T.C. 

HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ 

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

MİTOKONDRİYAL SİTOPATİ ÖNTANILI 

HASTALARDA  

MT-TL1 GEN MUTASYONLARININ İNCELENMESİ 

 

 

 

 

Bengisu Kevser BULDUK 

 

 

 

 

Tıbbi Biyoloji Programı 

YÜKSEK LİSANS TEZİ 

 

 

 

 

 

ANKARA 

2018



 
 



 
 

T.C.  

HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ 

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ 

 

 

 

 

 

 

MİTOKONDRİYAL SİTOPATİ ÖNTANILI HASTALARDA  

MT-TL1 GEN MUTASYONLARININ İNCELENMESİ 

 

 

Bengisu Kevser BULDUK 

 

 

Tıbbi Biyoloji Programı 

YÜKSEK LİSANS TEZİ 

 

 

TEZ DANIŞMANI 

Prof.Dr. Y. Çetin KOCAEFE 

 

 

ANKARA 

2018



iii 
 

ONAY SAYFASI  

 

 



iv 
 

YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI 

  

Enstitü tarafından onaylanan lisansüstü tezimin/raporumun tamamını veya 

herhangi bir kısmını, basılı (kağıt) ve elektronik formatta arşivleme ve aşağıda verilen 

koşullarla kullanıma açma iznini Hacettepe Üniversitesine verdiğimi bildiririm. Bu 

izinle Üniversiteye verilen kullanım hakları dışındaki tüm fikri mülkiyet haklarım 

bende kalacak, tezimin tamamının ya da bir bölümünün gelecekteki çalışmalarda 

(makale, kitap, lisans ve patent vb.) kullanım hakları bana ait olacaktır. 

Tezin kendi orijinal çalışmam olduğunu, başkalarının haklarını ihlal 

etmediğimi ve tezimin tek yetkili sahibi olduğumu beyan ve taahhüt ederim. Tezimde 

yer alan telif hakkı bulunan ve sahiplerinden yazılı izin alınarak kullanılması zorunlu 

metinlerin yazılı izin alınarak kullandığımı ve istenildiğinde suretlerini  

Üniversiteye teslim etmeyi taahhüt ederim. 

  

o  Tezimin/Raporumun tamamı dünya çapında erişime açılabilir ve bir 

kısmı veya tamamının fotokopisi alınabilir. (Bu seçenekle teziniz arama 

motorlarında indekslenebilecek, daha sonra tezinizin erişim statüsünün 

değiştirilmesini talep etseniz ve kütüphane bu talebinizi yerine getirse bile, teziniz 

arama motorlarının önbelleklerinde kalmaya devam edebilecektir) 

 Tezimin/Raporumun 21.06.2020 tarihine kadar erişime açılmasını ve 

fotokopi alınmasını (İç kapak, Özet, İçindekiler ve Kaynakça hariç) istemiyorum. 

(Bu sürenin sonunda uzatma için başvuruda bulunmadığım takdirde, 

tezimin/raporumun tamamı her yerden erişime açılabilir, kaynak gösterilmek şartıyla 

bir kısmı veya tamamının fotokopisi alınabilir) 

o Tezimin/Raporumun ……… tarihine kadar erişime açılmasını 

istemiyorum ancak kaynak gösterilmek şartıyla bir kısmı veya tamamının 

fotokopisinin alınmasını onaylıyorum. 

o   Serbest Seçenek/Yazarın Seçimi 

 

 

                                                                                                21 /06/2018 

Bengisu Kevser BULDUK 



v 
 

ETİK BEYAN 

 

Bu çalışmadaki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, 

görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak 

sunduğumu, kullandığım verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı, yararlandığım 

kaynaklara bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu, tezimin kaynak 

gösterilen durumlar dışında özgün olduğunu, Prof. Dr. Y. Çetin KOCAEFE 

danışmanlığında tarafımdan üretildiğini ve Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri 

Enstitüsü Tez Yazım Yönergesine göre yazıldığını beyan ederim. 

 

 
Bengisu Kevser BULDUK 

 

 

  



vi 
 

TEŞEKKÜR 

 

Yüksek lisans eğitimim süresince ve tez çalışmalarım boyunca engin 

bilgileriyle bana yol gösteren danışman hocam Prof. Dr. Y. Çetin Kocaefe başta olmak 

üzere, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı’nda görev yapan ve eğitimime katkıda bulunan 

tüm hocalarıma, 

Tezimde kullandığım hasta materyallerinin eldesinde yardımlarını 

esirgemeyen Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Moleküler Genetik Tanı Laboratuvarı 

çalışanlarına, 

Tez çalışmalarım boyunca laboratuvar tecrübelerini benimle paylaşan, huzurlu 

ve güven dolu bir çalışma ortamı yaratan değerli çalışma arkadaşlarıma, 

Yüksek lisans eğitimim süresince maddi ve manevi destekleriyle her zaman 

yanımda olan sevgili aileme, 

Teşekkürlerimi sunarım. 

 

  



vii 
 

ÖZET 

Bulduk, B.K., Mitokondriyal Sitopati Öntanılı Hastalarda MT-TL1 Gen 

Mutasyonlarının İncelenmesi, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü 

Tıbbi Biyoloji Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2018. Mitokondriyal DNA’nın tRNA 

ve rRNA genlerini içeren kısımlarında görülen nokta mutasyonları, mitokondriyal 

protein sentezi mekanizmasını olumsuz etkileyerek oksidatif fosforilasyon işlev 

bozukluklarına neden olur. Klinikte “Mitokondriyal Sitopatiler” olarak tanımlanan bu 

klinik tablonun önemli bir kısmını, mitokondriyal tRNALeu (UUR) (MT-TL1) geninde 

meydana gelen nokta mutasyonları oluşturmaktadır. MT-TL1 geninde görülen 

m.3243A>G mutasyonu MELAS hastalarının %80’ninde tanımlanmıştır. Ancak, aynı 

gende tanımlanmış olan m.3256C>T, m.3260 A>G, m.3271 T>C, m. 3291T>C ve 

m.3303 C>T nokta mutasyonları da mitokondriyal sitopatilerle ilişkilendirilmiştir. Bu 

tez çalışması kapsamında, MT-TL1 geninde belirlenmiş 6 nokta mutasyonunu 

taranmasına yönelik yenilikçi bir ARMS-PZT yaklaşımı standardize edilmiştir. 

“Yüksek çözünürlüklü erime eğrisi” (HRM) teknolojisinin kullanımı ile bu yaklaşımın 

tanımlayıcı hassasiyeti geliştirilmiştir. in vitro koşullarda PZT tabanlı mutagenez 

çalışmasıyla farklı oranlarda heteroplazmik mutasyon taşıyan rekombinant mtDNA 

standartları oluşturularak yöntemin sınırları ve hassasiyeti gösterilmiştir. Hacettepe 

Üniversitesi Nöroloji Anabilim Dalı ve Çocuk Hastanesi Nöroloji ünitesinde takip 

edilmiş ve mitokondriyal sitopati öntanısı almış 219 hastanın kan ve/veya doku 

örnekleri, geliştirilen yöntem ile taranmıştır. Tarama sonucunda iki hastanın m.3243 

A>G mutasyonu, bir hastanın m.3290 T>C varyasyonu ve bir hastanın m.3303 C>T 

mutasyonu taşıdığı belirlenmiş, mutasyonlar DNA dizi analizi ile doğrulanmıştır. Bu 

yenilikçi yöntem, MT-TL1 nokta mutasyonlarının taranmasında ucuz, güvenilir ve 

hızlı bir alternatif sunmaktadır. Bu çalışma ve sonuçları, hastalarda nadir gözlenen 

diğer mtDNA varyasyonlarının da taranabilmesi için ileriye yönelik yeni ve teknolojik 

bir “kavram kanıtı” ortaya koymaktadır. 

