atomunun azit grubuyla sübstitüsyonu sonucu azidokojik asit sentezlenmiştir. Klorokojik asit ve azidokojik asit nükleofilik sübstitüsyon reaksiyonlar için iyi ligantlardır. Klorokojik asit sodyumtiyosiyanat ve sodyum iyodür ile de 6 numaralı konumdaki klor atomunun nükleofilik sübstitüsyonu sonucu hedeflenen ürünler meydana gelmiştir (105). O O OH Cl O O OH NCS NaSCN NaN3 NaI O O OH N3 O O OH I Şekil 2.52. Klorokojik asitin çeşitli nükleofillerle reaksiyonu. Klorokojik asidin N-bromosüksinimit ile 6-bromoklorokojik asit oluşturduğu bildirilmiştir (111). O O Cl OH NBS Benzen O O Cl OH Br Şekil 2.53. 6-Bromoklorokojik asitin sentezi. Rho ve ark. tarafından yapılan başka bir çalışmada iki mol klorokojik asitin ester, amit ve tiyoeter gibi çeşitli köprülerle bağlanmasıyla çeşitli kondanse bileşikler hazırlanmıştır. Klorokojik asitin DMF içerisinde sodyum azit ile muamelesini takiben süksinil klorür ile reaksiyonu sonucu ilk sıradaki madde elde edilmiştir. Diğer bir yolla ise klorokojik asit kojil süksinik asitle tepkime vererek ikinci sıradaki madde sentezlenmiştir. Son olarak klorokojik asit, trietilamin varlığında ditiyollerle reaksiyona sokularak bis tiyoeter köprüsüne sahip bileşiklerin sentezlendiği bildirilmiştir (112). 37 O O Cl OH O HO O O O O O OH O O NaN3/DMF HBr,HOAc,fenol O O H2N OH O HO O N H H N O O OH O O a b O HO O S R S O O OHditiyoller, TEA, THF a: süksinil klorür, TEA, THF b: kojil süksinit asidin potasyum tuzu R: -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4- HBr Şekil 2.54. Klorokojik asit türevi kondanse bileşiklerin sentezi. 2012 Yılında yapılan bir çalışmada; kojik asit türevlerinin imidazol ve benzimidazol tuzları, N-heterosiklik karben ve iyonik sıvılar elde etmek amacıyla sentezlenmiştir. Klorokojik asit ve enolik hidroksil grubu benzille korunmuş olan türevi, N-metilimidazol ve N-alkilbenzimidazollerle reaksiyona sokularak amaçlanan bileşikler kazanılmıştır (113). O O OR Cl N N H3C N N R CH3CN, 25°C, 24 sa. CH3CN, KI, 70°C, 10 sa. O O OR X O O OR N N CH3 N N R' I Şekil 2.55. Klorokojik asit türevi imidazol ve benzimidazol tuzlarının sentezi. 38 Güncel bir çalışmada klorokojik asit, yapısında tiyol içeren bir bileşikle reaksiyona sokularak antitirozinaz ve melanogenez inhibitörü yeni bileşikler elde edilmiştir. 2-Merkapto-1-metilimidazol ile klorokojik asit, potasyum karbonat varlığında DMF içerisinde reaksiyona sokulmuştur Elde edilen maddenin mantar tirozinazına karşı kojik asitten daha aktif ve B16F10 malign melanom hücrelerine karşı daha az toksik olduğu saptanmıştır (114). O HO O S N N CH3 O HO O Cl + SH N N CH3 K2CO3, DMF Şekil 2.56. 2-Merkapto-1-metilimidazol türevlerinin sentezi. Kojik asit çekirdeğini temel alarak yeni, etkili ve güvenilir tirozinaz inhibitörü maddeler geliştirmek amacıyla yapılan bir çalışmada 1,2,4-triazol kullanılarak hidroksibenzaldehit ve kojik asit iskeleti bir araya getirilerek mantar tirozinazı üzerindeki etkisi incelenmiştir. 