T.C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ORGANOSFATLARA MARUZİYET SONRASINDA OLUŞAN PROTEİN EKLENTİ ÜRÜNLERİNİ TANIYAN MONOKLONAL ANTİKORUN KARAKTERİZASYONU Ecz. Seda ÖNDER Biyokimya Programı DOKTORA TEZİ ANKARA 2018 T.C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ORGANOSFATLARA MARUZİYET SONRASINDA OLUŞAN PROTEİN EKLENTİ ÜRÜNLERİNİ TANIYAN MONOKLONAL ANTİKORUN KARAKTERİZASYONU Ecz. Seda ÖNDER Biyokimya Programı DOKTORA TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Özden TACAL İKİNCİ DANIŞMAN Prof. Dr. Oksana LOCKRIDGE ANKARA 2018 iii ONAY SAYFASI iv YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI v ETİK BEYAN vi TEŞEKKÜR “Ne başarırsanız başarın, size yardım eden birileri ve teşekkür edilesi insanlar vardır” Althea Gibson Sabrı-azmi-bilmi ve her şeyden önemlisi önce ‘doğru insan, doğru bilim insanı’ olmayı öğreten, lisans ve lisansüstü eğitimim boyunca bana bir duruş-bir bakış ve hayatıma yepyeni vizyonlar kazandıran, her aşamada hiç vazgeçmeden benimle beraber mücadele eden ve bugün ‘bu hayali’ gerçeğe dönüştüren, çok saydığım-tarifsiz sevdiğim, doktora tez danışmanım Prof. Dr. Özden TACAL’a Doktora eğitimime başlamam için ilk adımı atmamı sağlayan, manevi desteğini hiçbir aşamada esirgemeyen ve bu süreçte ‘sebat etmeyi’ öğreten Doç. Dr. N. Tuğba KANDİLCİ’ye Tez çalışmamın deneyleri için laboratuvarlarını açıp-bana emanet eden ve bilimsel deneyim kazanmam için tüm imkanlarını sunmaya devam eden Prof. Dr. Oksana LOCKRIDGE, Lawrence M. SCHOPFER ve Alica DAFFENER’a Mükemmel bir hayat sağlayan ve hayatımın her evresinde her zaman destek olan harika ailem-Hüseyin-Asuman-Sude ÖNDER’e, Aslı-Hakan-Burcu KILAR’a Doktora programı süresince 2211-Yurt İçi Lisans Üstü Burs kapsamında beni destekleyen TÜBİTAK’a Sonsuz teşekkürler. vii ÖZET Önder, S. Organosfatlara Maruziyet Sonrasında Oluşan Protein Eklenti Ürünlerini Tanıyan Monoklonal Antikorun Karakterizasyonu. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Biyokimya Programı Doktora Tezi, Ankara, 2018. Organofosfat (OP) pestisitler, kolinesterazların [asetilkolinesteraz (AChE) ve bütirilkolinesteraz (BChE)] tersinmez inhibitörüdür. OP’ler, akut toksik etkisini AChE’nin aktif bölgesindeki serin amino asidine kovalent bağlanarak göstermektedir. Aktif bölgede serin içermeyen proteinler (örneğin albümin) ise, tirozin ve lizin amino asitlerinden OP bileşikler ile kovalent olarak modifiye edilmektedir. OP’lerin tirozin amino asidi ile yaptığı kovalent bağ, serin ile yaptığı kovalent bağa göre daha stabildir. AChE ve BChE inhibisyonu, OP pestisitlere maruziyet sonrasında ortaya çıkan kronik hastalıkların nedenini açıklayamamaktadır. Kronik OP toksisitesinin nedeninin aydınlatabilmesi için yeni biyobelirteçlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışmanın amacı, yeni biyobelirteçlerin belirlenmesinde kullanılmak üzere tirozine bağlı protein eklenti ürünlerini tanıyan bir monoklonal antikor tasarlamak ve karakterize etmektir. Çalışmada, farklı amino asit dizilerine sahip dietoksifosfotirozin peptitleri sentezlenip 4 farklı taşıyıcı proteine konjuge edildi. Konjuge proteinler kullanılarak hibridoma teknolojisi ile depY olarak isimlendirilen monoklonal antikor üretildi. DepY antikoru saflaştırıldı ve bağlanma afinitesi ve özgüllüğünü belirlemek için ELISA, Western Blot, Biocore, Octet teknolojisi ile karakterize edildi. Sonuçlar, depY antikorun, amino asit dizisinden bağımsız olarak sadece dietoksifosfotirozin modifiye protein ve peptitleri tanıdığını gösterdi. Ayrıca HEK293 hücre lizatları, klorprifos okson ile muamele edildi. Triptik peptitler, depY-Sefaroz reçine ile saflaştırılıp kütle spektrometri ile analiz edildiğinde; 73 proteine ait 116 dietoksifosfotirozin modifiye peptit tanımlandı. Sonuç olarak, depY monoklonal antikoru, OP maruziyetinin yeni biyobelirteçlerinin tanımlanmasında ve herhangi bir türdeki dietoksifosfotirozin modifiye proteinlerin belirlenmesinde yararlı olacaktır. Anahtar Kelimeler: Organofosfat, klorprifos okson, depY monoklonal antikor, dietoksifosfotirozin, kütle spektrometri. Bu tez, TÜBİTAK BİDEB 2211-A kapsamında desteklenmiştir. viii ABSTRACT Onder S., Characterization of Monoclonal Antibody that Recognize Protein Adducts After Exposure to Organophosphates. Hacettepe University Institute of Health Sciences Ph. D. Thesis in Biochemistry, Ankara, 2018. Organophosphorus (OP) pesticides are irreversible inhibitors of cholinesterases [acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE)]. The OPs cause the acute toxic effect by covalent binding to a serine amino acid in the active site of AChE. Proteins that have no active site serine, such as albumin, are covalently modified by OPs on tyrosine and lysine. The covalent bond of OP compounds with tyrosine is more stable than with serine. Chronic illness from OP pesticides exposure is not explained by inhibition of AChE and BChE. New biomarkers are needed to elucidate the cause of chronic toxicity. The goal of this study was to design and characterize monoclonal antibody that recognizes protein adducts on tyrosine that would be useful in the identification of new biomarkers. Various diethoxyphosphate-tyrosine peptides were synthesized and cross-linked to 4 different carrier proteins. Monoclonal antibody called as depY were produced with hybridoma technology using the conjugated proteins. DepY antibody was purified and characterized by ELISA, Western Blot, Biocore, Octet technology to determine binding affinity and binding specificity. The results showed that depY recognizes diethoxyphospho-tyrosine modified proteins and peptides independent of the surrounding amino acid sequence. Furthermore, HEK293 cell lysates were treated with chlorpyrifos oxon. When tryptic peptides immunopurified with depY-Sepharose were analyzed by mass spectrometry, 116 diethoxyphosphate- tyrosine modified peptides from 73 proteins were identified. Consequently, the use of depY monoclonal antibody could be useful for identifying novel biomarkers of OP exposure and for analyzing modified proteins in any species. Keywords: Organophosphate, chlorpyrifos oxon, depY monoclonal antibody, diethyloxyphosphate-tyrosine, mass spectrometry. This thesis was supported by TÜBİTAK (2211-A). ix İÇİNDEKİLER ONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER VE KISALTMALAR xiii ŞEKİLLER xv TABLOLAR xvii 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Organofosfatlar 3 2.1.1. Organofosfatların Genel Kimyasal Yapısı 4 2.2. Organofosfat Pestisitler 7 2.3. Klorprifos 8 2.3.1. Klorprifosun Kimyasal Yapısı ve Fiziksel Özellikleri 8 2.3.2. Klorprifosa Maruziyet 9 2.3.3. Klorprifos Metabolizması 9 2.4. Klorprifos için Hedef Proteinler 11 2.4.1. Asetilkolinesteraz: Klorprifosun Birincil Hedefi 11 2.4.2. Nöropati Target Esteraz 14 2.4.3. Bütirilkolinesteraz 14 2.4.4. Serin Hidrolazlar 18 2.4.5. Düşük Doz OP Maruziyeti 19 2.4.6. Diğer Klorprifos Hedefleri 19 2.4.7. Beta Glukronidaz 20 2.4.8. Açilpeptit Hidrolaz 20 2.4.9. Reseptörler 21 2.4.10. Albümin 22 2.4.11. Tübülin 23 x 2.5. Tirozin 25 3. GEREÇ VE YÖNTEM 29 3.1. Gereçler 29 3.2. Yöntemler 30 3.2.1. Dietoksifosfotirozin İçeren Peptitlerin Hazırlanması 30 3.2.2. Dietoksifosfotirozin Modifiye Peptitlerin Saflaştırılması 31 3.2.3. Dietoksifosfotirozin Modifiye Peptitler için Amino Asit Miktar Tayini ve Spektrumlarının Analizi 31 3.2.4. Dietoksifosfotirozin Modifiye Peptitlerin Taşıyıcı Proteinlere Konjugasyonu 32 3.2.5. MALDI-TOF Kütle Spektrometri ile Taşıyıcı Proteinlere Bağlı Dietoksifosfotirozin Modifiye Peptit Sayılarının Belirlenmesi 33 3.2.6. Proteinlerin Klorprifos Okson ile Muamele Edilmesi 33 3.2.7. Monoklonal Antikor Üretimi 34 3.2.8. Monoklonal Antikorun Saflaştırılması 35 3.2.9. Saflaştırılmış DepY’nin İzotipinin Belirlenmesi 35 3.2.10. DepY İmmobilize Sefaroz Reçinenin Hazırlanması 35 3.2.11. ELISA 36 3.2.12. Western Blot Analizi 36 3.2.13. İnsan Serum Albümine Konjuge Dietoksifosfolizinin Hazırlanması ve DepY Monoklonal Antikor ile ELISA 37 3.2.14. Klorprifos Okson, Diklorvos ve Krezil Saligenin Fosfat ile Modifiye İnsan BChE’nin Hazırlanması ve DepY Monoklonal Antikor ile ELISA 37 3.2.15. Diklorvos ile Modifiye Peptitlerin Hazırlanması ve DepY Monoklonal Antikor ile İmmuno MALDI 38 3.2.16. IC50 Değerinin Yarışmalı ELISA ile Belirlenmesi 39 3.2.17. Kd Değerinin Bio-Layer İnterferometri ile Belirlenmesi 39 3.2.18. Kd Değerinin Biacore Analizi ile Belirlenmesi 40 3.2.19. DepY Monoklonal Antikor ile Tanımlanabilen En Düşük Antijen Miktarının Western Blot Analizi ile Belirlenmesi 40 xi 3.2.20. İnsan Serum Albümine Konjuge O-fosfo-L-tirozinin Hazırlanması ve PY20 Monoklonal Antikor ile Western Blot Analizi 40 3.2.21. Hücre Lizatlarının Hazırlanması ve Klorprifos Okson ile Muamele edilmesi 41 3.2.22. Hücre Lizatlarının ELISA ile Analizi 43 3.2.23. Hücre Lizatlarının Kapiller Elektroforez- Western Blot ile Analizi 43 3.2.24.Kütle Spektrometri Analizleri için Hücre Lizat Örneklerinin Hazırlanması 43 3.2.25.Triple-TOF 6600 Sıvı Kromatografi Tandem Kütle Spektrometri 45 3.2.26. OrbiTrap Fusion Lumos Sıvı Kromatografi Tandem Kütle Spektrometri 46 4. BULGULAR 48 4.1. OP-Peptitlerin Soğurma Katsayıları 48 4.2. Taşıyıcı Proteinlere Konjuge Dietoksifosfotirozin Modifiye Peptitlerin ve Kontrol Peptitlerin Sayısı 48 4.3. Klorprifos Okson ile Muamele Edilen Proteinlerde Modifiye Olan Amino Asitler ve Miktarları 51 4.3.1. İnsan Albümini 51 4.3.2. Fare Albümini 52 4.3.3. Aprotinin 53 4.3.4. Kazein 53 4.3.5. Sığır Tübülin 56 4.3.6. Domuz Tübülin 58 4.4. DepY Monoklonal Antikor İzotipi 62 4.5. DepY Monoklonal Antikor Farklı Amino Asit Dizisine Sahip Dietoksifosfotirozin Modifiye Proteinleri Tanımaktadır 62 4.6. DepY Monoklonal Antikor Dietoksifosfolizin Modifiye Proteinleri Tanımamaktadır 65 4.7. DepY Monoklonal Antikor CBDP, Diklorvos ve CPO Modifiye İnsan BChE’yi Tanımamaktadır 65 4.8. DepY Monoklonal Antikor Diklorvos Modifiye Tirozini Tanımamaktadır 66 xii 4.9. Dietoksifosfotirozin Modifiye Domuz Tübülinin DepY Monoklonal Antikora Bağlanma Afinitesinin Yarışmalı ELISA ile Analizi 68 4.10. Dietoksifosfotirozin Modifiye Proteinlerin DepY Monoklonal Antikora Bağlanma Afinitesinin Bio-Layer İnterferometri ile Analizi 68 4.11. Dietoksifosfotirozin Modifiye Peptitlerin DepY Monoklonal Antikora Bağlanma Afinitesinin Biacore ile Analizi 71 4.12. DepY Monoklonal Antikor ile Tanımlanabilen En Düşük Antijen Miktarının Belirlenmesi 72 4.13. Anti-fosfo-L-tirozin Monoklonal Antikorun (PY20) Dietoksifosfotirozin Modifiye Proteinleri Tanımamaktadır 73 4.14. Klorprifos Okson ile Muamele Edilen HEK 293 Hücre Lizatlarının ELISA ile Analizi 74 4.15. Klorprifos Okson ile Muamele Edilen HEK 293 Hücre Lizatlarının Kapiller Elektroforez- Western Blot ile Analizi 74 4.16. Klorprifos Okson ile Muamele Edilen HEK 293 Hücre Lizatlarının LC-MS/MS Kütle Spektrometri ile Analizi 76 5. TARTIŞMA 88 5.1. Hedef Olarak Dietoksifosfotirozinin Seçilme Nedeni 88 5.2. Literatürde OP Eklenti Ürünlerini Tanıyan Antikorlar 89 5.3. Aktif Bölgesinde Serin İçermeyen Proteinlerde Tirozin ve Lizin Amino Asitleri, Serine Göre Daha Reaktiftir 89 5.4. DepY Monoklonal Antikor Seçiciliği 90 5.5. DepY Monoklonal Antikor için Afinite 91 5.6. CPO ile Tirozin üzerinden Kovalent Olarak Modifiye Edilen Proteinler 92 5.7. Fizyolojik İlişki 93 5.8. Fosfo-tirozin Bölgeleri ile Reaksiyon 94 5.9. Diğer OP Çalışması ile Karşılaştırma 95 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 97 7. KAYNAKLAR 98 8. ÖZGEÇMİŞ xiii SİMGELER VE KISALTMALAR ACh Asetilkolin AChE Asetilkolinesteraz Arg Arjinin BChE Bütirilkolinesteraz BG Beta-glukuronidaz BSA Sığır serum albümini CBDP Krezil saligenin fosfat CID Çarpışma indüklü disosiyasyon CPF Klorprifos CPO Klorprifos okson Cys Sistein DEP Dietoksifosfat DepY Dietoksifosfotirozin modifiye proteinleri tanıyan monoklonal antikor DETP Dietiltiyofosfat DFP Diizopropilflorofosfat DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DTT Ditiyotreitol EDC 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karboimid EPA Çevre Koruma