 

Anahtar kelimeler: Mitokondriyal Sitopati, mitokondriyal genom, mitokondriyal 

tRNALeu(UUR) geni, ARMS-PZT, HRM, mutasyon analizi. 

  



viii 
 

ABSTRACT 

Bulduk, B.K., Investigating MT-TL1 Gene Mutations in Patients with Suspected 

Mitochondrial Cytopathy, Hacettepe University Institute of Health Sciences 

Medical Biology Programme Master of Science Thesis, Ankara, 2018. Point 

mutations in mitochondrial tRNA and rRNA genes cause oxidative phosphorylation 

defects by negatively affecting protein synthesis function. The majority of 

“mitochondrial cytopathies” are caused by point mutations in the tRNALeu (UUR) (MT-

TL1) gene. m.3243A>G mutation in the MT-TL1 gene is described in 80% of MELAS 

patients. However, other rare mutations such as m.3256 C>T, m.3260 A>G, m.3271 

T>C, m. 3291 T>C and m.3303 C>T are also identified in the same gene and associated 

with mitochondrial cytopathies. Within the scope of this study, a novel ARMS-PCR 

assay has been standardized to screen for the six described point mutations in the MT-

TL1 gene. The descriptive sensitivity of this approach was aimed to be improved by 

combining it with HRM technology. Detection limits and the precision of this novel 

method is verified by using recombinant mtDNA standards carrying heteroplasmic 

mutations at different rates which is created by PCR-based mutagenesis. Peripheral 

blood or skeletal muscle tissue samples of 219 patients, prediagnosed as mitochondrial 

cytopathies at the Departments of Neurology and Child Neurology Units of Hacettepe 

University Hospitals were screened using the developed method. The results of the 

screening procedure revealed two patients to have m.3243 A> G mutation, one patient 

with  m.3290 T> C variation, and one patient carrying m.3303 C>T mutation. These 

mutations were further confirmed by DNA sequence analysis. This novel ARMS-PCR 

assay study and its results provide a new and technological "proof of concept" for 

future screening of other rarely observed mtDNA variations in patients. 

 

Key words: Mitochondrial cytopathy, mitochondrial genome, mitochondrial tRNA 

for leucine (UUR), ARMS-PCR, HRM, mutation analysis. 

 

 

 



ix 
 

İÇİNDEKİLER 

 

ONAY SAYFASI iii 

YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv 

ETİK BEYAN v 

TEŞEKKÜR vi 

ÖZET  vii 

ABSTRACT viii 

İÇİNDEKİLER ix 

SİMGELER VE KISALTMALAR xii 

ŞEKİLLER xv 

TABLOLAR xviii 

1. GİRİŞ 1 

2. GENEL BİLGİLER 3 

2.1 Mitokondri Oluşumu, Yapısı ve İşlevi 3 

2.1.1 Mitokondriyal Genom 6 

2.1.2 Mitokondri Genetiği ve Kalıtımı 9 

2.3 Mitokondriyal Sitopatiler 10 

2.3.1 Leigh Sendromu 13 

2.3.2 Kearns-Sayre Sendromu 13 

2.3.3 MERRF (Myoclonic epilepsy with ragged red fibers) 14 

2.3.4 MELAS 14 

2.4 MT-TL1 Geni 16 

2.5 Mutasyon Analiz Teknikleri 19 

2.5.1 Restriksiyon Endonükleazlar 19 

2.5.2 ARMS-PZT (Amplification Refractory Mutation System) 19 

2.5.3 HRM (High Resolution Melting Analysis-Yüksek Çözünürlüklü Erime 

Analizi) 21 

2.5.4 Dizi Analizi 22 

3. GEREÇ VE YÖNTEMLER 24 

3.1 Gereçler 24 

3.1.1 Polimeraz Zincir Reaksiyonu ve PZR-Temelli Mutagenez 24 

3.1.2 Real-Time ARMS-PZT ve HRM Analizi 24 

3.1.3 Klonlama ve Bakteri Kültürü 24 



x 
 

3.1.4 Plazmid İzolasyonu 25 

3.1.5 DNA Dizi Analizi 25 

3.1.6 DNA İzolasyonu 25 

3.1.7 DNA Agaroz Jel Elektroforezi 26 

3.1.8 Agaroz Jelden DNA İzolasyonu ve Kantitasyonu 26 

3.2 Yöntemler 26 

3.2.1 ARMS Primer Tasarımı 26 

3.2.2 PZT Temelli Mutagenez 27 

3.2.3 Farklı Heteroplazmi Oranlar İçeren Pozitif Kontrollerin Hazırlanması 33 

3.4 Yüksek Çözünürlüklü Erime Eğrisi Analizi Koşulları 35 

3.5 MT-TL1 Geni Mutasyon Taramaları için ARMS-PCR Koşulları 36 

3.5.1 m.3243 A>G Mutasyonu Optimizasyonu 36 

3.5.2 m.3256 C>T Mutasyonu Optimizasyonu 37 

3.5.3 m.3260 A>G Mutasyon Optimizasyonu 38 

3.5.4 m.3271 T>C Mutasyon Optimizasyonu 41 

3.5.5 m.3291 T>C Mutasyon Optimizasyonu 43 

3.5.6 m.3303 C>T Mutasyon Optimizasyonu 44 

4. BULGULAR 46 

4.1 m.3243A>G Mutasyon Taraması ve dizi analizi ile doğrulama 46 

4.2 m.3256 C>T Mutasyon Taraması ve dizi analizi ile doğrulama 52 

4.3 m.3260 A>G Mutasyon Taraması ve dizi analizi ile doğrulama 56 

4.4 m.3271 T>C Mutasyon Taraması ve dizi analizi ile doğrulama 59 

4.5 m.3291T>C Mutasyon Taraması ve dizi analizi ile doğrulama 62 

4.6 m.3303C>T Mutasyon Taraması ve dizi analizi ile doğrulama 67 

5. TARTIŞMA 73 

6. SONUÇ VE ÖNERİLER 79 

6.1 Sonuçlar 79 

6.2 Öneriler 79 

7. KAYNAKLAR 80 

8. EKLER  

EK-1: MT-TL1 Geni.  

EK-2: ARMS-PZT primerlerinin hedeflediği MT-TL1 gen bölgesi.  