5-Sübstitüe-3-merkapto-4-amino-1,2,4-triazol yapısındaki bileşik hidroksibenzaldehit ile kondenzasyon reaksiyonuna tabi tutulmuş, elde dilen Schiff baz, sodyum borohidrür ile amine indirgenmiştir. Elde edilen bileşik, kojik asitle muamele edilerek trietil amin karşısında nükleofilik sübstitüsyona uğramış ve yüksek verimle istenilen bileşiğe ulaşılmıştır. 2 Numaralı bileşik doğrudan klorokojik asitle reaksiyona girdiğinde ise 5 numaralı bileşiğe ulaşılmıştır. Elde edilen tüm 4 ve 5 yapısındaki yeni maddeler, standart kojik asitten daha yüksek inhibisyon göstermişlerdir (115). 39 O O OH Cl N N N NH2 R1 SH sübstitüe benzaldehit/NaOAc N N N N R1 SH R2 NaBH4 N N N N R1 S R2 O O OH N N N H N R1 SH R2 O O OH Cl N N N N H R1 S R2 O O OH 1 2 3 5 4 Şekil 2.57. Çeşitli tirozinaz inhibitörlerinin sentezi. Kojik asitteki hidroksimetil grubu üzerinden yürütülen reaksiyonlarla da türevler elde edilmiştir. Bu fonksiyonel grup üzerinden kojik asitin benzoat esterleri hazırlanarak bunların tirozinaz inhibitör ve depigmentasyon aktiviteleri değerlendirilmiştir. Kojik asit, dimetilformamit içerisinde tiyonil klorürle muamele edilmiş, bunu takiben benzoik asitin potasyum tuzlarıyla reaksiyona sokulmuştur. Benzoat türevleri yüksek verimlerle elde edilmiştir. İleriki aşamalarda klorokojik asit; sodyum benzoat ve sodyum salisilatla tepkimeye sokularak (5-hidroksi-4-okso-4H- piran-2-il)metil 2-metilbenzoat ve (5-hidroksi-4-okso-4H-piran-2-il)metil 2- hidroksibenzoat iyi verimlerle elde edilmiştir. Bu şekilde sentezlenen maddelerin vanadil sülfatla kompleksleri hazırlanarak yüksek hipoglisemik etki gösteren antidiyabetik ajanlar olduğu tespit edilmiştir (83, 116-118). 40 O O OH Cl + COOH R2 R1 DMF O O OH O O R2 R1 VOSO4 O O O O O R2R1 V O 2 su Şekil 2.58. Hipoglisemik etkili türevlerin sentezi. Klorokojik asitin çeşitli metallerde 2-merkapto-1-metilimidazol kompleks oluşturabildiği bilinmektedir. Alüminyum ve galyumla yaptığı kompleksler suda çözünebilir özelliktedir. Alüminyum, Alzheimer hastalığında önemli yer tutmaktadır çünkü hastalığın neden olduğu tahribat, organizmada alüminyum birikmesine yol açar. Galyumun ise tümörlerin tespitinde kullanılışı araştırma konularından biridir. Tıbbi açıdan öneme sahip bu iki metalin nötral ortamda yaptıkları komplekslerin incelenmesi hastalıkların tanı ve tedavisine yönelik olarak doğru bir yaklaşımdır. Alüminyum bileşiklerinin suda çözünürlükleri galyum komplekslerinin çözünürlüklerinin yarısı kadardır. Klorokojik asitin her iki metalle yaptığı kompleksler de suda çözünmemektedir (119). Klorokojik asit ve allomaltolün diğer bütün hidroksipironlar gibi birçok metalle (demir, alüminyum, vanadium) oluşturduğu kompleksler, diyabet ve anemi tedavisinde yeni bileşikler olarak test edilmiştir (120, 121). 