Ajansı FBS Fötal sığır serumu FP Florofosfat Gly Glisin HCD Yüksek enerji çarpışma indüklü disosiyasyon HEK 293 İnsan embriyonik böbrek hücreleri His Histidin HPLC Yüksek performanslı sıvı kromatografisi HRP HSA Yaban turpu peroksidaz İnsan serum albümin IC50 %50 inhibisyona neden olan konsantrasyon Kd Disosiyasyon sabiti LC-MS /MS Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometri Sistemi xiv Lys Lizin MALDI Matriks ile desteklenmiş lazer desorpsiyon/iyonizasyon MES 2- [N-morfolino] etansülfonik asit MS Kütle spektrumu NHS N-hidroksisüksinimid NMDA N-metil-D-aspartat NTE Nöropati target esteraz OP Organofosfat OPD o-fenilendiamin PBS Fosfat ile tamponlanmış salin PON-1 Paraoksonaz PVDF Polivinilidenflorit SDS-PAGE Sodyum dodesil sülfat poliakrilamit jel elektroforezi Ser Serin TBS Tris ile tamponlanmış salin TBST %0.05 Tween 20 içeren Tris ile tamponlanmış salin TCP 3,5,6-trikloro-2-piridinol TFA Trifloroasetik asit Thr Treonin TMB 3,3’,5,5’-Tetrametilbenzidin Tyr Tirozin UHPLC Ultra-yüksek basınçlı sıvı kromatografisi UNMC Nebraska Üniversitesi Tıp Fakültesi WHO Dünya Sağlık Örgütü α-CHCA α-Siyano-4-hidroksisinnamik asit xv ŞEKİLLER Şekil Sayfa 2.1. Klorprifos kimyasal yapısı 8 2.2. Klorprifosun metabolik biyoaktivasyonu 10 2.3. Asetilkolinesterazın aktif bölgesindeki katalitik serinin klorprifos ile konjugasyonu 12 2.4. Asetilkolinesterazın OP yapılı bileşikler tarafından inhibisyonu, yaşlanma reaksiyonu ve nükleofilik ajan aracılığıyla reaktivasyonu 13 2.5. OP bileşiklerin biyoaktivasyonu ve BChE ile etkileşimi 15 2.6. OP ile modifiye insan BChE aktif bölge peptidinin MS/MS spektrumu 16 2.7. Pepsin ile parçalanan OP ile modifiye BChE 17 2.8. Soman ile modifiye serin için beta-eliminasyon reaksiyonunun şematik diyagramı 18 2.9. CPF ve CPO’nun albümin ve BChE üzerindeki eklenti ürünleri 22 2.10. OP ile modifiye beta tübülini tanımlayan MS/MS spektrumu 24 2.11. Fare beyninde anormal mikrotübül yapısını gösteren atomik kuvvet mikroskobu görüntüsü 25 2.12. Tirozinat anyonunun klorprifos okson ile reaksiyonu. 27 3.1. CPO ile muamele edilmiş hücre lizatları ile çalışma planı 42 4.1. Kütle spektrometri ile BSA’ya konjuge dietoksifosfotirozin modifiye peptitlerin sayısının belirlenmesi 49 4.2. İnsan albüminin (P02768) amino asit dizisi 51 4.3. Fare albüminin (P07724) amino asit dizisi 52 4.4. Sığır Aprotininin (P00974) amino asit dizisi 53 4.5. Alfa S1 kazein (P02662) izoformunun amino asit dizisi 54 4.6. Alfa S2 kazein (P02663) izoformunun amino asit dizisi 54 4.7. Beta kazein (P02666) izoformunun amino asit dizisi 55 4.8. Kappa kazein (P02668) izoformunun amino asit dizisi 56 4.9. Sığır tübülin alfa-1B zincirinin (P81947) amino asit dizisi 56 4.10. Sığır tübülin beta-4B zincirinin (E1B953) amino asit dizisi 57 4.11. Domuz tübülin alfa-1A zincirinin (P02550) amino asit dizisi 58 4.12. Domuz tübülin alfa-1B zincirinin (Q2XVP4) amino asit dizisi 60 xvi 4.13. Domuz tübülin beta zincirinin (Q767L7) amino asit dizisi 61 4.14. CPO-modifiye YGGFL ve diklorvos-modifiye GGYR peptitler için depY monoklonal antikor ile immüno MALDI 67 4.15. DepY’nin CPO modifiye domuz tübülin için bağlama afinitesi 68 4.16. DepY’nin bağlama afinitesinin bio-layer interferometri ile analizi 69 4.17. DepY monoklonal antikor ile HSA’ya konjuge YGGFL-DEP peptidinin Western Blot görüntüsü 72 4.18. Anti-fosfo-L-tirozin monoklonal antikor (PY20) ile Western Blot görüntüsü 73 4.19. DepY’nin CPO ile muamele edilmiş HEK 293 hücre lizatlarındaki proteinlerle etkileşiminin ELISA ile analizi 74 4.20. DepY’nin HEK 293 hücre lizatlarındaki dietoksifosfotirozin modifiye proteinler ile etkileşiminin kapiller elektroforez-Western blot ile Analizi 75 4.21. 60S ribozomal protein L6 proteinine (Q02878) ait dietoksifosfat ile modifiye YYPTEDVPR peptidin MS/MS spektrumu 87 5.1. Klorprifos okson ve tirozin arasında gerçekleşen tepkime 93 xvii TABLOLAR Tablo Sayfa 2.1. Organofosfat yapılı bileşiklerin genel kimyasal yapısı 4 2.2. Kimyasal silah ve pestisit olarak kullanılan organofosfat yapılı bileşiklerin kimyasal yapılarına göre sınıflandırılması 5 3.1. Dietoksifosfotirozin içeren peptitlerin hazırlanmasında kullanılan peptitler 31 3.2. Taşıyıcı proteinlere bağlı dietoksifosfotirozin modifiye peptitler 32 3.3. CPO ile modifiye olan proteinler 34 4.1. Taşıyıcı proteine konjuge dietoksifosfotirozin modifiye peptitlerin sayısı 50 4.2. Taşıyıcı proteine konjuge kontrol peptitlerin sayısı 50 4.3. İnsan albümini için dietoksifosfat ile modifiye amino asitler 51 4.4. Fare albümini için dietoksifosfat ile modifiye amino asitler 52 4.5. Aprotinin için dietoksifosfat ile modifiye amino asitler 53 4.6. Alfa S1 kazein için dietoksifosfat ile modifiye ve fosforile olan amino asitler 54 4.7. Alfa S2 kazein için dietoksifosfat ile modifiye amino asitler 55 4.8. Beta kazein için dietoksifosfat ile modifiye ve fosforile olan amino asitler 55 4.9. Kappa kazein için dietoksifosfat ile modifiye amino asitler 56 4.10. Sığır tübülin alfa-1B zinciri için dietoksifosfat ile modifiye amino asitler 57 4.11. Sığır tübülin beta-4B zinciri için dietoksifosfat ile modifiye amino asitler 57 4.12. Domuz tübülin alfa-1A zinciri için dietoksifosfat ile modifiye amino asitler 59 4.13. Domuz tübülin alfa-1B zinciri için dietoksifosfat ile modifiye amino asitler 60 4.14. Domuz tübülin beta zinciri için dietoksifosfat ile modifiye amino asitler. 61 4.15. DepY monoklonal antikorun, farklı amino asit dizisine sahip dietoksifosfotirozin modifiye proteinleri ve peptitleri tanıması 64 4.16. DepY’nin CPO-modifiye ve kontrol proteinleri bağlamasına ilişkin bio-layer interferometri sonuçları 70 4.17. Dietoksifosfotirozin modifiye peptitlerin depY monoklonal antikora bağlanma afinitesinin Biacore ile Analizi 71 4.18. CPO (1 mM) ile muamele edilmiş HEK 293 hücre lizatı içerisinde tirozinden modifiye olan peptitler/proteinler 78 xviii 4.19. CPO (10 µM ve 250 µM) ile muamele edilmiş HEK 293 hücre lizatı içerisinde tirozinden modifiye olan peptitler/proteinler 84 4.20. CPO (10 µM, 250 µM ve 1000 µM) ile muamele edilmiş HEK 293 hücre lizatı içerisinde lizinden ve serinden modifiye olan peptitler/proteinler 86 5.1. DepY monoklonal antikorun bağlanmadığı haptenler 91 1 1. GİRİŞ Organofosfatlar (OP), merkezi ve otonom sinir sisteminde, asetilkolinesterazın (AChE) aktif bölgesindeki serin amino asidine geri dönüşümsüz şekilde bağlanarak dokularda asetilkolin (ACh) birikimine neden olmaktadır. ACh birikimi ile muskarinik ve nikotinik reseptörlerin aşırı uyarılması ile kolinerjik etkiler ortaya çıkmakta ve akut toksisite meydana gelmektedir (1, 2). Düşük dozlardaki OP maruziyeti sonucu oluşan kronik hastalıkların mekanizması şimdiye kadar aydınlatılamamıştır. AChE aktivitesini etkilemeyen dozlardaki OP pestisitlere maruz kalan işçilerde, daha sıklıkla anksiyete bozukluğu, majör depresyon, dikkat dağınıklığı ve ekstrapiramidal semptomlar görülmüştür (3, 4). AChE inhibisyonu ile ilişkili olmayan OP kaynaklı nörotoksisite mekanizmasını açıklayabilmek için araştırmalar halen devam etmekte olup, düşük doz OP toksisitesinde birçok proteininin ilişkili olabileceği düşünülmektedir. Bugüne kadar yapılan in vivo çalışmalar sonucunda; OP pestisitleri tarafından modifiye edilen proteinlerin AChE, bütirilkolinesteraz (BChE), karboksilesteraz ve albümin olduğu rapor edilmiştir (5). OP pestisitlerinden klorprifosa (CPF) maruziyetten 49 gün sonra, insan serum albüminin 411. pozisyonda bulunan tirozin amino asidi üzerinde dietoksifosfat eklenti ürününün saptandığı gösterilmiştir (6). Ancak albümin tek başına nörotoksisiteyi açıklayamamaktadır ve sonuçlar OP toksisitesinde serin hidrolazlara ek olarak başka proteinlerin de rol oynadığını göstermektedir. Proteinlerde bulunan tüm tirozinler, OP yapılı bileşikler ile reaksiyona girmemektedir. Tirozinin reaktivitesi, pozitif yüklü bir amino asidin tirozine 6 Å’luk yakınlığı ile kolaylaşmaktadır (7). Tirozin-OP eklenti ürünü oluştuktan sonra stabil kalmaktadır. Buna ek olarak, kolinesterazların aktif bölgesindeki serin amino asidi üzerinde gerçekleşen ve yaşlanma (aging) adı verilen reaksiyon, tirozin amino asidi üzerinde gerçekleşmemektedir (8-10). Tüm bu özellikler, OP’ler ile reaksiyona giren diğer proteinlerin kimliğinin ortaya konması ve antikor üretiminde uygun adayların belirlenmesi için tirozin-OP eklenti ürünlerini, antijen olarak çekici hale getirmektedir. Bu doktora tez çalışmasında, tirozin etrafındaki amino asit dizisinden bağımsız olarak, dietoksifosfotirozin ile modifiye proteinleri yüksek afinite ve duyarlılık ile tanıyan bir monoklonal antikor (depY) üretilmiş ve detaylı olarak karakterize edilmiştir. Bununla birlikte, OP yapılı bileşiklerin, hangi proteinleri modifiye ettiği 2 kütle spektometri yöntemi kullanılarak araştırılmıştır. DepY antikorun, OP bileşiklere maruziyet sonrasında yeni biyobelirteçlerin tanımlanmasında ve kronik nörotoksisite mekanizmasının aydınlatılmasında faydalı olacağı düşünülmektedir. 3 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Organofosfatlar Pestisitlerin ana sınıflarından birini oluşturan organofosfatlar, ilk kez 1854 yılında Philippe de Clermont tarafından tetraetilpirofosfat olarak sentezlenmiştir. 1932 yılında, dimetil ve dietil fosfofloridat sentezlerinin tanımlanması ile OP esterlerinin, insanlarda görme ve solunum fonksiyonları üzerinde toksik etkilerinin olduğu gösterilmiştir. 1937 yılında Alman kimyacı Gerhard Schrafer tarafından antikolinesteraz etkili OP bileşiklerinin genel kimyasal yapısı tanımlanmış ve ilk ticari OP insektisiti ve paratyon sentezlenmiştir (11, 12). Tarım alanında başlıca pestisit olarak kullanılan OP’lerin, tıp ve endüstriyel alanında lubrikant, solvent ve yangın geciktirici olarak kullanımı da bulunmaktadır (13). İkinci Dünya Savaşı sırasında pestisit olarak kullanımı dışına çıkılarak, kimyasal savaş ajanı olarak kullanılmak üzere daha toksik OP yapılı bileşikler sentezlenmiştir (12). Sinir gazları olarak da adlandırılan bu ajanlardan sarin kullanılarak Japonya’da terörist saldırıları düzenlenmiştir (14). OP yapılı bileşiklerin primer hedefi olarak; bu bileşikler varlığında tersinmez olarak inhibe edilen kolinesterazlar gösterilmektedir (15). 1950’lerin sonlarına doğru, AChE ve BChE’nin diizopropilflorofosfat (DFP) ile reaksiyonu sonrasında oluşan eklenti ürünlerinin, kolinesterazların aktif merkezinde bulunan serin amino asidi üzerinde olduğu gösterilmiştir (15, 16). 1963 yılında, her iki enzim için OP’ler tarafından modifiye edilen serin etrafındaki amino asit dizileri Sanger tarafından tanımlanmıştır (16). Ayrıca Sanger aynı yıl, insan serum albümininde (HSA) dizilediği ArgTyrThrLys peptit sekansındaki tirozin amino asidinin, DFP ile kovalent etkileşime girerek modifiye olduğunu göstermiştir ve bu gözlem 2005 yılında yeniden doğrulanmıştır (17). Son yıllarda kolinesterazlardan başka farklı proteinler kullanılarak yapılan çalışmalar sonucunda, OP’lerin tirozin ve lizin amino asitleri ile kovalent etkileşimde bulunduğu rapor edilmiştir (7, 10, 18). Bu durum, OP yapılı bileşiklerin, kolinesterazların aktif bölgesinde bulunan serin amino asidi dışında başka hedeflerinin de olduğunu göstermektedir (7, 10, 18). 4 2.1.1. Organofosfatların Genel Kimyasal Yapısı Organofosfatlar, fosforik asit esterleri ve türevlerinden oluşmaktadır. Genel kimyasal yapısı (Tablo 2.1.), merkezi bir fosfor atomu ve ona çift bağ ile bağlı sülfür veya oksijen atomu şeklindedir (12). OP’ler, kolinesterazları fosforillerken, hidrolize en duyarlı ve ayrılan grup (X), enzimin aktif bölgesinde bulunan serin amino asidinin hidroksil oksijeni ile nükleofilik olarak yer değiştirmektedir (11). Tablo 2.1. Organofosfat yapılı bileşiklerin genel kimyasal yapısı. Organofosfat türü Kimyasal yapı Okso-fosforil bileşikler Tiyo-fosforil bileşikler Ayrılan grubun karakteristik özelliklerine göre OP yapılı bileşikler, 4 ana gruba ayrılmaktadır: 1. grup OP’ler, kimyasal silah olarak geliştirilen fosforilkolinlerdir ve ayrılan grupta dörtlü azot grubu içermektedir (Ör. shradan). 