EK-3: m.3271 T>C mutasyonu ARMS-PZT optimizasyonu, iç primer konsantrasyon 

denemeleri.  



xi 
 

EK-4: Tez Çalışması İle İlgili Etik Kurul İzni  

9. ÖZGEÇMİŞ  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



xii 
 

SİMGELER VE KISALTMALAR 

 

°C Derece santigrat 

ADP Adenozin difosfat 

APAF1  Apoptotik proteaz aktive edici faktör 1 

ARMS Amplification-refractory Mutation System 

ATP Adenozin trifosfat 

Bcl-2 B-cell lymphoma 2 

bç/bp Baz çifti 

Ca+ Kalsiyum 

CoA Koenzim A 

COX Sitokrom c oksidaz 

ddNTP Dideoksinükleotit trifosfat 

dk Dakika 

D-loop  Displacement loop 

dNTP Deoksinükleotit trifosfat 

ER Endoplazmik retikulum 

ETS Elektron Taşıma Sistemi 

FADH2 Flavin Adenin Dinükleotit 

g gravity 

GPS2  G-Protein Pathway Suppressor 2 

H2O Su 

HRM High Resolution Melting – Yüksek çözünürlüklü erime 

IP3R İnositol 1,4,5-trifosfat reseptörü 

IPTG İzopropil-β-D-1-tiyogalaktopiranozoid 

kb Kilo baz 

LB  Luria-Bertani besiyeri 

Leu Lösin 

LHON Leber’in herediter optik nöropati 

MELAS Mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and 

stroke-like episodes 

MERRF  Myoclonicus epilepsy with ragged red fibers 



xiii 
 

mg Miligram 

MgCl2 Magnezyum Klorür 

mM Milimolar 

mtDNA Mitokondriyal Deoksiribonükleik Asit 

MT-ND Mitochondrially encoded NADH:ubiquinone 

oxidoreductase core subunit 

MT-TL1  Mitochondrially encoded tRNALeu(UUR)-1 

Na+ Sodyum 

NaCl Sodyum klorür 

NADH Nikotinamid Adenin Dinükleotit 

NaOAc Sodyum Asetat 

NaOH Sodyum hidroksit 

nDNA Nükleer Deoksiribonükleik Asit 

NDUFA1 NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit A1 

ng Nanogram 

NRF-1 Nuclear respiratory factor-1 

O2 Oksijen 

OXPHOS Oksidatif fosforilasyon 

PAH Fenilalanin hidroksilaz 

PDH Piruvat dehidrogenaz 

PGC-1α Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma 

coactivator-1 

POLG Mitokondriyal DNA polimeraz γ 

PZT Polimeraz Zincir Tepkimesi 

RE Restriksiyon Endonükleaz 

ROS Reaktif Oksijen Türleri 

rpm rounds per minute 

rRNA Ribozomal Ribonükleik Asit 

Rtg Retrograde regulation 

SDS Sodyum dodesil sulfat 

SLIK  Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase (SAGA)-like 

sn Saniye 



xiv 
 

STE  Sodium Chloride-Tris-EDTA 

TFAM  Human mitochondrial transcription factor A 

Tm Erime sıcaklığı 

tRNA Taşıyıcı Ribonükleik Asit 

u Birim 

X-Gal  5-bromo-4-kloro-3-indoil β-D-galaktozoid 

μL Mikrolitre 

μM Mikromolar 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



xv 
 

ŞEKİLLER 

  Şekil                                                                                                                    Sayfa 

2.1 Glikoz ve yağ asitleri metabolizmasının mitokondri bağlantılı temel  

basamakları 

 4 

2.2 Elektron taşıma sistemi elemanları  5 

2.3 Mitokondriyal DNA haritası  8 

2.4  mtDNA heteroplazmisi ve eşik etkisi 12 

2.5  MT-TL1 gen ürünü: TrnaLeu(UUR) 16 

2.6 ARMS-PZT’nin şematik gösterimi ve tepkime sonucunda elde 

edilen ürünlerin agaroz jel elektroforez görüntüsü 

20 

2.7 Yüksek Çözünürlüklü Erime Analizi. A. HRM öncesi PZT 

basamakları. B. Erime eğrisi oluşturulması 

22 

3.1 Megaprimer methoduyla mutagenez yaklaşımı 28 

3.2 Pgem-T Easy vektörünün haritası 32 

3.3 Ispanak mtDNA’sı ve insan mtDNA’sıyla yapılan m.3243 A>G 

mutasyonu analizi 

34 

3.4 Farklı oranlarda heteroplazmi içeren sentetik pozitif kontrol karışım 

kalıplarının hazırlanması 

35 

3.5 ARMS-PZT m.3243 A>G mutasyonu optimizasyon öncesi agaroz 

jel görüntüsü 

36 

3.6 ARMS-PZT m.3243 A>G mutasyonu agaroz jel görüntüsü 37 

3.7 ARMS-PZT  m.3256 C>T mutasyonu agaroz jel görüntüsü 37 

3.8 ARMS-PZT m.3260 A>G mutasyonunun farklı dış primerlerin 

kombinasyonlarıyla yapılan optimizasyon çalışmaları 

39 

3.9 ARMS-PZT m.3260 A>G mutasyonunun üç farklı sıcaklıkta 

gerçekleştirilen optimizasyon tepkimesi 

39 

3.10 ARMS-PZT  m.3260 A>G mutasyonu agaroz jel görüntüsü 41 

3.11 m.3271 T>C mutasyonu için tasarlanan primerler arası rekabetin 

kontrolü 

41 

3.12 ARMS-PZT m.3271 T>C mutasyonu agaroz jel görüntüsü 43 

3.13 m.3291 T>C mutasyonu farklı bağlanma sıcaklıklarında 

optimizasyon denemeleri 

43 

3.14 ARMS-PZT m.3291 T>C mutasyonu agaroz jel görüntüsü 44 

3.15 ARMS-PZT m.3303 C>T mutasyonu agaroz jel görüntüsü 45 

4.1 m.3243 A>G mutasyonu ARMS-PZT erime eğrisi analizleri 46 



xvi 
 

4.2 m.3243 A>G mutasyonuna sahip sentetik kontrollerin ayrıntılı erime 

eğrisi analizi. 

47 

4.3 m.3243 A>G mutasyonu ARMS-PCR hasta taramaları-1 48 

4.4 m.3243 A>G mutasyonu ARMS-PCR hasta taramaları-2 49 

4.5 m.3243 A>G mutasyonu ARMS-PCR hasta taramaları-3. 50 

4.6 m.3243 A>G mutasyon taramalarında pozitif çıkan 111 numaralı 

hasta örneğinin agaroz jel elektroforezi, erime eğrisi ve dizileme 

sonuçları 

51 

4.7 m.3243 A>G mutasyon taramalarında pozitif çıkan 135 numaralı 

hasta örneğinin agaroz jel elektroforezi, erime eğrisi ve dizileme 

sonuçları 

51 

4.8 m.3256 C>T mutasyonu ARMS-PZT erime eğrisi analizleri. 52 

4.9 m.3256 C>T mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları-1 53 

4.10 m.3256 C>T mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları-2 54 

4.11 m.3256 C>T mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları-3 55 

4.12 m.3260 A>G mutasyonu ARMS-PZT erime eğrisi analizleri 56 

4.13 m.3260 A>G mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları -1. 57 

4.14 m.3260 A>G mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları -2 58 

4.15 ARMS-PZT m.3260 A>G mutasyonu taramalarında belirlenen 

yalancı pozitif sonuçların agaroz jel ve dizileme analizleri -1 

58 

4.16 ARMS-PZT m.3260 A>G mutasyonu taramalarında belirlenen 

yalancı pozitif sonuçların agaroz jel ve dizileme analizleri -2 

59 

4.17 m.3271 T>C mutasyonu ARMS-PZT erime eğrisi analizleri 60 

4.18 m.3271 T>C mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları -1 61 

4.19 m.3271 T>C mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları -2 62 

4.20 m.3291 T>C mutasyonu ARMS-PZT erime eğrisi analizleri 63 

4.21 m.3291 T>C mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları -1 64 

4.22 m.3291 T>C mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları -2 65 

4.23 m.3291 T>C mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları -3 66 

4.24 m.3291 T>C mutasyonu taramalarında m.3290 T>C varyasyonu 

pozitif çıkan 814 numaralı hastaörneğinin agaroz jel elektroforezi, 

erime eğrisi ve dizileme sonucu 

67 

4.25 m.3303 C>T mutasyonu ARMS-PZT erime eğrisi analizleri 68 

4.26 m.3303 T>C mutasyonu ARMS-PCR hasta taramaları -1 69 

4.27 m.3303 T>C mutasyonu ARMS-PCR hasta taramaları -2 70 

4.28 m.3303 T>C mutasyonu ARMS-PCR hasta taramaları -3 71 



xvii 
 

4.29 m.3303 T>C mutasyonu taramalarında pozitif çıkan 641 numaralı 

hasta örneğinin agaroz jel elektroforezi, erime eğrisi ve dizileme 

sonuçları 

72 

5.1 m.3256 C>T mutasyonu için tasarlanan primerlerin özgül olmayan 

bölgelere bağlanması sonucunda elde edilen erime eğrisi grafiği 

76 

 