41 O O O Fe O O O Cl O O O Cl Cl Şekil 2.59. Klorokojik asitin Fe ile kompleksi. Metal katyonlarına seçici olarak bağlanabilme yeteneği sayesinde kitosan, kontamine suların ağır metallerden arındırılmasında kullanıldığı gibi ayrıca diş macunu, şampuan, vücut kremi gibi kozmetik ürünlerinin içeriğinde, gıdalarda koruyucu amaçla, ilaç, ziraat ve biyomedikal alanlarda da kullanımı olan doğal kaynaklı bir polimerdir. Fe3+ iyonuna karşı affinitesi bilindiğinden diğer bir şelasyon yapıcı bileşik olan kojik asitle bir araya getirilerek konjugatları oluşturulmuştur. Bu konjugatların sentezlenmesinde iki farklı yaklaşım söz konusudur. İlkinde, klorokojik asit ile kitosan serbest amin grupları aracılığıyla kovalent bağ oluştururken, ikincide ise subkolloidal Fe(O)OH’in nanopartikül olarak kitosana bağlı Fe(III) metallerinin kojik asitle kompleks oluşturmasıdır (45, 122). O O OH Cl + O H OH O HO NH2 O DMSO yada DMF -HCl O H OH O HO NH O O O HO Fe+3 O H OH O HO NH2 O Fe(O)OH O O OH Cl + O H OH O HO NH2 O Fe(O)OH O O HO OH O O OH OH Şekil 2.60. Klorokojik asitin kitosanla konjugasyonu. 42 2.1.3. Allomaltol ve Türevlerinin Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri Allomaltol, 2-metil-5-hidroksi-4H-piran-4-on yapısında olup biyolojik açıdan dikkat çeken, hidroksipiron türevi bir bileşiktir. Allomaltolün organoleptik özelliklerine bakıldığında renksiz ve kokusuz toz şeklinde olduğu, erime derecesinin ise 152-3ºC olduğu tespit edilmiştir. Allomaltolün sentezi de klorokojik asit gibi ilk kez Yabuta tarafından gerçekleştirilmiştir (123). Klorokojik asitin asidik ortamda çinko tozu ile indirgenmesi sonucunda elde edilmiştir (Şekil 2.3.). Geliştirilen yöntem, basit, etkili ve yüksek verimlidir. Ancak allomaltol farklı araştırmacılar tarafından farklı yolaklarla da sentezlenmiştir. Dibenzoil kojik asitin glasiyal asetik asitte indirgenmesiyle elde edilen yöntemin de bilinmesine rağmen halen günümüzde tercih edilen ilk yöntemdir (124). O O OH O O OH H3CCl Zn/HCl Şekil 2.61. Allomaltolün sentezi. Allomaltol klorokojik asitten sentezlendiği gibi, iyodokojik asitten de sentezlenmektedir. Klorokojik asitin iyot ile reaksiyona girmesiyle iyodokojik asit oluşmaktadır. Işıktan ve sıcaktan bozunan iyodokojik asitin, allomaltola dönüştüğü bildirilmiştir (105). O O OH Cl + O O OH I O O H3C OH O O OH HO I HI Şekil 2.62. İyodokojik asitten hareketle allomaltol eldesi. 43 Son yıllarda yapılan çalışmalarda çoklu bileşenli reaksiyonlar biyolojik olarak aktif bileşikler sentezlemek için kullanılan etkili bir araç olarak görülmektedir. Çünkü bu reaksiyonların, yüksek verimlilik, ürünlerin bir yerde kümelenmesi ve basit uygulama gibi avantajları söz konusudur. Laboratuvarımızda allomaltolden yola çıkılarak, metanol varlığında formaldehit ve sekonder amin türevi maddelerle Mannich bazları hazırlanmış, sentezlenen türevlerde de antikonvülsan ve antimikrobiyal aktiviteler araştırılmıştır (18, 19). O O H3C OH X= N, C O O H3C OH N X R 1.HCHO 2.Sek. amin trv. MeOH Şekil 2.63. Allomaltol türevi Mannich bazları. Dehkordi ve ark. tarafından 2008 yılında yapılan çalışmada, kojik asit ve allomaltolün 