2. grup OP’ler, ayrılan grupta flor içeren florofosfatlardır ve hem toksisiteleri hem de işlevleri açısından 1. grup OP’lere benzemektedir (Ör. diizopropilflorofosfat). 3. grup OP’lerde, ayrılan grupta siyanür veya flor dışında farklı bir halojen bulunmaktadır. Bu grup bileşikler, 1. ve 2. grup OP yapılı bileşiklere göre daha az etkilidir (Ör. paratyon). 4. grup OP’ler ise, günümüzde insektisit olarak kullanılan OP yapılı bileşikleri içermektedir ve ayrılan grupta alkoksi, alkiltiyo, ariloksi, ariltiyo veya heterosiklik yapılar, yer almaktadır (19). OP’lerin yapısındaki R1 ve R2, yan grupları, fosfor atomuna doğrudan (fosfonatlar veya fosfinatlar) ya da oksijen veya sülfür atomu aracılığı ile (fosforotiyoat) bağlanmaktadır. En basit OP’lerin yapısındaki R1 ve R2 grupları genellikle aynı olup, metil, etil, izopropil vb. kısa alkil zincirleri bulunmaktadır (12). Pestisit veya kimyasal silah olarak kullanılan OP yapılı bileşikler, R1, R2 yan gruplarının ve ayrılan grubun (X) karakteristik özelliklerine göre birçok gruba ayrılmaktadır. Bu gruplar Tablo 2.2.’de özetlenmiştir (12). 5 Tablo 2.2. Kimyasal silah ve pestisit olarak kullanılan organofosfat yapılı bileşiklerin kimyasal yapılarına göre sınıflandırılması. Organofosfat türü Kimyasal yapı Örnek Fosfatlar O,O’ Dialkil-fosfat Tri-o-krezil fosfat, diklorvos Tiyofosfatlar O,O’ Dialkil-tiyofosfat Klorprifos, diazinon O,O’ Dialkil- fosforoditiyoat Malatyon, dimetoat O-Alkil, S-alkil fosforoditiyoat Fosmet Fosforotiyoat O,O’ Dialkil- fosforotiyoat Amiton, ometoat O-Alkil, S-alkil fosforotiyoat Trifenofos 6 Tablo 2.2. (Devam) Kimyasal silah ve pestisit olarak kullanılan organofosfat yapılı bileşiklerin kimyasal yapılarına göre sınıflandırılması. Organofosfat türü Kimyasal yapı Örnek Fosforoamidat O,O’ Dialkil fosforoamidat Fenamifos O-Alkil, S-alkil fosforotiyoamidat Metamidofos O,O’ Dialkil fosforotiyoamidat İsofenos Fosfonofloridat O-Alkil, alkil fosfonofloridat Soman, sarin (Kimyasal silah-sinir gazı) Fosforofloridat O,O’ Dialkil fosforofloridat Diizopropil fosforo floridat (DFP) Fosfonotiyonat O-Alkil, alkil fosfonotiyonat Leptofos 7 2.2. Organofosfat Pestisitler Pestisitler, tarımda bitkilerin korunması veya halk sağlığında vektör kaynaklı hastalıkların önlenmesi amacı ile kullanılan, çeşitli yapı ve fonksiyonel gruplara ayrılmış kimyasal maddelerdir. (20). Dünya çapında pestisit kullanımı yıllık beş milyar kilogram iken (21), Türkiye’de pestisit kullanımı dünyadaki kullanımının sadece %1’lik kısmını oluşturmaktadır (22). OP pestisitleri, böcek ve pestlere karşı daha seçici olmaları ve daha az miktarda kalıntı bırakmaları nedeniyle dünya genelinde daha sıklıkla kullanılmaktadır (22). Paratyon, malatyon, klorprifos, diazinon ve fosmet yaygın olarak kullanılan OP pestisitlerine örnek olarak verilebilir (13). Klorprifos gibi 4 milyar kg OP pestisit, her yıl, tarım alanlarına uygulanmaktadır, ancak bunun çok az miktarı pestleri hedeflemekte, geri kalan kısmı ise çevreyi kirletmektedir (23). Avrupa’da, bebek maması ve işlenmiş gıda dahil olmak üzere pek çok ürünün 250’den fazla farklı OP’ler ile kontamine olduğu ve buna ek olarak, meyve, sebze ve tahılların yaklaşık %50’sinin OP pestisit kalıntıları içerdiği bildirilmiştir (24). OP pestisitlerinin dünya çapında yaygın kullanımı ile, tarım çalışanlarına ek olarak genel popülasyon da genellikle düşük konsantrasyonlarda farklı kimyasal yapıya sahip çeşitli pestisitlerin kombinasyonlarına maruz kalmaktadır (20). Bu maruziyet, kanser, nörodejeneratif kronik hastalık, nörotoksisite, üreme ve gelişimsel bozukluğun oluşumunda önemli bir risk oluşturmaktadır (25-27). Dünya Sağlık Örgütü (WHO), yılda yaklaşık üç milyon kişinin kasıtsız olarak akut pestisit zehirlenmesine maruz kaldığını ve 346.000 kişinin öldüğünü; intihar amaçlı iki milyon pestisit zehirlenmesi vakası olduğunu ve bu vakaların, 370.000’in ölümle sonuçlandığını bildirmiştir (28). OP bileşiklerinin, halk sağlığı üzerindeki toksik etkilerinin aydınlatılması, bazı gelişmiş ülkelerin bu bileşiklerin kullanımına kısıtlamalar veya yasaklar getirmesine neden olmuştur. 2000 yılında ABD’deki Çevre Koruma Ajansı (EPA), çok toksik OP yapılı bir bileşik olan ve bu tezin odak noktasını oluşturan klorprifosun (CPF) evlerde kullanımını tamamen yasaklamış ve sadece tarım alanında kullanımına izin vermiştir. Tüm bu kısıtlamalara rağmen; CPF yaygın olarak kullanılan pestisit özelliğini korumakta olup, gelişmekte olan birçok ülkede, halen kullanımı devam etmektedir (29). 8 2.3. Klorprifos İlk kez 1965 yılında Dow Elanco Firması tarafından sentezlenen ve ticari olarak üretilen ve geniş spektrumlu bir OP pestisit olan CPF, hamam böceği, pire, sığırlardaki kene ve hayvan barınaklarındaki zararlıları kontrol altına almak ve ayrıca tarım ve ormancılıkta çok çeşitli mahsulleri korumak amacıyla sıklıkla kullanılmaktadır. CPF’nin alternatif ürünlerden çok daha etkili ve düşük maliyete sahip olması, bu bileşiğin kullanımını yaygınlaştırmaktadır (30). 2.3.1. Klorprifosun Kimyasal Yapısı ve Fiziksel Özellikleri CPF (O,O-dietil O-3,5,6-trikloropiridin-2-il-fosforotiyoat), merkaptan benzeri güçlü bir kokuya sahip renksiz kristalize bir pestisittir (Şekil 2.1.). Şekil 2.1. Klorprifos kimyasal yapısı. Apolar yapıya sahip CPF’nin suda çözünürlüğü (2 mg/l) oldukça azdır ve organik çözücülerde dağılma katsayısı ise (logP: 4,7-5,3) yüksektir (29). Bu yüzden, hayvanlara ve mahsüllere uygulanmadan önce genellikle benzen, aseton, kloroform, etanol, metanol, ksilen, dietil eter vb. organik çözücülerde çözülmektedir (29, 31). Su içerisindeki stabilitesi sıcaklık ile değişen CPF’in sudaki hidroliz hızı, her 10 °C sıcaklık düşüşüyle 2,5-3 kat azalmaktadır. Hidroliz hızı, asidik ve nötr sularda sabit iken, alkali sularda artış göstermektedir. CPF’nin 25 °C’de ve pH 7,0 olan suda 35-78 günlük bir yarı ömrü bulunmaktadır (29). CPF, toprak altında hem aerobik hem de anaerobik koşullar altında bozunabilmektedir. CPF, önce toksik olmayan 3,5,6-trikloro-2-piridinol’e (TCP), daha sonra organoklorin bileşiklerine ve en son olarak karbondiokside indirgenmektedir (30). 9 Ayrıca kendisinden 10 kat daha toksik olan klorprifos okson’a (CPO) da okside olabilmektedir (29, 32). 2.3.2. Klorprifosa Maruziyet Genellikle CPF’nin kapalı alanlarda uygulanması ve tarım işçilerinin kullandığı bireysel koruma ekipmanlarının eksikliği ile CPF’ye akut maruziyet gerçekleşmektedir (33). Ayrıca, OP pestisit uygulanan bölgelerde yaşayan insanlar ve çocuklar da ciddi maruziyet riski taşımaktadır (21, 34). Yanlışlıkla veya isteyerek yutulması (intihar girişimi), pestisitlerin karıştırılması, yüklenmesi ve uygulanması sırasında dermal maruziyet veya kontamine yüzeylerle temas, başlıca maruziyet yollarıdır (35). Bununla birlikte, subkronik mesleki maruziyet ve genel popülasyonun CPF kalıntısı içeren diyet tüketimi, uzun süreli düşük doz CPF maruziyetine örnek olarak verilebilir (30). CPF, uygulandıktan hemen sonra oral, inhalasyon ve dermal yollar ile absorbe olmaktadır. Lipofilik özelliklerinden dolayı, alveol, plesanta ve kan beyin bariyeri dahil olmak üzere lipid çift katmanlardan hızlıca geçebilmektedir (36, 37). CPF kan dolaşımına girdikten sonra sinir sistemindeki anahtar enzimlerden biri olan AChE’yi inhibe edebilecek ve nöron hasarını indükleyebilecek düzeyde dokulara dağılmaktadır (38). İdrar ile kolayca atılan degradasyon metabolitleri, maruziyetin biyobelirteçlerini tanımlamada potansiyel yarar sağlamaktadır (35, 39). CPF, konjugasyon ve esteraz aracılı hidroliz ile hızlıca karaciğerden metabolize edilerek idrar, dışkı ve solunum yolu ile atıldığı için insanlardaki yarı ömrü dakikalar veya saatler olacak şekilde oldukça kısadır (30). 2.3.3. Klorprifos Metabolizması CPF absorbe olduktan sonra, AChE üzerinde inhibitör etkisini gösterebilmesi için, metabolik olarak fosfor atomuna çift bağlı sülfür atomunun (P=S) okside olması gerekmektedir (11, 40, 41). CPF, karaciğerde sitokrom P450 monooksigenaz sistemi ile oksidatif desülfürasyona uğrayarak, biyolojik olarak aktif formu CPO’ya dönüşmektedir (11, 29, 30) (Şekil 2.2). 10 Şekil 2.2. Klorprifosun metabolik biyoaktivasyonu. Ayrıca CPF, beyin mikrozomal sitokrom P450 ile de doğrudan CPO’ya okside olmaktadır, ancak bu dönüşüm hızı 100 kat daha azdır (42, 43). CPO, CPF’ye kıyasla, çok daha güçlü bir AChE inhibitörüdür (44). CPO, mikrozomal esterazlar (A-esteraz paroksonaz, klorprifos oksonaz) veya enzimatik olmayan hidroliz aracılığı ile özgül metabolitleri olan dietilfosfat ve TCP’ye dönüşmektedir. Alternatif olarak CPF, sitokrom P450 ile dearilasyona uğrayarak, TCP ve dietiltiyofosfat (DETP) oluşturmaktadır (45-47). Karaciğer sitokrom P450 enzimlerindeki polimorfizmler, OP toksisite duyarlılığında değişikliğe neden olmaktadır (48). CPF metabolizması, insanlarda sitokrom P450 sisteminin birkaç izoformu tarafından gerçekleşmektedir. CPO oluşumunda, CYP2B6 ve CYP3A4 izoformları; TCP oluşumunda ise CYP2C19 izoformu önemli rol oynamaktadır (49-51). Her izozimin ekspresyon düzeyi, bireyler 11 arasında farklı olduğu için OP aktivasyon-detoksifikasyon hızı ve dolaşımdaki toksik OP seviyeleri bireyler arasında değişkenlik göstermektedir. Sitokrom P450 enzimlerinin yanı sıra, CPO’nun katalitik hidrolizinde rol oynayan A-esteraz paroksonaz (PON-1) enziminin düşük seviyesi de, insanlarda ve hayvanlarda artan nörotoksik etki ile ilişkilendirilmektedir (52). 2.4. Klorprifos için Hedef Proteinler 2.4.1. Asetilkolinesteraz: Klorprifosun Birincil Hedefi CPF’nin başlıca hedefi, periferal ve merkezi sinir sisteminde başlıca nörotransmitter, asetilkolinin (ACh) hidrolizinden sorumlu olan ve serin hidrolazlar ailesinin bir üyesi olan AChE’dir (11, 53, 54). ACh’nin, postsinaptik muskarinik ve nikotinik reseptörlere bağlanması (55), beyin ve omurilikten bilginin iletilmesinde önemli rol oynamaktadır. AChE aktivitesinin inhibisyonu, nörotransmitter ACh’nin kolin ve asetata hidrolizini azaltmaktadır (56). Aşırı ACh birikimi, çeşitli klinik semptomlarla birlikte aşırı kolinerjik aktiviteye neden olmaktadır (12, 21, 57). CPF’nin, AChE’yi inhibe edebilmesi için karaciğerde oksidatif desülfürasyona uğrayarak CPO’ya dönüşmesi gerekmektedir (11, 58, 59). CPO, AChE’nin aktif bölgesine (Şekil 2.3.) bağlandığında, CPO’nun fosfat grubu ile AChE’nin aktif bölgesinde bulunan serin amino asidinin hidroksil grubu arasında bir kovalent bağ oluşmaktadır. 12 Şekil 2.3. Asetilkolinesterazın aktif bölgesindeki katalitik serinin klorprifos ile konjugasyonu. AChE’nin esteratik bölgesi ile fosfor atomu arasındaki bağ, aynı enzim bölgesinde ACh içerisindeki karbonil karbonu arasındaki bağa kıyasla çok daha kararlıdır. Karbon-enzim bağının kırılması mikrosaniyeler içerisinde gerçekleşirken, fosfor-enzim bağının kırılması, birkaç saat ile birkaç gün arasında sürebilmektedir (60, 61). Bazı durumlarda, AChE inhibisyonundan birkaç saat sonra, AChE-CPO arasındaki bağın spontan hidrolizi ile AChE yeniden aktive olmaktadır. Bu reaksiyon oldukça yavaş hızda gerçekleşmektedir (62). Oksimler olarak bilinen bazı hidroksilamin türevleri, AChE’nin anyonik bölgesine bağlanabilen ve enzimin defosforilasyonunu kolaylaştırabilen pozitif yüklü bir atom içermektedir (Şekil 2.4). Böylece enzimin spontan olarak yeniden aktivasyonu, oksim gibi nükleofilik reaktifler ile gerçekleşebilmektedir. (11, 63). Oksimler, OP zehirlenmelerinin tedavisinde kullanılmaktadır (11, 64, 65). AChE, CPO ile inhibe olduğunda, AChE-CPO kompleksinde, CPO üzerinde bulunan dietoksi (R1, R2) gruplarından biri ayrılmaktadır. Enzimatik olmayan bu reaksiyon, yaşlanma (aging) olarak adlandırılmaktadır (Şekil 2.4). Yaşlanma reaksiyonunun gerçekleşmesi ile enzim yeniden aktive olmaya direnç kazanmaktadır çünkü dealkile olan negatif yüklü fosforil grubu daha kararlıdır ve enzim tersinmez olarak inhibe edilmektedir. Bu durumda yeni AChE moleküllerinin sentezlenmesi gerekmektedir (44, 60, 66). 