  



xviii 
 

TABLOLAR 

    Tablo                                                                                                                 Sayfa 

2.1 Mitokondriyal solunum zinciri elemanları, altbirimleri ve 

sentezlendikleri genler 

7 

2.2 MT-TL1 geninde meydana gelen mutasyonlar ve ilişkili oldukları 

sendromlar. 

17 

3.1 ARMS-PCR Primerleri 27 

3.2 Mutasyona özgü mutajenik primerler. 28 

3.3 Kalıp DNA için kullanılan primer çiftleri 29 

3.4 ARMS-PZT m.3243 A>G mutasyonu şartları 36 

3.5 ARMS-PZT m.3256 C>T mutasyonu şartları 38 

3.6 ARMS-PZT m.3260 A>G mutasyonu şartları 40 

3.7 ARMS-PZT m.3271 T>C mutasyonu şartları 42 

3.8 ARMS-PZT m.3291 T>C mutasyonu şartları 44 

3.9 ARMS-PZT m.3303 C>T mutasyonu şartları 45 

5.1 ARMS-PZT taramaları sonucunda MT-TL1 geninde mutasyon 

tespit edilen hastalar 

75 



1 
 

1.GİRİŞ 

 

Mitokondri ökaryotik hücrelerde bulunan, oksidatif fosforilasyon 

tepkimeleriyle hücrenin temel enerji ihtiyacını karşılamak gibi önemli bir işlevi 

bulunan özelleşmiş bir organeldir. Endosimbiyotik teoriye göre prokaryot hücrenin 

ökaryotik hücrenin içine girmesiyle oluştuğu düşünülen bu çift zarlı organel (1), 

yapısında 16,569 baz çifti uzunluğunda kendine ait halkasal DNA bulundurur. 

Mitokondriyal DNA (mtDNA) 37 gen içermektedir; bu genlerden 13’ü protein 

kodlarken, 22’si transfer RNA (tRNA), ikisi de ribozomal RNA (rRNA) kodlar (2). 

mtDNA’nın tRNA ve rRNA genlerini içeren kısımlarında meydana gelen 

mutasyonlar, mitokondriyal protein sentezi mekanizmasını olumsuz etkileyerek 

oksidatif fosforilasyon işlev bozukluklarına neden olur. Klinikte “mitokondriyal 

sitopatiler” olarak karşımıza çıkan bu tabloda, lösin tRNA (MT-TL1) geninde meydana 

gelen nokta mutasyonları önemli bir yere sahiptir. MT-TL1 geninde görülen 

m.3243A>G mutasyonu MELAS hastalarının %80’ninde, m.3271 T>C mutasyonu ise 

MELAS hastalarının %7-10’unda tanımlanmıştır (3,4). Aynı gende tanımlanmış olan 

m.3256 C>T, m.3260 A>G, m.3291 T>C ve m.3303 C>T nokta mutasyonlarının da 

patojenik olduğu ve mitokondriyal sitopati tablosuyla örtüştüğü belirlenmiştir. Meta 

analizler sonucunda mtDNA’da meydana gelen mutasyonların prevalansının en az 

1/5000 olduğu tahmin edilmekte (5), Avrupa’da mitokondriyal hastalıklarla yaşayan 

insan sayısının 400,000 civarında olduğu ve mitokondriyal hastalıkların görülme 

sıklığının 1/2000 olduğu düşünülmektedir (6). 

Bilinen mutasyonlarının doğrudan analizinde genellikle düşük maliyetli 

restriksiyon endonükleazlar (RE) tercih edilmektedir. İlgilenilen dizide meydana gelen 

mutasyonlar enzim kesim bölgeleri yaratabilir ya da var olan enzim kesim bölgelerini 

ortadan kaldırabilir; her iki durumda da RE’lar bu mutasyonların tayini için iyi bir 

seçenektir. Ancak herhangi bir RE dizisiyle uyuşmayan nokta mutasyonlarının 

varlığında çok daha yüksek maliyetli DNA dizi analizini kullanmak kaçınılmazdır. Söz 

konusu nokta mutasyonlarının belirlenmesinde amplikasyon refraktör mutasyon analiz 

sistemi (ARMS), RE’ye önemli bir alternatif sunmaktadır. ARMS yöntemi nokta 

mutasyonuna ve normal allele özgül olmak üzere iki farklı amplikon çoğaltmayı 

hedefleyen bir polimeraz zincir tepkimesi (PZT) tasarımına dayanmaktadır (7). 



2 
 

Tasarlanan reaksiyon sonucunda allele özgül olarak iki farklı uzunlukta PZT ürünü 

oluşur ve bu ürünler agaroz jel elektroforez yardımıyla görüntülenerek hızlı, düşük 

maliyetli mutasyon analizine olanak sağlar. 

Bu çalışmada mitokondriyal sitopati öntanısı almış hastalarda MT-TL1 geninde 

belirlenmiş altı nokta mutasyonun taranmasına yönelik yenilikçi bir ARMS-PZT 

yöntemi geliştirilmiş ve geliştirilen bu yöntemin yüksek çözünürlüklü erime eğrisi 

(HRM) teknolojisiyle hassasiyetinin arttırılması amaçlanmıştır.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



3 
 

2.GENEL BİLGİLER 

 

Ökaryotik organizmaların büyük bir kısmında bulunan mitokondri, hücrenin 

yaşamsal faaliyetleri için gerekli olan enerjinin çok büyük bir kısmını karşılayan, 

kendine ait genomu olan özel organeldir.  

2.1 Mitokondri Oluşumu, Yapısı ve İşlevi 

Mitokondri kendine özgü genomuyla ve çift zarlı yapısıyla araştırmacıların her 

zaman ilgisini çeken, oluşumu ve gelişimi üzerine çeşitli hipotezler kurulan bir 

organeldir. 1980’lerin sonlarında yapılan ribozomal RNA’nın filogenetik analiz 

çalışmalarıyla mitokondrinin endosimbiyoz ile α-proteobacteria olan Rickettsiales 

ailesinin, ökaryotik atasal hücrenin içine girmesiyle oluştuğu gösterilmiştir (1). 

Mitokondriyal genom, maya çekirdeği ve bakteriler arasındaki homolog genlerin 

kullanıldığı filogenetik rekonstrüksiyonlarla da kanıtlanan mitokondri ve Rickettsia 

yakınlığı; Krebs döngüsü, solunum döngüsü ve translasyon sistemleri için kodlanan 

genlerin benzerlikleriyle de desteklenmiştir (1,8).  