2 numaralı konumuna formaldehit varlığında Mannich reaksiyonu uygulanarak piperidin veya morfolin sübstitüe edilmiş türevleri sentezlenmiştir. Yapılarda bulunan fenolik hidroksil grubu, benzil bromürle reaksiyona sokularak korunmuştur (125). O O OH R Piperidin yada morfolin O O OH R N X O O OBn R N X N O OBn R N X CH3 N O OH R N X CH3 R: -CH3, -CH2OH X: -CH2 -, -O- HCHO BnBr CH3NH2 HCl Şekil 2.64. Allomaltol türevi ve piridinon türevi Mannich bazları. 44 Daha sonra yapılan bir çalışmada N-heterosiklik karben tarafından katalizlenen enansiyoselektif Claisen düzenlemesi kullanılarak yeni allomaltol türevleri sentezlenmiştir (126). O O H3C OH + H O R MeOH O O H3C OH O OMe R Şekil 2.65. Allomaltol türevlerinin Claisen düzenlenmesi. Bunların yanında, organik kimya sentezlerinde iyonik sıvılar uçucu ve yanıcı olmamaları, geri dönüştürülebilir olmaları gibi temel özellikleri sayesinde iyi huylu reaksiyon ortamları olarak dikkat çekmektedirler. Yeşil kimyanın, mevcut çevreye kirlilik sorunlarını ortadan kaldıracak çözümleri kapsayan bir akım olduğu düşünülürse iyonik sıvıları da kapsayan bu reaksiyon türlerinin, artan reaksiyon hızı ve seçiciliği de göz önünde bulundurulduğunda organik kimyada bu uygulamaların giderek arttığı net bir şekilde görülmektedir. Bu prensiple, aynı çalışma grubu tarafından aşağıdaki şemada belirtilen çoklu bileşen reaksiyonları gerçekleştirilerek allomaltol türevleri yüksek verimlerle sentezlenmiştir (127-129). O O H3C OH + CN R iyonik sıvı iyonik sıvı iyonik sıvı O O O H3C Ar R NH2 O O O O O O H3C OH Ar NH2 O O O O O H3C OH Ar O O Ar-CHO NH4OAc Et3N Et3N Şekil 2.66. Allomaltolün iyonik sıvılardaki reaksiyonlarına örnekler. 45 Allomaltolün enolik hidroksil grubu benzil bromürle ve alkolik hidroksil grubu ise dimetil sülfatla korunarak piridinon türevine geçilmiştir (130). O O H3C OH HCHO, NaOH O O H3C OH OH 2. Me2SO4 1. BnCl O O H3C OBn OMe 2. H2, Pd/C 1. MeNH2 N O H3C OH OMe CH3 Şekil 2.67. Allomaltolden piridinonlara geçiş. Kojik asitten hareketle elde edilen Mannich bazları dışında da çok sayıda biyolojik olarak aktif bileşik mevcuttur. Anabilim dalımızda yürütülen çalışmalarda kojik asitten hareketle piron halkasından piridinon halkasına geçiş sağlanarak 1,2,5-trisübstitüe 4(1H) piridinon türevleri sentezlenmiştir. Bu maddelerin yüksek analjezik ve antiinflamatuvar etkiye sahip oldukları bulunmuştur. Öncelikle tiyonil klorür kullanılarak kojik asitten klorokojik asit elde edilmiş, daha sonra çinko tozu ile redüksiyonunu takiben elde edilen allomaltolün yapısındaki hidroksil grubu, benzil klorürle korunarak 4-piron türevleri sentezlenmiştir. Elde edilen türevler, çeşitli aminlerle muamele edilmiş, takiben borontribromür kullanılarak benzil grubu uzaklaştırılmıştır (59, 60). BnCl O O H3C OH O O H3C OBn 1.RCH2CH2NH2 2. BBr3, DCM N O H3C OH R .2HBr R: N-piperidil, 2-piridil, N-metilpirolidin-2-il, N-morfolino Şekil 2.68. Analjezik ve antiinflamatuvar etkili piridinon türevleri. Allomaltolün hidroksipiron halkasının iyi bir bidentat ligand olabilme özelliği sayesinde galyum, vanadium ve demir metalleriyle kompleksleri hazırlanmıştır. Bu türevlerin antikanserojen ve antidiyabetik özellikleri araştırılmıştır (131-133). 