13 Şekil 2.4. Asetilkolinesterazın OP yapılı bileşikler tarafından inhibisyonu, yaşlanma reaksiyonu ve nükleofilik ajan aracılığıyla reaktivasyonu. Akut kolinerjik sendrom CPF’nin akut toksik etkisi, OP yapılı bileşiklerin primer farmakolojik hedefi olan AChE’nin inhibisyonu ile gösterilmektedir. AChE’nin inhibisyonu ile periferik sinirlerin sinapslarındaki aşırı ACh birikimi, merkezi ve periferik sinir sistemlerinde, kolinerjik (nikotinik ve muskarinik) reseptörlerin aşırı uyarılmasına neden olmaktadır (67). Toksik CPF’ye maruziyet ile biriken ACh, muskarinik reseptörlere bağlanmakta ve bronkokonstriksiyon, hipotansiyon, miyozis, kalp atışının düşmesi, artan terleme, aşırı tükrük salgısı gibi muskarinik etkiler gözlenmektedir (68). Akut kolinerjik sendrom, CPF maruziyetinden sonra birkaç dakika ile birkaç saat arasında çok hızlı bir şekilde ortaya çıkmaktadır. Ancak bazı durumlarda klinik bulgular bir gün sonrasında da gözlenebilmektedir (31). Bu evrede hipertansiyona, kontrolsüz kas kasılmalarına, felce neden olan nikotinik reseptörler uyarılmaktadır (68). Solunum kaslarının paralizi ile solunum yetmezliği ve kardiyak arreste bağlı olarak ölüm, çok kısa sürede gerçekleşebilmektedir (13, 57). Ayrıca CPF zehirlenmesi ile konuşma bozukluğu, baş ağrısı, uykusuzluk, spazm, konvülziyon, koma vb. merkezi sinir sistemi belirtileri de ortaya çıkabilmektedir (69, 70) . 14 Akut CPF toksisitesinin tedavisinde iki strateji izlenmektedir. Bunlardan ilki, atropin gibi kolinerjik muskarinik antagonist kullanımı ile muskarinik reseptörleri bloke etmektir. Diğer strateji ise oksim, pralidoksim gibi spesifik antidotların uygulanması ile AChE’nin yeniden aktive olmasını sağlamak ve böylece ACh birikimini önlemektir (71). Ancak yaşlanma reaksiyonu sonrasında AChE, oksimler tarafından aktive edilememektedir (31). 2.4.2. Nöropati Target Esteraz Nöropati target esteraz (NTE), endoplazmik retikulum membranına bağlı fosfatidilkolinin, gliserofosfokolin ve yağ asitlerine dönüşümünü katalizleyen bir fosfolipazdır. NTE mutasyonları (72) veya bir OP’nin NTE’ye kovalent bağlanmasının neden olduğu yapısal değişiklikler, fosfatidilkolin birikimine yol açmaktadır. Bunun sonucunda membran yapısı değişmekte, glia-akson etkileşimi ve aksonal transport bozulmakta ve son olarak hücre ölümü gerçekleşmektedir (73). Toksik metabolit krezil saligenin fosfatın (CBDP) öncüsü olan OP yapılı bileşiklerden tri-orto-krezil fosfat ile zehirlenen insanlarda, bacak ve omurilikteki uzun sinirlerin distal uçları şişmekte ve dejenere olmaktadır (74). Sinirlerde gerçekleşen hasardan kaynaklanan felç, OP kaynaklı gecikmiş polinöropati (OPIDN) olarak adlandırılmaktadır. Beyin NTE aktivitesinin yaklaşık % 70’inin geçici olarak inhibisyonu, birkaç hafta sonra klinik nöropatiye neden olmaktadır (75). Nöropatik OP bileşikleri, yaşlanma reaksiyonu sonrasında NTE üzerinde negatif yüklü eklenti ürünleri oluşturmaktadır. ABD’de yasadışı üretilen likörlere eklenen tri-orto-krezil fosfatın, ginger jake felcine neden olduğu rapor edilmiştir (76). Tri-orto-krezil fosfatın toksik bir metaboliti olan CBDP, AChE’nin etkili bir inhibitörü değildir (77). Bu nedenle, insanlarda kolinerjik kriz görülmeden önce polinöropati gelişmektedir. Sonuç olarak, nöronlarda NTE, kolinesterazlardan bağımsız olarak insanlarda OP toksisitesinin ikinci bir hedefi olarak gösterilmektedir. 2.4.3. Bütirilkolinesteraz BChE, insan plazmasında ve serumda bulunan, tetramerik yapıda bir kolinesterazdır. 340 kDa ağırlığındaki BChE tetrameri, dimerin dimeridir ve her dimer, birbirine Cys 571’den disülfit bağı ile bağlanmaktadır. Her bir alt ünite, 574 15 amino asit ve dokuz adet Asn bağlı karbonhidrat zinciri içermektedir (78). İnsan kanında BChE düzeyi, AChE’den on kat daha fazla olup (79), insan serumu yaklaşık 4-5 mg/l BChE ve 0.5 mg/l AChE içermektedir. BChE, plazmada; AChE ise kırmızı ve beyaz kan hücrelerinin membranlarına bağlı olarak bulunmaktadır. BChE, OP yapılı bileşikler ile oldukça reaktifdir ve OP pestisitlerinin çoğu, AChE’a göre BChE ile daha hızlı reaksiyon göstermektedir (56). Ayrıca kandaki BChE aktivitesinin inhibisyonu, spektrofotometrik analiz ile kolayca ölçülebilmektedir. İnsanlarda BChE aktivitesinin inhibisyonunun, hiçbir yan etkisinin olmadığı gösterilmiştir. Ancak, AChE knock out farelerde BChE aktivitesinin inhibe edilmesi, hayvanların ölümüne neden olmaktadır (80, 81). OP’ler, AChE’de olduğu gibi, BChE’nin aktif bölgesi üzerinde kovalent modifikasyona neden olmaktadır (Şekil 2.5.). BChE’deki OP eklentilerini tanımlamak için kütle spektrometri yöntemleri geliştirilmiştir (82, 83). Tüm bu özellikler OP maruziyetinin teşhisinde BChE’yi tercih edilir bir biyobelirteç yapmaktadır. Şekil 2.5. OP bileşiklerin biyoaktivasyonu ve BChE ile etkileşimi. 16 OP-BChE eklenti ürünlerinin tanımlanması Fidder ve arkadaşları, OP maruziyetini BChE üzerinden elektrosprey- iyonlaşma tandem kütle spektrometri kullanarak tanımlamışlardır (82). Böylece, Tokyo metro saldırısında OP’ye maruz kalan kişilerden alınan plazmalarda, BChE aktif bölgesinde oluşan eklenti ürünlerinin kütlesi ölçülmüş ve BChE aktif bölge peptidinin kütlesinin, OP ile modifiye edilmemiş BChE aktif bölge peptidine göre 120 atomik kütle birimi daha yüksek olduğu bulunmuştur. Bu kütle farkının sarinden kaynaklı olduğu düşünülmüştür. MS/MS fragmentasyonu ile peptit dizileri tanımlanmış ve OP ile modifiye olan amino asidin, BChE aktif merkezindeki Ser198 olduğu, gösterilmiştir. Bu çalışma sonucunda ayrıca OP maruziyetinin kütle spektrometri ile analizi için iki önemli teknik detay tanımlanmıştır. Bunlardan ilki, OP maruziyeti için BChE aktif bölgesine ait peptit dizisi belirlenirken pepsin kullanılmasının, tripsine göre avantajlı olmasıdır. Diğer teknik detay ise, çarpışmanın neden olduğu ayrıştırma sırasında, OP ile modifiye BChE aktif bölge serin üzerinde, eklenti ürünlerinin ve bir su molekülü çıkışı ile serinin dehidroalanine dönüşmesidir. BChE’nin pepsin ile parçalanması sonucunda 9 amino asitten oluşan FGES198AGAAS aktif bölge peptit dizisi elde edilirken, tripsin ile parçalanma sonucunda 29 amino asitten oluşan SVTLFGES198AGAASVSLHLLSPGSHSLFTR peptit dizisi gözlenmektedir (84). Şekil 2.6., pepsin ile parçalanan OP-modifiye insan BChE’ ye ait FGES198AGAAS peptidinin MS/MS spektrumunu göstermektedir. Şekil 2.6. OP ile modifiye insan BChE aktif bölge peptidinin MS/MS spektrumu (84). 17 OP maruziyeti olmadığında, BChE aktif bölge FGESAGAAS peptidi için kütle spektrometri ile 796.3 m/z kütlenin gözlenmesi beklenmektedir. Şekil 2.6’da ana iyon olarak 904.3 m/z kütle gözlenmektedir. 904.3 m/z ve 796.3 m/z arasındaki 108 Da’luk kütle farkı ve peptit fragmentasyonu, BChE’nin aktif bölgesindeki serinin monoetoksifosfat ile modifiye olduğunu düşündürmektedir. Serin amino asidi üzerinde oluşan monoetoksifosfat eklenti ürünü (+108 Da), kolinesterazların dietoksifosfat (+136 Da) yan grubu taşıyan OP bileşikler ile maruziyeti sonrasında gerçekleşen yaşlanma reaksiyonu sırasında bir etil yan grubunun dealkile olması (-28 Da) ile meydana gelmektedir. Şekil 2.6.’da dizilenen peptit, pepsin ile parçalanan ve aktif bölge serin amino asidi üzerinde monoetoksifosfat ile modifiye, insan AChE (Swiss protein #P22303), insan BChE (Swiss protein #P06276) ve at BChE (NCBI #gi7381418) için aynı FGESAGAAS aktif bölge peptidini vermektedir (82). Monoetoksifosfat modifikasyonu, dietoksifosfat yan grubuna sahip sinir ajanı tabun ile oluşabileceği gibi, CPF, dietil paraokson, diazokson gibi dietoksifosfat yan grubu taşıyan OP pestisitlerin yaşlanma reaksiyonu ile de oluşabilmektedir (Şekil 2.7.). Sinir ajanı tabun, yaygın olarak kullanılan dietoksifosfat pestisitlerinden ayırt edilemeyen bir eklenti ürünü oluşturmaktadır (82, 84). Şekil 2.7. Pepsin ile parçalanan OP ile modifiye BChE. 18 Kütle spektrometri ile MS/MS spektrumları elde edilirken, OP ile modifiye olan BChE aktif bölge serin amino asidinin büyük bir kısmı dehidroalanine dönüşmektedir. Şekil 2.6.’da ∆ sembolü ile işaretlenmiş tüm iyonlar, OP maruziyeti sonrası, OP eklenti ürünlerini ve bir su molekülü kaybeden aktif bölge serinin, dehidroalanine dönüşümünü ifade etmektedir (82, 84). OP ile modifiye serinin dehidroalanine dönüşmesi beta eliminasyon olarak adlandırılmaktadır (85). Şekil 2.8., insan BChE’sinde soman ile modifiye serin için beta-eliminasyon reaksiyonunu şematik olarak göstermektedir. Şekil 2.8. Soman ile modifiye serin için beta-eliminasyon reaksiyonunun şematik diyagramı. OP-serin bağının, çarpışma kaynaklı ayrışma sırasındaki kırılma kolaylığı, Şekil 2.6.’deki en yoğun iyonun 778.2 m/z olması ile gösterilmektedir. 778.2 m/z’deki peptit, dealkile ve bir su molekülünü kaybeden ana iyonu ifade etmektedir. Beta eliminasyon reaksiyonu geri dönüşümsüzdür (84). 2.4.4. Serin Hidrolazlar Doku homojenatları ve saflaştırılmış enzimlerle yapılan in vitro çalışmalar, tüm serin proteazlar ve serin esterazların OP yapılı bileşikler ile kovalent bağ oluşturduğunu ve bu durumun enzim aktivitesinin inhibisyonu ile sonuçlandığını göstermektedir. İn vitro deneylerde, hayvanlardaki ölümcül dozu aşan yüksek konsantrasyonlarda OP kullanılmaktadır. Serin hidrolazların aktif bölgesinde bulunan serin için GlySerGly konsensüs dizisi bulunmaktadır. OP ile in vitro inhibe edilen serin proteazlara örnek olarak; tripsin, kimotripsin, karboksilesteraz, trombosit aktive edici faktör asetilhidrolaz, fosfolipaz A2, doku plazminojen aktivatörü, trombin ve yağ asidi amid hidrolaz verilebilir (86). OP pestisitlerinin letal olmayan dozları ile muamele edilen canlı 19 hayvanlarda, plazma karboksilesteraz haricindeki bu enzimler inhibe edilmemektedir. Karboksilesteraz, farelerin, sıçanların, kobayların ve tavşanların, plazmasında bulunmaktadır, ancak maymunların ve insanın kanında yoktur (87). İnsanlarda OP’nin letal olmayan dozları ile inhibe edildiği bilinen serin hidrolazlar; AChE, BChE ve NTE’dir (88). 2.4.5. Düşük Doz OP Maruziyeti Hindistan’da OP pestisit, quinalphos üretiminde çalışan işçilerde (n=59), alyuvar AChE aktivitesi normal iken, yorgunluk ve halsizlik şikayetleri ile birlikte hafıza ve öğrenme yeteneklerinde anlamlı derecede bir azalma gözlenmiştir. Yaş ortalaması, 30 ± 6 olan işçiler, yeterli havalandırma sağlanamayan alanda quinalphosa 5.7 yıl boyunca maruz kalmıştır (89). Brezilya’da tütün çiftçileri (n = 37), yılın 3 ayı günde 5.4 saat klorprifos ve asefat kullanarak 18 yıl boyunca OP pestisite maruz kalmıştır. Plazma kolinesteraz aktiviteleri normal sınırlardayken, pestisit uygulaması sırasında 12 denekte ekstrapiramidal semptomlar gözlenmiştir. 13 denek için genel anksiyete bozukluğu, 8 denek için majör depresyon tanısı konulmuştur (4). Hikayelerinde akut zehirlenme bulunmayan işçilerde gözlenen semptomlar, düşük doz OP maruziyetini düşündürmüştür. Düşük dozlardaki OP toksisitesinin mekanizmasını aydınlatmak için birçok in vivo çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Çalışmadan elde edilen sonuçlar, AChE aktivitesini etkilemeyen çok düşük dozlardaki OP’lerin, adenilat siklaz sinyalizasyonunda (90) ve lipit metabolizmasında bozulmalara (91), kalsiyum/siklik adenozin monofosfat (cAMP) yanıt elementi bağlanma proteininin hiperfosforilasyonuna (92), beyindeki fibroblast büyüme faktörünün ekspresyon düzeylerinde (93) ve serotonin reseptörlerinde değişikliğe (94) ve açilpeptit hidrolazın inhibisyonuna (5) neden olduğunu göstermiştir. Bu durum, OP’lerin AChE ve BChE dışında başka hedeflerinin olduğunu ve düşük doz OP maruziyetinde, bu hedef proteinlerin kronik nörotoksisitede rol aldığını düşündürmektedir. 2.4.6. Diğer Klorprifos Hedefleri AChE’ye ek olarak OP hedeflerine ilişkin kanıtlar, Virginia Moser tarafından sağlanmıştır. Virginia Moser tarafından yapılan bir araştırma sonucunda, yüksek 20 dozlardaki OP’lerin kimliklerinden bağımsız olarak benzer kolinerjik etkiler gösterdiği daha düşük dozlardaki OP’lerin ise farklı etkilere neden olduğu rapor edilmiştir (95). Örneğin, 100 mg/kg CPF, sıçanların %100’ünde tremora neden olurken, aynı dozdaki diazinon ile tremor gözlenmemiştir (95). Bununla birlikte, davranışsal belirtilerin, belirli bir AChE inhibisyon seviyesi ile ilişkili olmadığı da gösterilmiştir. CPF’nin uygulanması sonrasında ortaya çıkan davranışsal belirtiler, beyindeki AChE aktivitesinin % 70’inin inhibe edilmesiyle gözlenirken, aynı belirtiler paraokson ile AChE aktivitesinin % 30’u inhibe edildiğinde gözlenmiştir. AChE aktivitesi normale döndükten sonra uzun dönem davranışsal belirtiler devam etmektedir (96). Ayrıca, beyinde benzer oranlarda AChE inhibisyonunu tetikleyen CPF veya paratyon dozları ile muamele edilen sıçanlarda, paratyon ile CPF maruziyetine göre daha fazla toksisite belirtileri gözlenmiştir (97). 