Mitokondri, özelleşmiş bir yapıya sahiptir. Yapısında bulunan dış ve iç 

membranlar, membranların arasında kalan boşluk ve organelin merkezinde bulunan 

jelimsi yapıdaki matriks ile üç temel bölüme ayrılır. Dış membran ve iç membran 

birbirinden oldukça farklı geçirgenlikte olup; dış membran 10,000 daltonun altındaki 

tüm moleküllerin organel içine geçişine izin verirken (9), iç membran küçük 

moleküllerin ve iyonların geçişini kısıtlayıcı bir bariyer görevi görmektedir. Yapı 

olarak hücre zarına da benzeyen iç membran ayrıca elektron transport sisteminde ve 

ATP sentezinde görev alan proteinler bakımından da oldukça zengindir. Bu yapıda iç 

membranın matrikse doğru yaptığı krista adı verilen, membranın yüzey alanını 

biyokimyasal tepkimelerin gerçekleşmesi için genişleten kıvrımlar bulunmaktadır. İç 

membranın çevrelediği mitokondriyal matriks ise Krebs döngüsünün gerçekleştiği; 

içeriğinde enzim, protein, mitokondriyal DNA ve RNA bulunan kısımdır.  

Krebs Döngüsü ya da diğer adıyla Sitrik Asit Döngüsü, 1937’de ilk kez Hans 

Adolf Krebs tarafından keşfedilen (10); hücresel enerjinin 2/3’ünün üretildiği, 

oksijenli solunum yapan tüm canlıların temel metabolik yolağıdır (11).  Hücresel enerji 



4 
 

üretiminin temel basamağı olan glikoliz sonucunda üretilen piruvat molekülleri, 

sitoplazmadan mitokondriyal matrikse taşınır ve oksidasyonla acetyl CoA’ya 

dönüştürülerek Krebs döngüsüne girer. Benzer şekilde yağ asitleri, sitoplazmada acyl-

CoA sentataz ile fatty acyl-CoA’lara dönüştürülüp, difüzyon ile mitokondriye geçer 

ve matrikste gerçekleşen β-oksidasyon tepkimesiyle acetyl-CoA’a indirgenerek Krebs 

döngüsüne girer (12) (Şekil 2.1). 

 

Şekil 2.1 Glikoz ve yağ asitleri metabolizmasının mitokondri bağlantılı temel 

basamakları. 

Krebs döngüsü sırasında meydana gelen zincirleme tepkimeler sonucunda 

ortaya çıkan son ürünler CO2, NADH ve FADH2’dir. NADH ve FADH2  

mitokondrinin iç zarında bulunan elektron taşıma sistemi elemanlarının temel elektron 

ihtiyacını karşılayan koenzimlerdir (11). Elektronlar, sitokrom c ve koenzim Q gibi 

taşıyıcılar aracılığıyla elektron vericisi ve alıcısı olarak organize olmuş dört 

kompleksten (I-IV) geçerek, kompleks IV’ün (sitokrom c oksidaz) katalizlediği  son 

basamakta O2 ile birleşip H2O molekülü oluşturur (Şekil 2.2) (9). 

Elektron taşıma zinciri elemanları boyunca NADH ve FADH2‘den aktarılan 

protonlar matriksten membranlar arası boşluğa geçerken bir proton gradyanı oluşturur; 

protonların membranlar arasındaki boşlukta depolanmasıyla proton hareket gücü 



5 
 

oluşur. Membranlar arası boşlukta biriken protonlar, ATP sentaz (kompleks V)  ile 

matrikse taşınır, ortaya çıkan enerji ile ADP ve inorganik fosfatın birleşmesiyle ATP 

üretilir (Şekil 2.2). Bu süreç oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) olarak tanımlanır. 

OXPHOS sonucunda mitokondri, hücresel hasara ve yaşlanmaya neden olan reaktif 

oksijen türleri (ROS) üretir. Dolayısıyla mitokondri, bir taraftan hücrenin enerji 

ihtiyacını karşılama görevi görürken diğer taraftan hücresel yaşlanmaya ve patolojik 

bir çok duruma da neden olur (2,13).  

 

Şekil 2.2 Elektron taşıma sistemi elemanları. 

Sitrik asit döngüsü, elektron taşıma sistemi için NADH ve FADH2 üreterek 

ATP sentezine olanak sağlamasının yanı sıra, ara ürünleriyle biyosentez yolaklarında 

görev alarak steroid, heme, amino asit ve nükleotid sentezine de yardımcı olur (2,12).  

Mitokondri, çevresindeki organellerle ve çekirdekle iletişim halinde kalarak 

biyoenerjetik-biyosentetik rolünü enerji ihtiyacına göre şekillendirir. Mitokondri 

anterograd (sitozolden mitokondriye doğru taşıma) ve retrograd (mitokondriden 

sitozole doğru taşıma) olmak üzere iki farklı yolla hücre içi sinyal iletimini sağlar. 

Anterograd sinyal iletimine çekirdekten gelen ve mitokondri işlevini düzenleyen 

sinyaller örnek verilebilir. Çekirdek genomundan kodlanan NRF-1 (nuclear 

respiratory factor-1) ve PGC-1α’nın (peroxisome proliferator-activated receptor-

gamma coactivator-1) birlikte solunum genlerinin transaktivasyonunda görev alması 

ve çekirdek genomundan kodlanıp mitokondriye taşınan mitokondriyal transkripsiyon 

faktörü TFAM’ın mtDNA transkripsiyonunun doğrudan düzenlemesi anterograd 

sinyal iletiminin bir sonucudur (14,15). Retrograd sinyal iletimi ise solunum zinciri 



6 
 

elemanlarında meydana gelen bozukluklar, mtDNA mutasyon birikimleri, mtDNA 

kopya sayısı değişimleri ve mitokondriyal membran potansiyelinin azalmasıyla 

başlatılır. İlk kez maya hücrelerinde tanımlanan retrograd sinyal iletiminde Rtg1/Rtg3 

transkripsiyon faktörleri ve sitoplazmik Rtg2 proteininin temel düzenleyiciler olduğu 

ve transkripsiyon faktörlerinin çekirdekten çıkmasını sağlayıp, SLIK (Spt-Ada-Gcn5 

acetyltransferase (SAGA)-like) kromatin remodelling kompleksinde görev alarak 

çekirdekte retrograd gen transkripsiyonunu düzenlediği bilinmektedir (16). 

Cardamone ve arkadaşları fareler üzerinde yaptığı araştırmalarda mayadaki Rtg2’nin 

işlevsel homoloğunun memelilerdeki GPS2 (G-Protein Pathway Suppressor 2)  

olduğunu ve mitokondriyal depolarizasyonla çekirdeğe ulaşan GPS2’nin buradaki 

mitokondriyal genlerin promotörlerine bağlanarak transkripsiyonunu düzenlediğini 

bildirmişlerdir (17).  

Anterograd ve retrograd sinyal iletimlerinin yanı sıra mitokondri hücre içi 

homeostaziyi sağlamak adına diğer organellerle de etkileşimdedir. Mitokondri, dış 

zarında bulunan uniport ve Na+2/Ca+2 pompları ile sitozolde biriken Ca+2’u içine alarak 

hücre içi Ca+2 dengesini sağlarken; inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü (IP3R) ve anyon 

kanalları aracılığıyla da endoplazmik retikulum (ER) ile iyon alışverişinde bulunur 

(13,18). Mitokondri hücre için oldukça önemli olan apoptoz yolaklarında da görev alır. 