46 Tümör inhibe edici özelliğe sahip aldol türevi rutenyum kompleksleri 2009 yılında yürütülen çalışmalarda tanımlanmıştır. Kojik asitten hareketle elde edilen bileşik üç basamaklı bir yolak ile sentezlenmiştir. Öncelikle kojik asitin tiyonil klorürle reaksiyonu oda sıcaklığında gerçekleşmiş, sonra 75°C’de Zn/HCl ile redüksiyonunu takiben bazik koşullarda formaldehitle ya da benzaldehitle muamele sonucu aldol ürünleri elde edilmiştir (134). O O H3C OH ArCHO NaOH, H2O O O H3C OH OH Ar O O H3C O OH Ru ClRu trv. Ar Şekil 2.69. Allomaltol türevlerinin Ru kompleksleri. Allomaltolün Lawessons reaktifiyle tepkimesi sonucu oluşan tiyoallomaltolün siklik sekonder aminler ve formaldehitle reaksiyonunda Mannich ürünler yüksek verimle elde edilmiş ve bu ürünlerin çeşitli metallerle kompleksleri hazırlanarak insan kanser hücre haatlarında 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5 difenil tetrazolyum bromür (MTT) deneyi ile sitotoksisiteleri araştırılmıştır (135). O X H3C OH O X H3C OH N Y O X H3C O N Y Cl aren sekonder amin [M(aren)Cl2]2 NaoMe X: O, S; Y: -O-, -CH2 -, -N-CH3 -; M: Ru, Os M HCHO Şekil 2.70. Allomaltol ve tiyoallomaltolün Mannich bazlarının kompleksleri. Rodyum metali komplekslerinin insan kanser hücrelerinde DNA’yı hücresel hedef alarak çift sarmal DNA ile kovalent bağlar aracılığıyla stabil yapı oluşturarak kanser hücrelerinin büyümelerini durdurdukları bildirilmiştir. Bu bilgiden yola 47 çıkılarak hazırlanan allomaltolün rodyum komplekslerinde özellikle CH1 (over kanseri) hücre hattına karşı sitotoksisite gözlenmiştir (136). O O H3C O Rh OH Şekil 2.71. Allomaltolün Rh kompleksleri. 2.2. Spektral Özellikler 2.2.1. IR Spektrumları Kojik asitin IR spektrumunda O-H gerilim bandı 3250-3100 cm-1 arasında yayvan bir pik olarak gözlenmiştir. Piron halkasının C=O gerilim bandı 1685 cm-1’de, C=C gerilim bandı 1655, 1610 ve 1575 cm-1’de keskin pikler şeklinde gözlenmektedir. Aromatik C-O-C gerilim bandı 1240 cm-1’de görülmektedir (137). Diğer bir çalışmada kojik asitteki C=O gerilim bandı 1648 cm-1’de, C=C gerilim bandı 1503 cm-1’de, C-O gerilimi ise 1113 cm-1’de gözlenmiştir (39). Klorokojik asitin IR spektrumunda 3200-3230 (O-H, gerilim), 1680, 1645 (C=O gerilim), 1610, 1580 (C=C gerilim), 1235 (C-O, gerilim, aromatik) ve 750-767 cm-1’de (C-Cl gerilim) pikler gözlenmiştir (137, 138). C-H gerilme titreşimleri 3700- 2800 cm-1’de gözlenmiştir. Lantanitlerle yaptıkları şelatlarda 3200 cm-1 civarında görülen OH grubuna ait pikin kaybolduğu görülmüştür (137). O-H gerilmelerinin de hidrojen bağı oluşumu nedeniyle daha düşük frekanslara kayarak bandın genişlemesine neden olduğu bildirilmiştir (138). 2.2.2. 