802 hasta üzerinde yapılan bir araştırmada, yaygın kullanılan OP bileşiklerin klinik özellikleri karşılaştırılmıştır (98). WHO tarafından orta derecede tehlikeli olarak sınıflandırılan CPF, dimetoat veya fentiyon bileşiklerine maruz kalan hastalarda mortalitenin, CPF’e göre (% 8.0) dimetoat (% 23.1) ve fentiyon (% 16.2) ile zehirlenen hastalarda daha yüksek olduğu gözlenmiştir (99). Tüm bu çalışmalar, OP bileşiklerinin alternatif olarak kolinesterazlar dışındaki hedefler ile etkileşime girdiğini ve bu hedeflerin OP kimliğine bağlı olarak değiştiğini göstermektedir (95, 98). 2.4.7. Beta Glukronidaz Egasyn olarak adlandırılan ve sıçan karaciğeri mikrozomlarında bulunan karboksilesteraz, bir kompleks tarafından beta-glukuronidaza (BG) sıkıca bağlanmaktadır. Egasyn, OP’ye bağlandığında, BG kana salınmaktadır (100). Yapılan bir çalışmada, oral olarak tek seferde verilen klorprifosun (10 mg/kg) sıçan kanında BG aktivitesini 2 saat içinde 100 kat arttırdığı gözlenmiştir (100). Bu durum, BG’nin OP maruziyetinin teşhisinde bir biyobelirteç olabileceğini düşündürmüştür. Ancak plazma BG aktivitesindeki artış, diğer hayvan türlerinde ve insanlarda doğrulanamamıştır (101). 2.4.8. Açilpeptit Hidrolaz Beyin, karaciğer ve kırmızı kan hücrelerinde bulunan açilpeptit hidrolaz enzimi, küçük asetillenmiş peptitlerden N-terminal asetillenmiş amino asitlerin 21 hidrolizini katalizlemektedir (102, 103). AChE üzerinde etkin olmayan dozlardaki diklorvos, DFP ve metil klorprifos oksonun, açilpeptit hidrolaz aktivitesini inhibe ettiği gösterilmiştir. Açilpeptit hidrolazın bu OP bileşiklere duyarlılığı (IC50), AChE’ye göre 6-10 kat daha fazladır (5). Kolinerjik toksisiteye neden olmayan bir dozda, diklorvos ile muamele edilen sıçanların, beyin AChE aktivitesinin % 47’sinin ve beyin açilpeptit hidrolaz aktivitesinin % 93’ünün inhibe edildiği bulunmuştur (5). Bu durum, belirli bir OP pestisitine maruziyetin teşhisinde açilpeptit hidrolazın duyarlı bir biyobelirteç olduğunu göstermektedir. Yapılan bir çalışmada, intraperitoneal olarak verilen DFP ile kandaki açilpeptit hidrolaz aktivitesinin hemen hemen tamamı inhibe edildikten sonra farelerde toksik belirtiler gözlenmemiştir, bu da açilpeptit hidrolazın akut OP toksisitesinde bir role sahip olmadığını düşündürmektedir (103). Bununla birlikte açilpeptit hidrolaz, oksidatif hasar görmüş proteinlerin bozunmasında rol oynamaktadır. Bu nedenle enzimin kronik OP toksisitesinde rol oynayabileceği düşünülmektedir (104, 105). Ayrıca açilpeptit hidrolazın 120 günlük yaşam süresine sahip insan eritrositlerinde bulunması, OP maruziyetin belirlenmesi için bir avantaj sağlamaktadır (103, 106, 107). 2.4.9. Reseptörler CPO’nun, M2 muskarinik reseptörüne bağlanarak, hücre sinyalizasyonunu dolayısıyla nörolojik fonksiyonu etkilediği ve bunu AChE inhibisyonundan bağımsız bir nörotoksisite mekanizmasını tetikleyerek gerçekleştirdiği gösterilmiştir (108). 3H- klorprifos oksonun, sıçanlarda kalp M2 muskarinik reseptörlerine kovalent olarak bağlandığı rapor edilmiştir ancak bağlanma bölgesi tanımlanmamıştır (109). Ayrıca, kobaylar ile yapılan çalışmada, CPF, paratyon ve diazinonun AChE aktivitesini inhibe etmeden, nöronal M2 reseptör fonksiyonunu inhibe ettiği ve bronkokonstriksiyona neden olduğu gösterilmiştir (110). Kannabinoid reseptörlerin, kardiyak adrenerjik reseptörlerin, kolinerjik otoreseptörlerin ve N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörlerin OP ile in vitro etkileştiği gösterilmiştir (1). Ancak reseptör-OP etkileşimi tersine çevrilebilmektedir, bu da OP maruziyetinin ve OP eklenti ürünlerinin tanımlanmasını olanaksız kılmaktadır. 22 2.4.10. Albümin Yapılan çalışmalar sonucunda biyotin ile işaretli florofosfatın (FP) toksik olmayan dozu ile muamele edilen farelerin kanında ve kasında FP-biyotinlenmiş albümin gözlenmiştir (17). Bununla birlikte in vitro deneyler ile OP’lerin albümine Tyr411’den kovalent olarak bağlandığı gösterilmiştir (111). Soman, sarin, siklosarin ve tabun gibi OP sinir ajanları ile muamele edilen kobayların kan örneklerinin kütle spektrometre ile analizi sonucunda; albüminin sinir ajanları ile modifiye olduğu gösterilmiştir ve bu modifikasyonların da tirozin amino asidi üzerinden gerçekleştiği rapor edilmiştir. Tirozin üzerinde oluşan tabun ve soman eklentileri, maruziyetten 7 gün sonra kanda gözlenmiştir. Ayrıca bu kobaylar, AChE üzerinde oluşan OP eklenti ürünlerinin salınmasında yaygın olarak kullanılan oksim ile muamele edildiğinde; tirozin-OP eklenti ürününün yaşlanma reaksiyonuna uğramadığı ve OP eklenti ürünlerinin salınmadığı saptanmıştır. Bu gözlem, oluşan tirozin-OP eklenti ürünlerinin stabil olduğunu göstermektedir (Şekil 2.9.) (8). Bu nedenle albümin, OP maruziyetinin tanımlanmasında yararlı bir biyobelirteçdir. Şekil 2.9. CPF ve CPO’nun albümin ve BChE üzerindeki eklenti ürünleri. 23 Literatürde, OP ile modifiye albümin için 3 farklı hasta örneği vakası bulunmaktadır (6, 112, 113). Diklorvos kullanarak intihar girişiminde bulunan iki hastada, albümindeki Tyr411’den dimetoksifosfat eklenti ürününün olduğu saptanmıştır. Hastaların serum örneği pepsin ile fragmanlara ayrılmış ve OP ile modifiye peptitler, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile saflaştırılmıştır. Saflaştırılan örnekler kütle spektrometri ile analiz edildiğinde; dimetoksifosfat ile modifiye VRY411TKKVPQVSTPTL ve LVRY411TKKVPQVSTPTL albümin peptitleri tanımlanmıştır (112). İkinci vaka çalışması, CPF ve diazinon ile intihar girişiminde bulunan iki kişinin plazma analizi ile gerçekleşmiştir. HiTrap mavi afinite kolonu ile saflaştırılan plazma albümini pronaz ile parçalanmıştır. Kütle spektrometri ile yapılan analiz sonucunda, tirozin amino asidinin dietoksifosfat ve dietiltiyofosfat ile modifiye olduğu gözlenmiştir (6). Üçüncü vaka çalışmasında ise CPF ile intihar girişiminde bulunan beş hastadan alınan plazma, pronaz ile parçalandıktan sonra HPLC ile saflaştırılmıştır. MALDI-TOF ile analiz sonrasında, gözlenen 318 Da’luk kütle, dietoksifosfat (+136 Da) ile modifiye tirozin amino asidininin (182 Da) varlığını göstermiştir (113). 2.4.11. Tübülin Asetilkolinesteraz inhibisyonunun gözlenmediği düşük dozlardaki OP’ye maruziyet, bazı kişilerde kognitif bozukluklara neden olmaktadır. Epidemiyologlar, düşük dozlardaki kronik OP maruziyetini Parkinson hastalığı, nörolojik fonksiyon bozukluğu, Körfez Savaşı Hastalığı (114) ve depresyon ile ilişkilendirmektedir (3, 114-116). Bununla birlikte, AChE’yi inhibe etmeyen dozlardaki CPO’nun, embriyonik sıçan servikal gangliyon sempatik nöronlarında nörit büyümesini azalttığı gösterilmiştir (117). Albüminin OP yapılı bileşikler ile kovalent etkileşime girmesi, düşük dozlarda gözlenen OP toksisitesini açıklayamamaktadır. Bununla birlikte, OP bileşiklerin albümindeki tirozin amino asidine kovalent bağlanması, serin hidrolazlardan başka proteinlerin de düşük dozdaki OP toksisitesine neden olabileceğini düşündürmektedir. Tübülin, kronik OP toksisitesi için aday protein olarak gösterilmektedir. Tübülin mikrotübüllere polimerize olmaktadır ve mikrotübüller de, aksonal transport için önemli rol oynamaktadır (10). Sıçanlarda yapılan davranış çalışmaları, düşük doz 24 CPF’nin kronik maruziyetini aksonal transport harabiyeti ve bilişsel bozukluk ile ilişkilendirmektedir (118, 119). Saf sığır tübülini ile yapılan çalışmalar, tübülinin, CPO, soman, sarin, diklorvos ve FP-biyotin ile kolayca modifiye olduğunu ve oluşan dietoksifosfat eklenti ürünlerinin lizin ve tirozin amino asitleri üzerinden gerçekleştiğini göstermektedir (120, 121). Saf proteinler kullanılarak elde edilen sonuçların, canlı hayvanlardaki olası durum ile ilişkili olup olmadığını göstermek amacıyla fareler, kolinerjik belirtilerin gözlenmediği dozda CPF ile muamele edilmiş ve fare beyinlerinden saflaştırılan tübülin, kütle spektrometri ve atomik kuvvet mikroskobu ile analiz edilmiştir (122). Kütle spektrometri sonuçları, beta tübüline ait GSQQY281RALTVPELTQQMFDSK peptidindeki Tyr281 üzerinden dietoksifosfat eklenti ürünlerinin varlığını göstermiştir (Şekil 2.10.) (123). Şekil 2.10. OP ile modifiye beta tübülini tanımlayan MS/MS spektrumu (123). Atomik kuvvet mikroskobu ile edilen sonuçlar ise, azalan uzunluk ve genişliğe sahip mikrotübüle daha az bağlı proteinler ile karakterize, anormal bir mikrotübül yapısını göstermektedir (Şekil 2.11.) (123). 25 Şekil 2.11. Fare beyninde anormal mikrotübül yapısını gösteren atomik kuvvet mikroskobu görüntüsü. (A) Kontrol fareye ait mikrotübüllerin görüntüsü. Mikrotübüller birçok protein ile bağlantılıdır. (B) İntraperitoneal olarak CPO (3 mg/kg) ile muamele edilen fareye ait mikrotübüllerin görüntüsü. Mikrotübüller daha az protein ile ilişkilidir (123). Hücre gövdesinden aksona hücre bileşenlerinin taşınmasında, tübülin ve bununla ilişkili proteinler önemli bir role sahip olduğu için, tübülinin kronik OP toksisitesinde biyobelirteç olarak rol oynayabileceği düşünülmektedir (123). 2.5. Tirozin 1963 yılında Sanger, insan ve tavşan albümininin ArgTyrThrLys peptidindeki tirozin ile 3H-DFP’nin kovalent bir bağ oluşturduğunu göstermiştir (16). Daha sonra yapılan çalışmalarda soman, CPO, FP-biyotin, diklorvos ve DFP ile muamele edilen insan serum albüminin kütle spektrometri ile analizi sonucunda, modifiye olan LVRY411TKKVPQVSTPTL peptidi tanımlanmıştır. Tanımlanan bu peptit dizisi ile Sanger’in daha önce tanımladığı amino asit dizisi doğrulanmış ve OP ile modifikasyonunun, albümindeki Tyr411 üzerinden olduğu kanıtlanmıştır (111, 124). OP yapılı bileşikler ile kovalent etkileşime giren diğer proteinleri tanımlamak için yapılan bir araştırmada ise, canlı fare ve fare dokuları FP-biyotin ile muamele edilmiştir. Kütle spektrometri sonuçları, OP ile etkileşime giren proteinlerin çoğunlukla albümin ve tübülin gibi yüksek ve bol miktarda bulunan proteinler olduğunu göstermiştir (84). Ayrıca kütle spektrometri analizleri saf insan ve fare transferrin (125), insan kinesin (126), fare ATP sentetaz (126) ile de gerçekleştirilmiş ve OP’ler ile modifikasyonunun tirozin amino asidi üzerinden olduğu gösterilmiştir (Tablo 2.3.). 26 Son olarak, küçük sentetik peptitlerin DFP, CPO, diklorvos ve soman ile kovalent bir bağ oluşturduğu rapor edilmiştir (125). Soman ile ArgTyrGlyArgLys peptidinin etkileşimi, pinakolilfosfonat ile modifiye peptidi vermektedir ve kütle spektrum analizi, OP yapılı bileşiğin tirozine bağlandığını kesin olarak kanıtlamaktadır (127). Tablo 2.3. OP yapılı bileşikler ile muamele edilen saf proteinlerin modifiye peptit dizileri. Protein Erişima OP ile modifiye tirozin Referans İnsan Albümini gi 28592 NALLVRY411TKKVPQ (111, 128) Sığır Albümini gi 30794280 NALIVRY410TRKVPQ (129) Kobay Albümini gi 33518896 NALAVRY411TQKAPQ (130) Sığır Tübülin Α gi 73586894 EVRTGTY83RQLFHP (121) Sığır Tübülin Β gi 75773583 EATGGKY59VPRAVL (121) Sığır Tübülin Β gi 75773583 SRGSQQY281RALTVP (121) Sığır Tübülin Β gi 75773583 SKIREEY159PDRIMN (121) Fare Tübülin Β gi 21746161 LERINVY50Y51NEATGN (7) İnsan Transferrin gi 136191 RKPVDEY257KDCHLA (125) İnsan Transferrin gi 136191 RKPVEEY593ANCHLA (125) İnsan Kinesin 3C Motor Domain gi 160286524 YLVRASY157LEIYQE (126) Fare Transferrin gi 21363012 RKPVDQY257EDCY261LARIPS (125) Fare Transferrin gi 21363012 RMDYRLY333LGHNY338VTAIRN (125) Fare Transferrin gi 21363012 GIFPKGY448Y449AVAVVK (125) Fare Transferrin gi 21363012 QGCAPGY510EKNSTL (125) Fare Transferrin gi 21363012 PNNKEEY534NGY537TGAFRC (125) Fare ATP Sentaz gi 20455479 QKILQDY431KSLQDI (126) Papain gi 129614 NEGALLY256SIANQP (131) aErişim numaraları NCBI veritabanından alınmıştır. 