Bcl-2 proteinleri mitokondri dış zarına yerleşip zarın geçirgenliğini arttırarak sitokrom 

c nin organel dışına çıkmasına neden olur; sitokrom c, APAF1 (apoptotik proteaz 

aktive edici faktör 1) ve prokaspaz 9 ile birleşip apoptozom kompleksini oluşturarak 

apoptoz olayını başlatır (13,18). 

 

2.1.1 Mitokondriyal Genom 

Mitokondriyal matriks içerisinde, Krebs döngüsünde görev alan enzimlerin 

yanı sıra mitokondriyal DNA (mtDNA) da bulunur. İnsan mtDNA molekülü 16,569 

baz çifti uzunluğunda, halkasal yapıda, çift zincirden oluşan ve içeriğinde 37 gen 

barındıran özel bir nükleik asittir (Şekil 2.3). 37 genin 13’ü solunum zinciri 

elemanlarından olan kompleks I, III, IV ve V’ün ant ünitelerini kodlar (19,20) (Tablo 

2.1), 22 tanesi mt-tRNA kodlanmasında, iki tanesi de mt-rRNA sentezinde görev alır 

(2). Evrimsel süreçte, mitokondriyal genomda bulunan bazı genlerin kaybolduğu, 



7 
 

ATP/ADP translokaz genleri gibi mitokondri işlevi için önemli genlerin 

endosimbiyotik ilişkisinin bir sonucu olarak çekirdek genomuna aktarıldığı 

düşünülmektedir (8). Bugün 1500’e yakın mitokondri ilişkili genin kromozomal DNA 

üzerinde dağınık bir şekilde bulunduğu ve mitokondriyal proteinlerin %99’unun 

çekirdek DNA’sından kodlandığı bilinmektedir (2,19). 

Tablo 2.1  Mitokondriyal solunum zinciri elemanları, altbirimleri ve sentezlendikleri 

genler (19). 

Altbirim 
Kompleks 

I 

Kompleks 

II 

Kompleks 

III 

Kompleks 

IV 

Kompleks 

V 

mtDNA'dan 

kodlanan 
7 0 1 3 2 

nDNA'dan 

kodlanan 
39 4 10 10 14 

Mitokondri 

albirimleri 

ND1, ND2, 

ND3, ND4, 

ND5, ND6, 

ND4L 

_ Sitokrom b 

COX I, 

COX II, 

COX II 

ATPase 6 

ATPase 8 

Enzimler 

NADH -

CoQ 

Redüktaz 

Süksinat 

dehidrogenaz 

Sitokrom c 

redüktaz 

Sitokrom c 

oksidaz 

ATP 

sentaz 

 

 

Çekirdek DNA’sından sentezlenen proteinlerin içerisinde Kompleks II’nin 

dört altbirimi de dahil olmak üzere (Tablo 2.1), mitokondriyal DNA polymerase γ 

(POLG), mitokondriyal transkripsiyon faktörü (TFAM), mitokondriyal ribozomal 

proteinler, elongasyon faktörleri ve mitokondriyal metabolik enzimler de bulunur (20). 

Mitokondriyal DNA’nın iki zinciri baz içeriklerine göre ağır ve hafif zincir 

olarak adlandırılır: ağır (H)  zincir guanin (G) bakımından zenginken, hafif (L) zincirin 

yapısında karşılık gelen sitozinler (C) bulunur. H-zinciri, 12S (küçük) rRNA ile 16S 

(büyük) rRNA, 12 polipeptid ve 14 tRNA dizisini içerirken , L-zinciri ND6 polipeptidi 

ve 8 tRNA için bir kalıp görevi görmektedir (21). Mitokondriyal DNA’da H-zinciri ve 

L-zinciri için iki farklı replikasyon başlangıç dizisi bulunur; H-zincirinin replikasyon 

başlangıç dizisi, major noncoding region (NCR)’da bulunan D-loop (displacement 

loop) bölgesinde yer alır. D-loop içerisinde H-zincirine ait (HSP1) ve L-zincirine ait 

(LSP) olmak üzere iki farklı mtDNA promotörü içerir. D-loop içinde üç farklı 



8 
 

korunmuş dizi bloğu ve terminasyon ilişkili diziler (Termination-associated sequnces: 

TAS) yer alır (Şekil 2.3) (21,22).  

 

Şekil 2.3 Mitokondriyal DNA haritası. (Suzuki ve ark.’dan (2011) uyarlanmıştır) (6). 

mtDNA replikasyonu mtDNA polimeraz γ (Pol γ), Twinkle helikazı, 

topoizomeraz I ve mtDNA’ya bağlanan proteinleri de içeren bir multi-protein 

replizomu ile gerçekleşir. İki farklı mtDNA replikasyon modeli ortaya atılmıştır. 

“Strand-displacement” ya da “asynchronous” olarak adlandırılan modele göre 

replikasyon, kodlanmayan mtDNA bölgesi olan D-loop’ta transkripsiyonun 

başlamasıyla başlar (23). Ağır zincirin orijininden başlayıp saat yönünde devam eden 

bu replikasyon,  hafif zincirin replikasyon orijinine ulaşarak hafif zincirin saat yönünde 

sentezine izin vererek tüm molekülün kopyalanmasını sağlar (23). Bir diğer 

replikasyon modeli olan “symetric strand-coupled”da ise mtDNA replikasyonun 4 

kb’lık fragmanda farklı noktalarda bulunan orijinlerden aynı anda başlayarak her iki 

yönde de replikasyon balonları içerisinde devam eder  (24) .  



9 
 

Her bir mitokondrionunun 1-15 arasında mtDNA kopyası taşıdığı 

öngörülmektedir (25). Çekirdekteki histonlarla DNA ipliklerinin oluşturduğu 

nükleozom yapılarına benzer yapılar mitokondride de bulunur, nükleoid adı verilen bu 

yapılar içeriğinde histon proteinleri bulundurmazlar. Her nükleoidin yapısında bir ya 

da iki mtDNA molekülü vardır (23). Bu yapılar iç membranın matrikse bakan iç 

yüzünde yer alır. mtDNA’nın mutasyonlara oldukça açık olmasının nedenleri arasında, 

iç membranda ETS elemanlarına yakın olması ve OXPHOS sonucunda açığa çıkan 

oksijen serbest radikallerine maruz kalması gösterilmektedir. Çeşitli modellerle 

yapılan çalışmalarda mtDNA’nın nDNA’ya göre mutasyonlara 10 kat kadar daha açık 

olduğu belirlenmiştir. (26,27). Bazı çalışmalarda mitokondride meydana gelen 

oksidatif DNA hasarlarında base-excision repair mekanizmasına benzer bir işlev 

gösterilmiş olsa da (28,29) mtDNA’da etkin bir hasar tamir mekanizmasının varlığı 

hala tartışmalıdır. Mitokondriye ait etkin bir tamir mekanizması olmaması, 

mtDNA’nın mutasyonlara açık olmasının nedenleri arasında gösterilmektedir.  