1H-NMR Spektrumları Kojik asit ve klorokojik asitin dötoro dimetilsülfoksit (DMSO-d6) içerisinde alınan 1H-NMR spektrumlarında, protonların kimyasal kayma değerleri sırasıyla  4,50; 4,67 (2H; s; CH2); 6,60; 6,70 (1H; s; H3); 8,10; 8,13 (1H; s; H6); 5,68; 9,09 ppm (1H; s; OH) olarak bildirilmiştir (18, 39). 48 Allomaltolün DMSO-d6 içerisinde alınan spektrumunda, bu piklerden başka 2 numaralı konumdaki –CH3 grubundaki protonlar 2,25 ppm’de singlet pik vermiştir. Ayrıca 3 numaralı konumdaki aromatik hidrojene ait pik, 6,70 ppm civarından 6,10 ppm’e kaymıştır (18). 2.2.3. 13C-NMR Spektrumları Kojik asit ve diğer hidroksi-4H-piran-4-on yapısındaki bileşiklerin 13C-NMR spektrumuna ait kimyasal kayma değerleri literatürlerde 139, 145, 110, 161-168 ve 173 skalasında verilmiştir (139). 2.2.4. Kütle Spektrumları Kojik asit molekülünün kütle spektrumunda verdiği pik değerlerine göre parçalanma şekilleri 1968 yılında yapılan bir çalışmada açıklanmıştır (Şekil 2.72.). Parçalanmada ilk basamak kojik asitteki primer alkol grubundan oksonyum iyonu oluşturmak için –CHO grubunun ayrılmasıdır. Bu molekül kendi içerisinde düzenlendikten sonra dekarboksilasyon sonucu m/z değeri 85 olan parçalanma ürününü vermektedir. Molekül içi hidrojen göçü sonucunda halka kapanmaktadır. Bu yapıdan da sırasıyla –CO ve –C2H5 grupları ayrılarak diğer parçalanma ürününü oluşturmaktadır (140). O O OH HO O O OHH H H O O OH H CH2 H O C OH H CH2 H H2C H2C C H O C O H2C H2C CH O CH O m/z 142 m/z 113 m/z 85 m/z 85 m/z 113 m/z 57 m/z 29 -CO-CHO -CO -C2H4 Şekil 2.72. Kojik asitin moleküler parçalanması. Ayrıca, yapılan bir çalışmada allomaltole ait moleküler iyon pikinin aynı zamanda temel pik olduğu ve m/z değerinin 127 olduğu bildirilmiştir (18). 49 Klorokojik asitte moleküllerin, O-H…..O tipinde güçlü, allomaltolde ise C-H…..O tipinde zayıf hidrojen bağlarıyla bir arada bulundukları açıklanmıştır (138). Bu farklılığın şelasyon özelliklerine etki edeceği düşünülerek, Fe3+ ile yaptığı oktahedral bidentat komplekslerin kristal yapıları aydınlatılmıştır. Allomaltol ve kojik asit fac izomer yapısında kompleks oluştururken, klorokojik asitte bunların aksine mer izomeri oluşmuştur (98, 138). Bazı Mannich bileşiklerinin yapıları, ayrıca X-ışınları analizi ile aydınlatılmıştır. Molekülün konformasyonu moleküller arası ve molekül içi hidrojen bağlarıyla sağlanmaktadır. Bazı zayıf molekül içi etkileşimler yapıyı dayanıklı hale getirmeye yardımcı olmaktadır. Piperazin halkasının ise sandalye konformasyonunda olduğu görülmüştür (141-143). 2.3. Biyolojik Aktivite Çalışmaları 2.3.1. Mantar Tirozinazı İnhibisyonu Tirozinaz, oksidaz enzim türlerinden olup bitki, hayvan, mantar ve mikroorganizmalarda bulunan, çoklu işleve sahip bir enzimdir. Cilt, saç ve hayvanlarda kürk rengini belirleyen melanin adlı pigmentin biyosentezinden sorumludur (10). Yüksek yapılı bitkiler ve mantarlarda tirozinaz enzimleri üç izoform şeklinde bulunmaktadır. Bunlar, olgunlaşmamış (immature), olgun