27 Klorprifosun tirozine bağlanma motifi OP yapılı bileşikler, proteinler içerisindeki tüm tirozinlere bağlanmamaktadır. OP ile modifiye edilen peptitlerin dizileri birbirleri ile karşılaştırıldığında, serin hidrolazların aktif bölgesinde bulunan serin amino asidinde olduğu gibi, tirozin amino asidi etrafında herhangi bir konsensüs dizisi gözlenmemiştir. Ayrıca, reaktif tirozin için de bir konsensus dizi bulunmamaktadır fakat pozitif yüklü gruplar (His, Lys, Arg), genellikle reaktif tirozin etrafındaki beş amino asit birimi içerisinde bulunmaktadır. Pozitif yüklü amino asit birimlerinin, fenolik hidroksil ile etkileşime girerek pKa’yı düşürdüğü düşünülmektedir. Düşük pKa değerine sahip olan tirozinler daha etkin bir nükleofil olarak davranmakta ve OP bileşiklere daha iyi saldırmaktadır (Şekil 2.12.) (132). Şekil 2.12. Tirozinat anyonunun klorprifos okson ile reaksiyonu. Negatif yüklü tirozin, pozitif yüklşü arjinin ve lizin yan zincirleri ile etkileşime girerek stabilize edilmektedir (10). Organofosfatların tirozine bağlanma karakteristiği OP bağlanma motifinin yeni tanımlanması nedeniyle, tirozin-OP bağlanması hakkında çok az şey bilinmektedir. Somanın insan albüminindeki Tyr411’e bağlanma hız sabiti 15±3 M-1dk-1 olup, bağlanmanın oldukça yavaş olduğu gösterilmiştir (124, 133). Ancak OP yapılı bileşiklerin tirozine bağlanma hızının daha yüksek olduğu düşünülmektedir. Bu yüzden OP ile modifiye daha fazla proteinin tanımlanması gerekmektedir. İnsan albüminin Tyr411 üzerindeki OP eklentisi stabildir. Soman ile modifiye Tyr411 eklenti ürününün bozunması için yarı ömrün, pH 7.4 ve 22 °C’de 20 gün 28 olduğu gösterilmiştir (124). CPO ile modifiye Tyr411 eklenti ürünü ise daha stabildir. 22 °C’de ve pH 7.4 tampon içerisinde, 7 ay sonra bile, Tyr411’in % 80’i, CPO’dan kaynaklanan dietoksifosfat eklenti ürünü ile modifiyedir. Ancak 22°C’de ve pH 8.3 tamponu içerisinde Tyr411 üzerindeki dietoksifosfat eklenti ürünlerinin % 50’sini 3.6 ayda kaybetmektedir. −80° C’de saklanan OP-albümin modifikasyonu, pH 8.3, pH 7.4 ve pH 1.5’de stabildir (124). CPO ile tirozin modifikasyonunun tanımlanmasının avantajı, hayvanda antikor üretimine izin verecek kadar uzun süre kararlı kalabilmesidir. Diğer bir avantajı ise, OP maruziyetinin, sonraki zamanlarda da örnekler üzerinde tanımlanmasına olanak sağlamasıdır. 29 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Gereçler 3.1.1. Kimyasallar İnsan serum albümini (HSA), sığır serum albümini (BSA), ovalbümin, lizozim, kazein, aprotinin, Sigma-Aldrich’den; fare albümini, Innovative Research’den ve domuz tübülin, Cytoskeleton’dan satın alındı. Peptitler, American Peptide Co., Sigma- Aldrich ve Genscript’ten temin edildi. Klorprifos okson (%98 saf) ve diklorvos, Chem Service’den; paraokson-etil, Sigma-Aldrich’den satın alındı. Protein G agaroz, Protein Mods; HRP ile konjuge at anti-fare IgG sekonder antikoru, Cell Signaling; anti-O- fosfotirozin monoklonal antikor klonu PY20, O-fosfo-L-tirozin ve tripsin, Sigma Aldrich ve bikinkoninik asit (BCA) protein assay kit, Thermo Scientific kaynaklıydı. İnsan embriyonik böbrek hücreleri (HEK 293) American Type Culture Collection (CRL-1573)’dan satın alındı. Dietoksifosfotirozini tanıyan fare monoklonal antikor, depY bu çalışma kapsamında Syd Labs Inc tarafından üretildi. 3.1.2. Cihazlar Kütle spektral verileri, üç farklı kütle spektrometre kullanılarak elde edildi: Triple TOF 6600 (ABI Sciex, Framingham, MA), OrbiTrap Füzyon Lumos (Thermo Scientific, Rockford, IL) ve 4800 MALDI-TOF-TOF (AB Sciex). 4800 MALDI-TOF- TOF kütle spektrometresi için örnekler, MALDI plaklara (Opti-TOF 384 Well Insert, Applied Biosystems) uygulandı. Peptit-protein saflaştırma işlemlerinde, Waters HPLC (Milford, MA) sistemi, C18 Phenomenex kolonu, C18 Alltech 900 mg kartuş, SepPak C18 kartuş, Amicon Ultra-15 UFC901025 filtresi, 5K Dekstran kolonu, Microcon-YM10 santrifüj filtre (Ultracel 10 kDa), MCX kolon (OASIS MCX CC-30 mg, Waters), 0.45 mikronluk spin filtresi (Ultra serbest MC HVLP, Millipore) kullanıldı. Peptitlerin, OP bileşikler ile inkübasyonu, Roto-Torque karıştırıcı (Cole Parmer Instruments) içerisinde gerçekleştirildi. Aktivite ve absorbans ölçümleri için Gilford spektrofotometresi (MacLab recorder, ADInstruments, Inc) kullanıldı. ELISA analizleri, 96-kuyulu plaklar (Immulon) ve 96-kuyulu plak okuyucusu (BioTek) 30 kullanılarak gerçekleştirildi. Hücre lizatlarının hazırlanmasında Sonik Dismembratör Model 500 sonikatöründen (Fisher Scientific) yararlanıldı. 3.2. Yöntemler 3.2.1. Dietoksifosfotirozin İçeren Peptitlerin Hazırlanması Peptitler çok yüksek konsantrasyonda CPO veya paraokson ile yüksek pH tamponu içerisinde muamele edildiğinde; kendiliğinden tirozin üzerinde dietioksifosfat eklenti ürünleri oluşturmaktadır. Çalışmada, tirozin içeren ve 6 amino asitten uzun olmayan çeşitli peptitler seçilerek (Tablo 3.1.), dietoksifosforillenmiş- tirozin peptitler aşağıdaki yönteme göre hazırlandı: Örneğin 21 mM RSLYAS peptidi, 30 kat molar fazlası CPO (630 mM) ile 0.1 M sodyum karbonat pH 10 (5.5 ml) tamponu içerisinde, 37˚C’de 24 saat boyunca inkübe edildi. Daha sonra MALDI-TOF kütle spektrometresi ile peptidin % 60’nın tirozinden dietioksifosfat ile modifiye olduğu gösterildi. Reaksiyona girmeyen CPO fazlası, TCP ve peptitlerden kloroform ekstraksiyonu ile uzaklaştırıldı. C18 Alltech 900 mg veya SepPak C18 kartuşları kullanılarak; TCP % 0.1 TFA ile; peptitler, %3-50 asetonitril ile elüe edildi. Bir başka örnek ise, 10.5 mM YGGFL peptidi, 33 kat molar fazlası paraokson (346,5 mM) ile 1 M Tris pH 10.8 (12 ml) tamponu içerisinde 37˚C’de 3 gün boyunca inkübe edildi. Reaksiyona girmeyen paraokson fazlası, p-nitrofenol ve peptitlerden kloroform ekstraksiyonu ile uzaklaştırıldıktan sonra paraokson ve peptitler, benzer şekilde elüe edildi. 31 Tablo 3.1. Dietoksifosfotirozin içeren peptitlerin hazırlanmasında kullanılan peptitler. Peptitler OP pestisit RARYEM Klorprifos okson GGYR Klorprifos okson/Paraokson KYK Klorprifos okson RSLYAS Klorprifos okson PYYMRR Klorprifos okson PPYRM Klorprifos okson QYDVRK Klorprifos okson LYGLPR Paraokson PPYRM Klorprifos okson YGGFL Klorprifos okson/Paraokson HYRGPA Klorprifos okson EPNVSY Paraokson YPF Klorprifos okson KYA Klorprifos okson 3.2.2. Dietoksifosfotirozin Modifiye Peptitlerin Saflaştırılması Dietoksifosfotirozin-modifiye peptitler, modifiye olmayan peptitlerden HPLC ile C18 Phenomenex kolonu kullanılarak, % 0.1 trifloroasetik asit (TFA)- % 60 asetonitril (v/v) gradiyent tampon çözeltisi ile 1 saat boyunca ayrıldı. Toplanan fraksiyonlar MALDI-TOF kütle spektrometresi ile analiz edilerek, modifikasyonun tirozin amino asidi üzerinden olduğu doğrulandı. 3.2.3. Dietoksifosfotirozin Modifiye Peptitler için Amino Asit Miktar Tayini ve Spektrumlarının Analizi Dietoksifosforillenmiş tirozin içeren ve modifiye olmayan peptitlerin konsantrasyonları, Nebraska Üniversitesi Tıp Fakültesi (UNMC) Amino asit Analiz Birimi tarafından belirlendi. OP ile muamele öncesi ve sonrasında peptit çözeltileri, hidroliz edildi. Daha sonra Ninhidrin reaksiyonu ile amino asit miktarları belirlendi. Aynı peptit çözeltilerinin absorbans spektrumları, Gilford spektrofotometre ile elde edildi. 32 3.2.4. Dietoksifosfotirozin Modifiye Peptitlerin Taşıyıcı Proteinlere Konjugasyonu Hazırlanan dietoksifosfotirozin modifiye peptitler (5 mg/ml), 0.1 M 2- [N- morfolino] etansülfonik asit (MES) pH 6.2 tamponu içerisinde bulunan taşıyıcı proteinlere [sığır serum albümini (BSA), insan serum albümini (HSA), ovalbümin ve lizozim, 2.6 mg/ml)] N-hidroksisülfosüksinimid (Sülfo NHS, 2.5 mg/ml) ve 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC, 5.8 mg/ml) varlığında konjuge edildi (134). pH, 6.2’ye ayarlanarak reaksiyon karışımı, 2-3 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırıcı üzerinde inkübe edildi. Daha sonra, reaktiflerin fazlası, Dekstran desalting kolonu (MA 5kDa’dan kesen) kullanılarak uzaklaştırıldı. Modifiye peptit-protein konjugatları, monoklonal antikor üretimi ve karakterizasyonunda (Tablo 3.2.) kullanıldı. Tablo 3.2. Taşıyıcı proteinlere bağlı dietoksifosfotirozin modifiye peptitler. Taşıyıcı Protein Dietoksifosfo tirozin modifiye peptit Miktar Kullanım amacı BSA LYGLPR 2.5 mg/ml Fare immünizasyonu BSA KYA 2.5 mg/ml Fare immünizasyonu BSA PVYSR 2.5 mg/ml Fare immünizasyonu BSA HYRGPA 2.5 mg/ml Fare immünizasyonu BSA EPNVSY 2.5 mg/ml Fare immünizasyonu Ovalbümin RSLYAS 2.5 mg/ml Boosting Ovalbümin YGGFL 2.5 mg/ml Boosting Ovalbümin YPF 2.5 mg/ml Boosting HSA PPYRM 2.5 mg/ml Boosting- Kd analizi HSA QYDVRK 2.5 mg/ml Boosting Lizozim RARYEM 2.5 mg/ml Görüntüleme Lizozim GGYR 1.25 mg/ml Görüntüleme Lizozim KYK 1.25 mg/ml Görüntüleme HSA YGGFL 2.5 mg/ml ELISA-Western Blot HSA QYDVRK 2.5 mg/ml ELISA-Western Blot Lizozim PYYMRR 2.5 mg/ml ELISA-Western Blot BSA LYGLPR 2.5 mg/ml ELISA-Western Blot-Kd analizi Ovalbümin RSLYAS 2.5 mg/ml ELISA-Western Blot 33 3.2.5. MALDI-TOF Kütle Spektrometri ile Taşıyıcı Proteinlere Bağlı Dietoksifosfotirozin Modifiye Peptit Sayılarının Belirlenmesi Taşıyıcı proteinlere çapraz bağlanan dietoksifosfotirozin modifiye peptitlerin sayısı, MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak gözlenen taşıyıcı proteinlerin kütlesindeki değişim ile belirlendi (134). Örnekler (1 l), MALDI hedef plağına uygulandı ve havaya karşı kurumasına izin verildi. Daha sonra örneklerin üzeri, sinapinik asit matriksi ile kaplandı. Kütle spektrumları; pozitif iyon modunda, kütle aralığı 30.000-100.000 Da seçilerek, 4800 MALDI-TOF/TOF kütle spektrometresi ile elde edildi (kutu boyutu 20 ns, dedektör voltaj çarpanı 0.95, ve gecikmeli ekstraksiyon 1650 ns). Düşük kütle girişi etkin ve 100 Da olacak şekilde, lazer voltajı 7800 volta ayarlandıktan sonra 3000 atış toplandı. 3.2.6. Proteinlerin Klorprifos Okson ile Muamele Edilmesi ELISA ve Western blot analizlerinde kullanılmak üzere dietoksifosfotirozin modifiye proteinler hazırlandı (Tablo 3.3.). Bu amaçla, HSA, fare albümini, sığır aprotinin, sığır kazein, sığır tübülini ve domuz tübülini (0.5 mg/ml), 20 mM TrisCl pH 8.9-%0.01 sodyum azid tamponu içerisinde ve oda sıcaklığında 1.5 mM CPO ile 7 gün boyunca inkübe edildi. Bu işlemin ardından, disülfit bağları, ditiyotreitol ile indirgendikten sonra iyodoasetamid ile alkilasyon işlemi gerçekleştirildi. Tripsinizasyon işlemi öncesinde, reaksiyon karışımı, 10 mM amonyum bikarbonat pH 8.9- % 0.01 sodyum azid tamponuna karşı diyalizlendi. Ardından proteinler, tripsin (20 g/ml) ile muamele edilerek peptitlere parçalandı. Triptik peptitler, Triple TOF 6600 LC-MS/MS ile analiz edilerek, dietoksifosfotirozin modifiye amino asitler belirlendi. Veriler, Protein Pilot yazılımı kullanılarak değerlendirildi. 34 Tablo 3.3. CPO ile modifiye olan proteinler. Protein Erişim no HSA P02768 Fare albümin P07724 Sığır Aprotinin; pankreatik tripsin inhibitor P00974 Sığır Kazein izozim karışımı Alfa S1 Alfa S2 Beta Kappa P02662 P02663 P02666 P02668 Sığır tübülin Alfa-1B Beta-4B P81947 Q3MHM5 Domuz tübülin Alfa -1A Alfa -1B Beta P02550 Q2XVP4 Q767L7 3.2.7. Monoklonal Antikor Üretimi Antikorlar, Syd Labs (Natick, MA-USA) tarafından standart hibridoma füzyon teknolojisi kullanılarak üretildi. Fareler ilk aşamada BSA ile konjuge dietoksifosforile (DEP) tirozin içeren peptitler (PVYSR-DEP, LYGLPR-DEP, KYA-DEP, HYRGPA- DEP ve EPNVSY-DEP) ile immünize edildi. İkinci aşamada, güçlü bir yanıt elde etmek için fareler, ovalbümine konjuge dietoksifosforillenmiş tirozin içeren peptitler (RSLYAS-DEP, YGGFL-DEP ve YPF-DEP) ve HSA’ya konjuge dietoksifosforilenmiş tirozin içeren peptitler (PPYRM-DEP ve QYDVRK-DEP) ile muamele edildi. Daha sonra monoklonal antikor üreten hibridoma hücreleri elde edildikten sonra hibridoma hücreleri, % 10 fötal sığır serumu (FBS) içeren DMEM ortamı içerisinde büyütüldü. Hibridoma ortamları, lizozime konjuge tirozinden modifiye-peptitler (RARYEM-DEP, GGYR-DEP ve KYK-DEP) ve sonrasında CPO ile muamele edilen HSA ve fare albümini kullanılarak ELISA yöntemi ile test edildi. ELISA sonuçları, 30 hibridoma kültür ortamından, sadece 4 klonun (3B9, 4H7, 7A8, 8B2) CPO ile muamele edilen HSA ve fare albümini için anlamlı sonuçlar verdiğini gösterdi. Bu sonuçlara göre; 4 hibridoma klonu saflaştırıldı ve dietoksifosforillenmiş tirozin içeren farklı proteinler kullanılarak, ELISA ile test 35 edildi. Elde edilen ELISA sonuçlarına göre; klon 3B9 seçilerek karakterizasyon çalışmaları gerçekleştirildi. 