 

2.1.2 Mitokondri Genetiği ve Kalıtımı  

Mitokondri genetiği birçok yönden çekirdek DNA’sının (nDNA) Mendelyan 

kalıtım kalıplarından  farklılık gösterir. Mitokondri genetiğinin en önemli özelliği 

maternal kalıtım göstermesidir. Literatürde, Schwartz and Vissing’in 2002 yılında 

yayınladıkları ND2 geninde iki bazlık bir delesyon taşıyan vaka raporunda (30) olduğu 

gibi bazı meyve sineği, fare ve koyun modellerinde de paternal kalıtımın görüldüğü 

istisnai durumlar da bulunmaktadır (31).  Oosistlerde sayısı 10000’i bulan mtDNA 

kopyası, sperm hücrelerinde 100 kopyanın altındadır (23). Sperm ile oositin birleşmesi 

sonucunda paternal mitokondrinin popülasyonda kaybolmasının nedeni sadece sayıca 

az olmasıyla açıklanamaz. 1999 yılında Sutovsky ve arkadaşlarının inek ve maymun 

embriyolarında yaptığı araştırmalar paternal mitokondrinin ubiquitin taşıdığını, bu 

nedenle embriyo içerisinde otofaji yoluyla elimine edildiğini göstermiştir (32). C. 

elegans (33) ve fare (34) ile yapılan deneylerde de benzer şekilde sperm içerisinde 

taşınan paternal mitokondrinin, taşıdığı belirteçler yoluyla otofaji mekanizmasını 

aktive ederek yıkıldığı gösterilmiştir. 



10 
 

nDNA kalıtımında independent assortment (bağımsız dağılım) ve 

rekombinasyon ile farklı genetik içeriklerin gelecek kuşaklara aktarılması söz 

konusuyken, mtDNA’da rekombinasyon olmaksızın mutasyonlar birikerek bir sonraki 

kuşağa aktarılır (35). mtDNA varyantları popülasyon genetiğinde “şişe boynu” olarak 

adlandırılan seçilim modeliyle bir sonraki kuşağın mtDNA içeriğini belirler. Fluoros 

ve arkadaşları, mtDNA segregasyonu ve seçiliminin insan embriyosunun gelişim 

döneminde-Carnegie evrelerinde- meydana geldiğini göstererek ilk kez şişe boynu 

modelini insan embriyosunda göstermişlerdir (36). 

Mitokondriyal genomun poliploidik bir yapısı vardır; hücrenin çeşidine göre 

içerdiği mtDNA sayısı 10,000’i geçebilir (25,37,38). Bu durum mitokondri 

genetiğinde homoplazmi ve heteroplazmi olarak adlandırılan iki önemli kavramın 

temelini oluşturur. Homoplazmi belirli bir lokus için tüm mtDNA kopyalarının özdeş 

olduğu durumu ifade ederken; heteroplazmi durumunda ise iki ya da daha fazla 

mitokondriyal genotipin varlığı söz konusudur. Heteroplazmik mtDNA bulunduran 

hücreler bölündüklerinde içerdikleri farklı mtDNA molekülleri yeni oluşan hücrelere 

rastgele dağılım göstererek aktarılır. Bu kavrama replikatif segregasyon adı verilir ve 

yeni oluşan hücrelerin birbirlerinden farklı oranlarda heteroplazmik mtDNA içerdiğini 

açıklar. 

mtDNA’da ortaya çıkabilecek değişikliklerin “patolojik mutasyon” olarak 

gözlemlenmesi için gerekli bir eşik (threshold) seviyesi vardır (bkz. 2.3) ve bu 

seviyenin aşılması durumunda mitokondri hayati biyokimyasal işlevlerini yerine 

getiremeyerek ortaya klinik bir tablo çıkartır (39). Yapılan tek hücre (single cell) ve 

transmitokondriyal hücre hattı çalışmaları, mitokondriyal genomda meydana gelen 

mutasyonların işlevsel olarak “çekinik nitelikte” olduğunu ve ancak eşik seviyesinin 

üstünde bir oranın (ortalama %65 üstü) varlığında biyokimyasal fenotiplerin ortaya 

çıktığını göstermektedir (39,40).  

 

2.3 Mitokondriyal Sitopatiler 

 Mitokondriyal sitopatiler, kalıtım yoluyla aktarılan ya da sonradan edinilen, 

mitokondri hasarının sonucunda ortaya çıkan ve bu hasar nedeniyle hücresel enerji 

üretim mekanizmasını olumsuz etkileyen, genetik heterojenitenin görüldüğü multi-



11 
 

sistemik hastalık grubudur. Mitokondri protein içeriğinin iki farklı kaynağı olan nDNA 

ve mtDNA, mitokondriyal sitopatilerin genetik ve biyokimyasal temellerini 

belirlemektedir. Mitokondri işlevinde görev alan çekirdek genomunda kodlanan 

genlere ilişkin mutasyonlar otozomal (Mendelian) kalıtım kuralları ile aktarılmaktadır. 

Bu mutasyonlardan bazıları mtDNA replikasyonundan sorumlu olan mitokondriyal 

DNA polymeraz γ (POLG), helikaz (41), primaz ve ligaz genlerinde (42,43) meydana 

gelen mutasyonlar olabileceği gibi çekirdek genomunda bulunan mtDNA idamesinden 

sorumlu timidin kinaz ve fosforilaz genlerinde de meydana gelebilir(44). Bu grupta 

yer alan mutasyonlar mtDNA’da çoklu delesyon, duplikasyon ve deplesyonlar 

oluşturarak (45) mtDNA’da kalitatif ve kantitatif bozukluklara neden olur. 

OXPHOS’da görev alarak kompleks I ve kompleks II alt ünitelerini biraraya getiren 

“assembly” faktörlerinin sentezlendiği çekirdek genlerinde meydana gelen 

mutasyonlar da otozomal kalıtılan mutasyonlara örnek verilir (46). 

mtDNA mutasyonlarıyla ilişkili olan mitokondriyal sitopatiler, mitokondrinin 

dağılım hacmi nedeniyle hemen hemen her doku ve organı etkileyebildikleri gibi, 

ilerleyen yaşlarda post-mitotik hücrelere  –nöron ve kas hücreleri gibi- bağlı olarak da 

kendini gösterebilir (44,47). Bir dokuda mitokondriyal sitopatinin gözlemlenebilmesi 

için mutant mtDNA’nın belli bir oranın üstünde olması ve bir somatik yük oluşturması 

gerekir. Somatik yükün hastalık yapıcı etkisi ise eşik etkisi olarak adlandırılır ve bu 

eşik her dokunun enerji ihtiyacına göre organdan organa farklılık gösterebilir.  

Mitokondriyal hastalıklarda genotip-fenotip ilişkisi cybrid adı verilen trans-

mitokondriyal hücre hatlarının geliştirilmesi ve kullanılmasıyla beraber netlik 

kazanmıştır. 1986’da ilk kez Wallace yaptığı çalışmada mitokondriyal 16S RNA 

geninde meydana gelen mutasyonların %15’lik bir yüke ulaşınca fenotipe yansıdığını 

göstermiştir (48). MERRF ve MELAS hastalarının hücre hatlarından elde edilen 

cybridlerde patojenik mutasyonların söz konusu olduğu durumlarda fenotipik bir eşik 

değeri olduğu ispatlanmış, MERRF ve MELAS hastalarının kas hücrelerinde mutant 

yükün sırasıyla %90’ı ve %65’i geçmesi durumunda klinik bulgular gözlemlendiği 

belirlenmiştir (39). Shoffner ve arkadaşlarının araştırmalarına göre mtDNA 

delesyonlarında %60’lık bir yükün fenotipi etkilemek için yeterli olduğu, diğer 

mutasyon tiplerinin fenotipe yansıma değerinin %90’ları da bulabileceği söylenebilir 

(49,50).  Mutant ve sağlıklı mtDNA kopyalarının bir arada bulunduğu 



12 
 

popülasyonlarda sağlıklı mtDNA’nın genellikle patojenik mutasyon taşıyan kopyayı 

tolere ettiği düşünülmektedir. Bu durumun kimyasal temeli, mtDNA üzerinde oluşan 

patojenik mutasyonların eksik baskınlıkta ya da resesif (çekinik) nitelikte olmasıdır  

(23). Sağlıklı ve mutant mtDNA kopyalarının birarada olduğu bir hücrede, OXPHOS 

ve mitokondriyal protein sentez mekanizmalarının devamlılığı sağlıklı kopyaların 

varlığında biyokimyasal eşik etkisi aşılana kadar devam eder. Mutant içeriğin hücrede 

birikerek artması ve mutant yükün %80 civarına ulaşması durumunda mitokondri 

işlevini yerine getiremeyerek işlev yetersizliğinin ortaya çıkmasına neden olur (23) 

(Şekil 2.4) . 