latent (mature latent) ve aktif izoformlardır. Ancak bu formlar arası ilişki ve kinetiklerinin biyokimyasal karakterizasyonu henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Tirozinazın aktif bölgesinde iki adet bakır atomunun bulunduğu bilinmektedir. Şimdiye kadar en iyi karakterize edilmiş tirozinazlar ise Streptomyces glausescens, Neurospora crassa ve Agaricus bisporus’a aittir (2). Özellikle A. bisporus’a ait olan tirozinaz, memelilerdeki tirozinaz ile homolog yapıda olduğundan melanogenezle ilgili çalışmalarda iyi bir model oluşturmaktadır (10). Aşağıdaki şekilde (Şekil 2.73.), tirozinaz enziminin binükleer bakır aktif bölgesi (C), oksijenler (O) ve histidin (His-N) (H) aminoasiti ile şematize edilmiştir. Altı adet histidinin, enzimin aktif bölgesindeki bakır atomlarıyla bağlandığı, bu bakır atomlarının da moleküler oksijen ve kendisinin fenolik substratı (örneğin inhibitörler) ile etkileştiği bilinmektedir (144). 50 Şekil 2.73. Tirozinaz enziminin binükleer bakır aktif merkezi (C). Tirozinaz, melanin biyosentez yolağında anahtar rolündeki iki önemli reaksiyonu katalizlemektedir. Bunlardan ilki, daha sonra L-DOPA’ya dönüşecek olan tirozin aminoasitine hidroksil grubunun katılması, ikincisi ise L-DOPA’nın o- dopakinona oksidasyon reaksiyonuyla dönüştürülmesidir. Bu iki ana basamaktan sonra ileri enzimatik basamaklarla melanin oluşturulmaktadır (Şekil 2.74.) (1). L- Tirozinin melanine dönüştüğü bu enzimatik oksidasyon, melaninin pek çok işleve sahip olmasından dolayı büyük öneme sahiptir. HO COOH NH2 HO COOH NH2 HO O COOH NH2 O Tirozin L-DOPA Dopakinon Tirozinaz (Monofenolaz) N H HO HO COOH N O O COOH H N H HO HO N H O O LödopakromDopakromDHI - CO2 Tirozinaz İndol-5,6-kinon Tautomeraz N H HO HO COOH DHICA Oksidaz N H O O COOH İndole-5,6-kinon- karboksilik asit HO COOH NH2 HO S H2N COOH Sisteininldopa COOH NH2 HO N S 1,4-Benzotiazinilalanin Glutatyon veya Sistein Eumelanin Pheomelanin Karışım melaninler Eumelanogenez Pheomelanogenez Tirozinaz (Difenolaz) Şekil 2.74. Melanin pigmentinin biyosentetik yolağı. (DOPA, 3,4- dihidroksifenilalanin; DHI, 5,6-dihidroksindol; DHICA, 5,6- dihidroksindol-2- karboksilik asit) 51 Tirozinaz enziminin öngörülen katalitik mekanizması ise aşağıdaki gibidir (Şekil 2.75.). Tirozinaz monofenolün orto-hidroksilasyonunu ve bunu takip eden ilgili orto-kinonun kateşole dönüşümünü katalizlemektedir (145). Şekil 2.75. Tirozinaz enziminin öngörülen katalitik mekanizması. Meyve, sebze ve deniz ürünleri gibi gıdalarda oluşan enzimatik kararma, gıdanın renk kalitesi ile aromalarının bozulması ve besin değerlerinin kaybıyla ilişkilendirilmektedir. Enzimatik kararma, hücre yapısının parçalanmasına neden olan fırçalama, soyma ve parçalama işlemleri sonrasında oksijen varlığında; tirozinaz ve onun polifenolik substratlarının karışmasıyla oluşmaktadır (146). Enzimatik kararma oranı; tirozinaz ve fenolik substratların konsantrasyonu, oksijen miktarı, pH, sıcaklık vb. f