3.2.8. Monoklonal Antikorun Saflaştırılması Protein G agaroz içeren C16/20 kolonu (10 ml, Pharmacia), öncelikle nötralizasyonu sağlamak için 1M dibazik potasyum fosfat, pH 9 tamponu ile yıkandı. Filtre edilen ve monoklonal antikoru içeren hibridoma kültür ortamı (580 ml) kolona uygulandı. Monoklonal antikor, 0.1 M sitrat, pH 2 tamponu ile kolondan elüe edildi ve 1M dibazik potasyum fosfat, pH 9 ile nötralize edildi. Toplanan her fraksiyonda protein içeriği (A280), Gilford spektrofotometresi ile belirlendi. 0.055 M sitrat ve 0.44 M potasyum fosfat pH 6.7 tamponunda bulunan monoklonal 3B9 antikoru (19 mg), Amicon Ultra-15 UFC901025 santrifüj filtresi kullanılarak fosfat ile tamponlanmış salin (PBS) içerisine alındı ve konsantre edildi. Saflaştırılmış monoklonal antikor (3B9 klonu) depY olarak adlandırıldı; dep, dietoksifosfat için kısaltmayı ve Y ise tirozini ifade etmektedir. 3.2.9. Saflaştırılmış DepY’nin İzotipinin Belirlenmesi Protein G agaroz ile saflaştırılan monoklonal antikor depY (10 µg), tripsin (20 g/ml) ile parçalandıktan sonra Triple-TOF 6600 LC-MS/MS ile analiz edildi. Protein Pilot yazılımı kullanılarak, UniProt veritabanında saf depY’nin izotipi belirledi. 3.2.10. DepY İmmobilize Sefaroz Reçinenin Hazırlanması Siyanojen bromür (CNBr) ile aktive edilmiş sefaroz (1 g), önce 0.15 M sodyum bikarbonat-0.5 M NaCl pH 8 bağlama tamponu ile yıkandı, sonrasında PBS içerisinde bulunan 4.7 mg/ml depY monoklonal antikor (1ml) ve 0.15 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8 bağlama tamponu (0.5 ml) ile gece boyunca inkübe edildi. Daha sonra Sefaroz, 0.2 M trietonalamin -% 0.025 sodyum azid pH 7.8 çözeltisi ile yıkanarak aktif olmayan bölgeler bloklandı. Bloklama sonrasında reçine sırasıyla; 0.1M Tris- 0.5 M NaCl,pH 8 tamponu, 1 M NaCl, pH 3.5 ve PBS, pH 7.4 tamponları ile yıkandı. Sefaroz reçineye bağlanan depY antikorun miktarı, çapraz bağlanma öncesi ve sonrasında kolona bağlanmayan süpernatantların A280’lerinin ölçülmesiyle hesaplandı. Sonuçlar, 0.1 ml süspansiyonun, 20 µl sefaroz reçineden oluştuğunu ve Sefaroza 30 µg depY antikorunun bağlandığını gösterdi. 36 3.2.11. ELISA 96-kuyulu plaklar, kaplama tamponu (3 g Na2CO3 - 6 g NaHCO3/1 l distile su, pH 9.6, 100 µl) içerisindeki 1 µg antijen ile gece boyunca inkübe edildi. Kuyular, % 1 (a/h) BSA içeren Tris ile tamponlanmış salin (TBS, 20 mM TrisCl, 0.15 M NaCl pH 7.4) ile oda sıcaklığında 1 saat bloklandı, % 0.05 (h/h) Tween 20 içeren TBS (TBST) ile 1 kez yıkandı. Daha sonra kuyular, % 1 BSA/TBS içerisinde 0.2 µg/ml’ye seyreltilen depY ile oda sıcaklığında 2 saat inkübe edildi, 3 kez TBST ile yıkanarak antikorun fazlası uzaklaştırıldı. Ardından kuyular, horseradish peroksidaz (HRP) ile konjuge anti-fare IgG sekonder antikor (1:4000) ile 2 saat inkübe edildi, 5 kez TBST ile yıkandı. Yıkama aşamasından sonra her kuyuya 100 µl 3,3’,5,5’- Tetrametilbenzidin (TMB) veya o-fenilendiamin (OPD) eklendi ve HRP reaksiyonu, 20 dakika sonra her kuyuya 100 µl 0.16 M sülfirik asit (100 µl) eklenerek durduruldu. TMB için 405 nm’de, OPD için 490 nm’deki absorbans değerleri, mikroplaka okuyucusu ile ölçüldü. 3.2.12. Western Blot Analizi Dietoksifosfotirozin modifiye proteinler (1 µg), Laemmli tamponu (0.125 M Tris/HCl, %20 gliserol, %4 SDS, %0.0025 bromfenol mavisi ve %10 β- merkaptoetanol pH 6.8) ile 1:1 oranında karıştırıldı ve 95 oC’de beş dakika kaynatıldı. Ardından, örnekler % 4-20 gradient jele yüklenerek sodyum dodesil sülfat poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE) işlemine tabi tutuldu (120 Volt, 1 saat). Daha sonra jeldeki proteinler, Biorad mini trans-blot elektroforetik transfer hücresi kullanılarak, 0.45 µm polivinilidenflorit (PVDF) membrana transfer edildi (350 mA, 1 saat). Transfer işleminden sonra membran, 10 dakika 3 kez TBST tamponu ile yıkandı. Membran daha sonra, bloklama tamponu ile (% 5 yağsız süt tozu içeren TBS, pH 7.6) oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildi; non-spesifik bölgeler bloklandı. Bloklama sonrasında membran, bloklama tamponu içerisindeki depY monoklonal antikor (0.14 µg/ml) ile 4oC’de gece boyunca inkübe edildi. Membrana bağlanmayan primer antikorun fazlası, membranın 3 kez 10 dk süreyle TBST tamponu ile yıkanması ile uzaklaştırıldı. Daha sonra membran, 1:10.000 oranında seyreltilmiş, bloklama tamponu içerisindeki HRP ile konjuge anti-fare IgG sekonder antikoru ile 1 saat oda sıcaklığında inkübe edildi. Bağlanmayan sekonder antikorun fazlası, membranın 3 kez 37 10 dk süreyle TBST tamponu ile yıkanması ile uzaklaştırıldı. Son aşamada membran, Pierce ECL ile 1 dakika inkübe edildikten sonra plastik bir membran koruyucu içerisinde X-Ray filmi üzerinde görüntülendi. 3.2.13. İnsan Serum Albümine Konjuge Dietoksifosfolizinin Hazırlanması ve DepY Monoklonal Antikor ile ELISA 25 mM amonyum bikarbonat, pH 8 tamponunda bulunan 2 mM L-lizin, 20 mM CPO ile 9 gün boyunca 37˚C’de inkübe edildi. MALDI-TOF kütle spektrometri sonuçları, L-lizin amino asidinin (147 Da) %50’sinin dietoksifosfat eklentisi (+136 Da) ile kütlesi 283 Da olan dietoksifosfolizin oluşturduğunu gösterdi. CPO’nun fazlası ve reaksiyona girmeyen lizin, C18 kartuşundan geçirilerek uzaklaştırıldı. 0.1 M MES pH 6.2 tamponu içerisindeki HSA (2.4 mg/ml) ve hazırlanan dietoksifosfolizin peptidi (0.56 mg/ml), 2.5 mg/ml sülfo N-hidroksisüksinimid (NHS) ve 5.8 mg/ml 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karboimid (EDC) varlığında konjuge edildi. pH 6.2’ye ayarlanarak reaksiyon karışımı (0.8 ml), 3 saat boyunca karıştırıcı üzerinde oda sıcaklığında inkübe edildi. Reaktiflerin fazlası, taşıyıcı proteinine konjuge dietoksifosfolizinden, Dekstran desalting kolonu kullanılarak uzaklaştırıldı. MALDI-TOF kütle spektrometri analizleri, her HSA molekülüne 14 adet dietoksifosfolizin peptidinin bağlandığını gösterdi (Bkz 3.2.5.). 96-kuyulu plaklar, HSA ile konjuge dietoksifosfolizin (1 µg/kuyu) ile kaplandı. Pozitif kontrol olarak, CPO ile modifiye domuz tübülin ve negatif kontrol olarak, CPO ile muamele edilmemiş HSA kullanıldı. Daha sonra depY monoklonal antikorun (2 µg/ml), dietoksifosfolizini bağlaması ELISA ile test edildi (Bkz. 3.2.11.). 3.2.14. Klorprifos Okson, Diklorvos ve Krezil Saligenin Fosfat ile Modifiye İnsan BChE’nin Hazırlanması ve DepY Monoklonal Antikor ile ELISA ELISA kaplama tamponu ile seyreltilen saf insan BChE örneği (5 U/ml), aktivitesinin %99’u inhibe olacak şekilde, farklı OP bileşikler (CPO, diklorvos ve CBDP) ile muamele edildi. BChE aktivitesi, spektrofotometrik olarak 25˚C’de Ellman yöntemine göre tayin edildi (135). Aktivite ölçümleri, 1 mM bütiriltiyokolin ve renklendirme reaktifi olarak 0.5 mM 5,5’-ditiyobis-(2-nitrobenzoik asit) içeren 0.1 M potasyum fosfat tamponu, pH 7.0 içerisinde yapıldı. Bütiriltiyokolinin hidrolizi, 412 38 nm’deki absorbans artışı üzerinden izlendi. BChE aktivitesi, absorbans-zaman eğrisinin ilk 60 saniyelik zaman içerisindeki lineer kısım kullanılarak hesaplandı. Bir ünite enzim, bir dakikada hidroliz edilen 1 µmol bütiriltiyokolin olarak tanımlandı. Daha sonra inhibe edilen BChE örnekleri bir dakika boyunca su banyosunda kaynatıldı. 96-kuyulu plaklar, CPO ile modifiye BChE, diklorvos ile modifiye BChE ve CBDP ile modifiye BChE (1 µg/kuyu) örnekleri ile kaplandı. DepY monoklonal antikorun (2 µg/ml), örnekleri bağlaması ELISA ile test edildi (Bkz. 3.2.11). 3.2.15. Diklorvos ile Modifiye Peptitlerin Hazırlanması ve DepY Monoklonal Antikor ile İmmuno MALDI Diklorvos, CPO’nun aksine proteinlerin tirozin amino asidi üzerinde dimetoksifosfat eklenti ürünü oluşturmaktadır ve bu ürün yaşlanma reaksiyonu sonrasında monometoksifosfat eklenti ürününe dönüşmektedir. CPF ve CPO ile muamele sonrasında, tirozin üzerindeki dietoksifosfat eklenti ürünlerini tanıyan depY monoklonal antikorun, tirozindeki dimetoksifosfat ve monometoksifosfat eklenti ürünlerini tanıyıp tanımadığını test etmek için diklorvos ile modifiye peptit hazırlandı. 1 M Tris, pH 10 tamponu içerisinde bulunan 2.7 mM GGYR peptidi, 81 mM diklorvos ile 37˚C’de 12 gün boyunca inkübe edildi. Diklorvos ile modifiye peptit, daha sonra C18 Phenomenex kolonu kullanılarak HPLC ile kısmen saflaştırıldı. Her aşamada toplanan fraksiyonların, MALDI-TOF kütle spektrometresi ile analiz edilmesi sonucunda; dimetoksifosfat ve yaşlanma ürünü olan monometoksifosfat eklenti ürünlerinin, tirozin amino asidi üzerinde olduğu doğrulandı. Daha sonra Sefaroz reçineye kenetli depY antikorunun bu eklenti ürünlerini bağlayıp bağlamadığı aşağıdaki yöntem kullanılarak test edildi: DepY antikoru içeren sefaroz reçine (20 µl), diklorvos ile modifiye GGYR peptit ve CPO ile modifiye YGGFL peptitlerini içeren karışım (0.01 ml) ile oda sıcaklığında 2 saat inkübe edildi. DepY antikoru içermeyen sefaroz reçine ise, peptitlerin reçineye nonspesifik olarak bağlanıp bağlanmadığını test etmek için negatif kontrol olarak kullanıldı ve aynı peptitleri içeren karışım (0.01 ml) ile 2 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonrasında reçineler, PBS ile 2 kez yıkandı, sonrasında reçineden %50 asetonitril-%1 trifloroasetik asit (TFA) çözeltisi geçirilerek bağlı peptitler elüe 39 edildi. Daha sonra örnekler, MALDI hedef plağına uygulandı ve örneklerin üzeri α- siyano-4-hidroksisinnamik asit matriksi (α-CHCA) ile kaplanarak MALDI-TOF kütle spektrometri yöntemi ile analiz edildi. Pozitif yüklü iyonlar için monoizotopik kütleler, 560.2 Da (dimetoksifosfotirozin eklenti ürüne sahip GGYR), 546.2 Da (monometoksifosfotirozin eklenti ürüne sahip GGYR) ve 692.2 Da (dietoksifosfotirozin eklenti ürününe sahip YGGFL) olacak şekilde analiz gerçekleştirildi. 3.2.16. IC50 Değerinin Yarışmalı ELISA ile Belirlenmesi CPO ile tirozin amino asidi üzerinden modifiye edilen domuz tübülinin, monoklonal antikor depY’e olan afinitesi, yarışmalı ELISA ile belirlendi. 96-kuyulu plağın her bir kuyusu 1 µg CPO ile modifiye edilmiş HSA-QYDVRK-DEP ile kaplandı. DepY (0.1 µg/ml), farklı konsantrasyonlardaki CPO ile modifiye edilen domuz tübülini (10-17-10-7 M) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edildikten sonra kuyulara eklendi ve monoklonal antikorun, plaklardaki antijeni bağlama afinitesi, HRP-konjuge sekonder antikor kullanılarak sinyal yoğunluğu ile değerlendirildi. 3.2.17. Kd Değerinin Bio-Layer İnterferometri ile Belirlenmesi Analizler, Dr. Udaya Yerramalla tarafından, bio-layer interferometri yöntemi kullanılarak OctetRED96 cihazında gerçekleştirildi: 20 µg depY monoklonal antikor, anti-fare IgG Fc ile kaplanmış olan bir biyosensöre bağlandı ve örneklerin (domuz tübülini-DEP, kontrol domuz tübülini, kazein-DEP, kontrol kazein, ovalbümin-YPF-DEP, ovalbümin-YPF, BSA-LYGLPR- DEP ve BSA-LYGLPR) depY antikoruna bağlanma afinitesi test edildi. Örnekler, PBS, % 0.01 BSA, % 0.002 Tween-20 içerisinde hazırlandı ve 100, 50, 25, 12.5 ve 6.25 nm örnek konsantrasyonları kullanılarak, birleşme ve ayrılma hız sabitleri, ölçüldü. Ayrılma hızını ölçmek için problar, tampon içerisine daldırıldı. Biosensör yüzeyi, her bağlanma deneyinden sonra 10 mM glisin, pH 1.75 ile rejenere edildi. Veriler, ForteBio Veri Analiz Yazılımı, sürüm 8.0 kullanılarak analiz edildi. 40 3.2.18. Kd Değerinin Biacore Analizi ile Belirlenmesi Peptit örneklerinin (YPF-DEP, kontrol YPF; GGYP-DEP, kontrol GGYP; LYGLPR-DEP, kontrol LYGLPR; PPYRM-DEP ve kontrol PPYRM) depY antikoruna bağlanma afinitesi, Dr. Udaya Yerramalla tarafından 25 °C’de Biacore T- 200 cihazı kullanılarak gerçekleştirildi: DepY antikoru, çapraz bağlanma ajanları EDC/NHS varlığında bir CM5 çip üzerine immobilize edildi. Daha sonra 1 M etanolamin ile bloklama yapıldıktan sonra, 10 mM HEPES tamponu pH 7.4, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, % 0.05 polioksietilensorbitan içerisinde bulunan dietoksifosfotirozin modifiye peptitler, 30 µL/dk akış hızı ile sisteme enjekte edildi. Dietoksifosforillenmiş tirozin içeren peptitlerin konsantrasyonları, 0-1000 nM idi. Her deneyden sonra çip, 10 mM glisin, pH 1.75 ile rejenere edildi. Bağlanma denge sabiti Kd’yi hesaplamak için BIAevaluation T-200 yazılımı, sürüm 2.0 kullanıldı. Herbir reaksiyon döngüsünde elde edilen yüzey plazmon rezonans sinyali, sensör gram olarak kaydedildi. Analizlerin doğruluğunu belirlemek için gerçek sensör gram ve BIAnalysis yazılımından üretilen sensör gram arasında ki kare analizi yapıldı. 3.2.19. DepY Monoklonal Antikor ile Tanımlanabilen En Düşük Antijen Miktarının Western Blot Analizi ile Belirlenmesi DepY antikoru ile tanımlanabilen en düşük antijen miktarını değerlendirmek için Western Blot yöntemi kullanıldı. HSA-YGGFL-DEP örnekleri (5-100 µg) jele uygulanarak SDS jel elektroforezine tabi tutuldu. Daha sonra jeldeki örnekler, PVDF membrana transfer edildi. PVDF membran, depY monoklonal antikor (0.14 µg/ml) ile 4oC’de gece boyunca inkübe edildi ve sonrasında HRP konjuge sekonder antikor ile muamele edilerek edilerek görüntülendi (Bkz. 3.2.12.). 3.2.20. İnsan Serum Albümine Konjuge O-fosfo-L-tirozinin Hazırlanması ve PY20 Monoklonal Antikor ile Western Blot Analizi Ticari anti O-fosfo-L-tirozin, PY20 monoklonal antikorun, dietoksifosforile- tirozin modifiye proteinleri tanıyıp tanımadığını test etmek için, 0.1 M MES, 0.9 M NaCl, % 0.02 azid, pH 4.7 tamponu içerisinde bulunan O-fosfo-L-tirozin (4 mg/ml), 41 HSA’ya (10 mg/mL, 0.2 ml), EDC (10 mg/ml, 50 µl) varlığında konjuge edildi. Reaksiyon karışımı (0.8 ml) karıştırıcı üzerinde 2 saat inkübe edildi. Daha sonra, reaktiflerin fazlası, Dekstran desalting kolonu (MA 5kDa’dan kesen) kullanılarak uzaklaştırıldı. MALDI-TOF kütle spektrometri analizi ile her albümin molekülüne 4 adet fosfo-tirozin (243 Da) bağlandığı gözlendi. O-fosfo-L-tirozin ile konjuge HSA, pozitif kontrol olarak; lizozim-PYMRR-DEP, HSA-YGGFL-DEP, HSA-QYDVRK-DEP, BSA-LYGLPR-DEP, domuz tübülin-DEP, HSA ve domuz tübülini negatif kontrol olarak kullanıldı. Proteinler (1µg), SDS jel elektroforezi sonrasında, PVDF membrana transfer edildi. PVDF membran 0.5 µg/ml anti O-fosfo-L-tirozin monoklonal antikor PY20 ve sonrasında HRP-konjuge sekonder antikor ile inkübe edilerek görüntülendi (Bkz. 3.2.12.). 3.2.21. Hücre Lizatlarının Hazırlanması ve Klorprifos Okson ile Muamele edilmesi İnsan embriyonik böbrek hücreleri (HEK 293), 75 cm2’lik flakonlar içerisinde % 10 FBS içeren Dulbecco’s Modified Eagle ortamında (DMEM), 37°C ve %5 CO2 varlığında %80-90 yaygınlık gösterene kadar çoğaltıldı. Daha sonra hücreler, PBS ile yıkandı ve 3 adet 75 cm2’lik flakonlardan elde edilen hücre pelletleri, 2.1 ml RIPA tamponu (25 mM TrisCl pH 7.6, 150 mM sodyum klorür, % 1 sodyum deoksikolat, % 0.1 sodyum dodesilsülfat) içerisinde süspande edildi, 4°C’de Sonik Dismembrator Model 500 ile 10 sn sonike edildi ve sonikasyonun ardından karışım, 10 sn buz üzerinde inkübe edildi. Bu işlem üç kez tekrarlandı. Daha sonra karışım, 14.000xg’de 20 dakika santrifüjlenerek çözünür fraksiyonlar elde edildi. Hücre lizatlarının protein konsantrasyonları, BCA protein assay kiti kullanılarak belirlendi (136). Daha sonra hücre lizatları (4.9 mg/ml protein), herbiri 0.4 ml olacak şekilde, 5 porsiyona bölündü: İlk porsiyon, CPO ile muamele edilmeyen kontrol grubu için ayrıldı ve kontrol grubu için hücre lizatına 1.4 µl etanol eklendi. Diğer dört porsiyon ise, son konsantrasyonları 10, 100, 250 veya 1000 µM olacak şekilde stok CPO çözeltileri ile oda sıcaklığında 24 saat inkübe edildi. Stok CPO çözeltileri (3-300 mM) taze olarak etanol içerisinde hazırlandı. Kontrol grubu ve farklı konsantrasyonlarda CPO ile muamele edilmiş hücre lizatlarının bir kısmı ELISA ve 42 kapiller elektroforez-Western Blot analizleri için kullanıldı. Ayrıca kalan herbir CPO ile muamele edilmiş hücre lizatları, tripsinize edilerek kütle spektrometre analizleri için iki porsiyona daha ayrıldı. İlk porsiyondaki triptik peptitler, LC-MS/MS için depY antikoru ile immünopürifiye edilirken, diğer porsiyondaki triptik peptitler, immünopürifikasyon yapılmadan doğrudan LC-MS/MS analizi için kullanıldı. Şekil 3.1., CPO ile muamele edilmiş HEK 293 hücre lizatının (4.9 mg/ml) LC-MS/MS, ELISA ve kapiller elektroforez-Western Blot analizleri için kullanım şeklini göstermektedir. Şekil 3.1. CPO ile muamele edilmiş hücre lizatları ile çalışma planı. 4.9 mg/ml protein konsantrasyonuna sahip hücre lizatı, CPO ile muamele edildi. CPO ile muamele edilen hücre lizatının bir kısmı, tripsinize edildi. Triptik peptitler, doğrudan ve depY monoklonal antikor immobilize sefaroz reçine ile immunopürifiye edildikten sonra LC-MS/MS ile analiz edildi. Ayrıca CPO ile muamele edilmiş ve kontrol hücre lizatları, depY monoklonal antikor kullanılarak ELISA ve kapiller elektroforez- Western Blot yöntemleri ile analiz edildi (137). 43 3.2.22. Hücre Lizatlarının ELISA ile Analizi 96-kuyulu plaklar, kaplama tamponu içerisinde, kontrol ve CPO ile muamele edilmiş hücre lizatları (1 µg hücre lizatı/kuyu) ile kaplandı. DepY antikorun (0.2 µg/ml), örnekleri bağlaması ELISA ile test edildi (Bkz. 3.2.11). 3.2.23. Hücre Lizatlarının Kapiller Elektroforez- Western Blot ile Analizi HEK 293 hücre lizatları için kapiller elektroforez-Western blot analizi, Ray Biotech Inc (Norcross, GA, ABD) tarafından, WES kapiller elektroforez cihazı (ProteinSimple, San Jose, CA, ABD) kullanılarak aşağıdaki yönteme göre gerçekleştirildi: Kontrol ve 10-1000 µM CPO ile muamele edilmiş HEK 293 hücre lizatları (4.9 mg/ml protein) 0.2 mg/ml’ye seyreltildikten sonra kapiller elektroforez cihazına (40 nl) enjekte edildi. Elektroforezden sonra, proteinler, foto-aktivasyon ile kapiller duvara immobilize edildi. Daha sonra matriks kaldırıldı ve depY monoklonal antikor (0.02 mg/ml) kapillerden geçirildi. DepY antikoruna bağlanan proteinler, HRP ile konjuge anti-fare IgG sekonder antikor kullanılarak kemilüminesan substrat ile belirlendi. 3.2.24.Kütle Spektrometri Analizleri için Hücre Lizat Örneklerinin Hazırlanması Kütle spektrometri için örnekler, Wisniewski ve ark. tarafından önerilen yönteme göre hazırlandı (138): Kontrol ve CPO ile muamele edilmiş hücre lizat örneklerindeki (380 µg protein) disülfid bağları, 0.1 M TrisCl pH 8.5 tamponu-8 M üre içindeki 10 mM ditiyotreitolün (DTT) eklenmesiyle indirgendi. Örnekler vortekslenerek 3 dakika kaynar su banyosunda ısıtıldı. Daha sonra her bir örnek, 0.1 M TrisCl pH 8.5 içerisindeki 8 M üre ile karıştırılıp, Microcon-YM10 santrifüj filtre içerisine yerleştirildi ve örneğin tamamı filtreden geçene kadar 14.000xg’de 10 dk santrifüj edildi. DTT fazlasını uzaklaştırmak için filtre, 8 M üre ile yıkandı ve 14.000xg’de 15 dakika santrifüj edildi. Bu işlem, iki kez tekrarlandı. Daha sonra sülfidril gruplarını karbamidometile dönüştürmek için filtre üzerindeki proteine, 0.1 M TrisCl pH 8.5-8 M üre, içerisinde hazırlanan 55 mM iyodoasetamid ilave edildi, 1 dakika 44 vortekslendikten sonra 20 dakika karanlıkta inkübe edildi. İyodoasetamidin fazlası 14.000xg’de 10 dakika santrifüjleme ve sonrasında filtre ünitesini, 8 M üre ile iki kez yıkama ile uzaklaştırıldı. Daha sonra herbir filtre ünitesinin içeriği 50 mM amonyum bikarbonat, pH 8 tamponu ile dengelendi, 14.000xg’de 10 dakika santrifüjlendi. Bu işlem iki kez tekrarlandıktan sonra her bir filtrenin içeriği 100 µL 50 mM amonyum bikarbonat pH 8 tamponunun içerisinde süspande edildi ve 0.4 mg/mL tripsin (10 µl; tripsin: protein ~ 1: 100 µg /µg) ile karıştırıldı Tripsinizasyon, filtre üzerinde, nemlendirilmiş bir haznede 37°C’de gece boyunca (16-18 saat) gerçekleştirildi. Filtre üniteleri, 14.000xg’de 10 dakika santrifüj edilerek triptik peptitler yeni bir tüp içerisinde toplandı, 0.5 M sodyum klorür (100 µl) ile yıkandı, tekrar 14.000xg’de 10 dakika santrifüj edilerek aynı tüp içerisinde peptitler toplandı. Daha sonra peptitler SpeedVac vakum santrifüjü kullanılarak kurutuldu ve % 0.4 formik asit pH 3 içerisinde yeniden süspande edildi. Asitleştirilen peptitler, 1:1 oranındaki metanol: su çözeltisi ile önceden dengelenmiş olan MCX kolonu kullanılarak tuzdan arındırıldı. Kolonlar, % 5 metanol, % 0.1 formik asit ile, ardından % 100 metanol ile yıkandı. Peptitler, MCX kolonundan elüsyon tamponu (1:19 oranında % 28 amonyum hidroksit : % 100 metanol, 1 ml) ile elüe edildi. Triptik peptitleri içeren 1 ml’lik elüatlar 2 ayrı tüpe eşit olarak bölünüp kurutuldu. Bir tüpün içeriği (hiçbir kayıp olmadığı varsayıldığında; yaklaşık 10 µg/µl protein içermektedir), 20 µl % 0.1 formik asit içerisinde çözüldü ve Triple-TOF 6600 LC-MS/MS ile analiz edildi. Diğer tüpün içeriği, Sefaroza bağlı depY antikoru kullanılarak dietoksifosfotirozin peptitleri açısından zenginleştirildi: Dietoksifosfotirozin işaretli hücre lizatlarından elde edilen triptik peptitler, PBS (200 µl) ile süspande edildikten sonra, PBS içerisinde 40 µl depY antikoru içeren sefaroz reçine ile 2 saat inkübe edildi. Daha sonra reçine, 0.45 mikronluk bir spin filtresi içerisine yerleştirildi ve 3 kez PBS ve ardından distile su ile 3 kez daha yıkandı. DepY-Sefaroz reçineye bağlı peptitler, % 50 asetonitril-% 1 trifloroasetik asit ile elüe edildi, SpeedVac içerisinde kurutuldu ve Triple-TOF 6600 LC-MS/MS analizi için % 0.1 formik asit (20 µl) içerisinde yeniden süspande edildi (immunosaflaştırılan örnekler, <10 µg/µl protein). 45 3.2.25.Triple-TOF 6600 Sıvı Kromatografi Tandem Kütle Spektrometri Peptit örnekleri (≤ 50 µg/5 µl), ultra-yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (UHPLC) sistemine bağlı Triple-TOF 6600 kütle spektrometresine yüklendi. Bu sistemde, ayrı bir Ultra 1D Plus ultra-yüksek basınçlı kromatografi sistemi (Eksigent, Dublin, CA), cHiPLC Nanoflex mikroçip kolon sistemi (Eksigent, Dublin, CA) vasıtasıyla Triple-TOF’a bağlanmaktadır. Nanoflex sistemi, değiştirilebilir mikro akışkan trap kolonu ve değiştirilebilir ayırma kolonu kullanmaktadır. Her ikisi de ChromXP C18 (3 µm, 120 Å partiküller; Trap: 200 µm x 0.5 mm; Ayırım: 75 µm x 15 cm) ile paketlenmektedir. Kromatografi solventleri olarak su/asetonitril/formik asit (A: % 100/0/0.1, B:% 0/100/ 0.1) kullanıldı. Yakalama (trapping) ve tuzdan arındırma işlemi, 2 μl/ dk akış hızı ile 15 dakikada % 100 mobil faz A uygulanarak gerçekleştirildi. 0.3 μl/ dk akış hızı ile kolona % 5 solvent A- % 95 solvent B’den başlayarak, % 70 solvent A ve % 30 solvent B olacak şekilde 60 dakika lineer gradiyentin uygulanması ile peptitler elüe edildi. Elüat, 300 nl/dk akış hızı ile Nanospray III kaynağı ve a Pico Tip emitter içeren Triple-TOF 6600 kütle spektrometresi içerisine elektrospreylendi. Kütle spektrumları, pozitif iyon reflektör modunda, 200-2000 m/z’lik bir kütle aralığında, 250 ms’lik birikim süresi, 10 V çarpışma enerjisi, 60 V azaltma potansiyeli, 2700 V iyon püskürtme potansiyeli, ve 150 °C’lik ara yüzey ısıtıcı sıcaklığı kullanılarak elde edildi. 2x10-5 Torr basınçta kollezyon gazı olarak azot kullanılarak çarpışma-indüklü ayrışma ile peptitler fragmanlarına ayrıldı. Fragmentasyon spektrumları pozitif modda, 50– 2000 Da’lık bir kütle aralığında, 25 ms’lik bir birikim süresi, yazılım tarafından belirlenen ±15V bir çarpışma enerjisi kullanılarak toplandı. Fragmanlar ayrılacak peptitler, 1-4 yüklenme durumu ve minimum 100 cps’lik sinyal algoritması kullanılarak seçildi. Herbir aşamada 50 kadar fragmantasyon spektrumu toplandı. Triple TOF verileri, Protein Pilot yazılımı 4.0.8085 (AB Sciex, Framingham, MA) içindeki Paragon algoritması 5.524 kullanılarak değerlendirildi. Veritabanı arama parametreleri (Örnek tipi: tanımlama, Sistein alkilasyon:İyodoasetamid, Parçalanma:Tripsin, Cihaz:Triple TOF 6600, Özel faktörler: Organofosforilasyon, Tür: Homo sapiens, Kimlik odak: Biyolojik modifikasyonlar, Veritabanı: uniprot_sprotJAN2015.fasta, Arama: kapsamlı ve FDR analizi: aktif) seçildi. 46 Paragon algoritmasının özel faktörler bölümüne organofosforilasyon adlı yeni bir bölüm eklendi. Bu bölüm, tirozin