 

Şekil 2.4 mtDNA heteroplazmisi ve eşik etkisi. 

mtDNA’da meydana gelen mutasyonlar “2.2.1 Mitokondri Genetiği” 

bölümünde bahsedildiği gibi genellikle maternal kalıtım ile bir sonraki kuşağa 

akatarılır. Ancak annede mutant mtDNA varlığı bilinse dahi şişe boynu seçilimiyle 

hangi oranda mutant, hangi oranda sağlıklı mtDNA kopyanın çocuğa aktarılacağı 

öngörülemez. Avrupa toplumunda 400,000 insanın mitokondriyal sitopati hastası 

olduğu bilinmekte ve bu hastalıkların görülme sıklığı yaklaşık 1:2,000 olarak tahmin 

edilmektedir (5,6). 

Günümüzde mitokondriyal sitopatilerin radikal tedavisi olmamakla birlikte, 

hastanın gösterdiği semptomlara yönelik vitamin, kofaktör ve antioksidan takviyesi 

gibi palyatif yöntemler uygulanmaktadır (47,51). 

 

 



13 
 

2.3.1 Leigh Sendromu 

Leigh Sendromu, her 40,000 doğumda bir görülen nörodejeneratif bir 

hastalıktır (52). Sayısı 50’yi aşan, çekirdeksel ve mitokondriyal DNA kaynaklı, ETS 

elemanlarının altünite birimlerinin ve solunum komplekslerinin oluşmasında görev 

alan assembly faktörlerinin sentezlendiği genlerde meydana gelen mutasyonlar 

nedeniyle görülür (53). Dolayısıyla mutasyonun gerçekleştiği gene bağlı olarak X’e 

bağlı resesif, otozomal resesif ya da maternal olarak bir sonraki kuşağa aktarılır. X’e 

bağlı resesif aktarılan Leigh hastalıklarına piruvat dehidrogenaz (PDH) eksikliğine 

neden olan PDHA1 geninde meydana gelen mutasyonları ya da NDUFA1 geninde 

oluşup kompleks I eksikliğine neden olan mutasyonları gösterebiliriz (54). Otozomal 

resesif geçişle bir sonraki kuşağa aktarılan patojenik mutasyonlar ise OXPHOS 

enzimlerinin ya da assembly faktörlerinin  kodlandığı genlerde meydana gelen 

mutasyonlardır. Bu mutasyonlara kompleks I hasarı başta olmak üzere, kompleks II, 

kompleks III ve kompleks IV hasarına neden olan mutasyonları örnek verebiliriz. 

Maternal geçişli Leigh Sendromuna ise mtDNA’da kompleks I eksikliğine neden olan 

MT-ND1, MT-ND2, MT-ND3, MT-ND4, MT-ND5 ve MT-ND6 gen mutasyonlarını 

ve kompleks V hasarına neden olan MT-ATP6 gen mutasyonunu örnek gösterebiliriz 

(54).  

Kompleks I eksikliği Leigh Sendromu olan hastalarda en sık rastlanılan 

tablodur ve vakaların 1/3’ünde görülür (52).  

 

2.3.2 Kearns-Sayre Sendromu 

Kearns-Sayre Sendromu enerji ihtiyacının oldukça yoğun olduğu dolayısıyla, 

mitokondrinin yoğun olarak bulunduğu santral sinir sistemi, retina, kalp ve iskelet 

kasında tutulumlar sergileyerek progresif eksternal oftalmopleji, pigmenter retina 

dejenerasyonu ve kardiyak iletim defektleriyle karakterize edilen bir mitokondriyal 

hastalıktır (55).  

mtDNA’da 1,000 ile 10,000 baz aralığında değişen delesyonların (56) neden 

olduğu bu Kearns-Sayre Sendromu’nda mutasyonların %90’ı somatiktir ve maternal 

kalıtım kalıbı göstermez (55). Vakaların 1/3’üde, mtDNA üzerinde bulunan COXII 

geninden ND5 genine doğru uzanan 4,977 kb’lık bir delesyonun görülür (ortak 



14 
 

delesyon) ve bu delesyon sonucunda 12 gen etkilenerek oksidatif fosforilasyon 

mekanizmasının bozulmasına dolayısıyla hücresel enerji üretiminin yetersiz kalmasına 

neden olur (55,57).  

Hastalığın tam olarak prevelansı bilinmemekle birlikte Fin popülasyonunda 

yapılan bir çalışmada prevelansın 100,000 olguda 1.6 olduğu belirlenmiştir (55). 

 

2.3.3 MERRF (Myoclonic epilepsy with ragged red fibers) 

MERRF miyoklonik epilepsi, konuşma bozukluğu (dizartri), nistagmus, optik 

atrofi ve progresif ataksi ile karakterize hastaların kas biyopsilerinde trichrome boyası 

ile düzensiz kırmızı fiberlerin gözlemlendiği (ragged red fibers) (58,59) bir sitopati 

çeşididir. 

Shoffner ve arkadaşları mtDNA’nın tRNALys geninde keşfettikleri 

m.8344.A>G mutasyonunun MERRF sendromu ile ilişkili olduğunu ve bu 

mutasyonun OXPHOS’da görev alan protein birimlerinin, özellikle kompleks I 

(NADH-CoQ redüktaz) oluşumunu olumsuz etkilediğini belirtmiştir (49). MERRF 

tanısı alan hastaların %80-90’ında görüldüğü belirtilen m.8344.A>G mutasyonu 

maternal kalıtım göstermektedir (60). Maternal kalıtım kalıbının tipik özellikleri 

arasında olan sağlıklı ve hasarlı mtDNA kopyalarının birarada olması, dağılım 

hacminin dokudan dokuya farklılık göstermesi ve bir eşik etkisinin varlığı; MERRF 

semptomlarının oldukça değişken bir klinik tablo göstermesine neden olur. Avrupa 

toplumunda prevalansının 100,000’de 0.9 olduğu düşünülmektedir (61). 

 

2.3.4 MELAS 

MELAS sendromu, ilk kez Pavlakis ve arkadaşları tarafından  1984’te 

tanımlanan; inme benzeri episodlar, laktik asidoz ve mitokondriyal miyopati ile 

karakterize progresif bir nörodejeneratif hastalıktır (62). Bir hastaya MELAS tanısı 

koyabilmek için klinikte üç önemli kriter bulunmaktadır; (1) hastada 40 yaş öncesi 

inme benzeri ataklar görülmesi, (2) nöbet atakları ya da bunamayla gelen ensefalopatk 

bulgulara rastlanılması, (3) kas biyopsisinde Gomori trichrome boyaması ile düzensiz 



15 
 

kırmızı fiberlerin görülmesi ve laktik asidozun eşlik ettiği mitokondriyal miyopatiler 

(3).  

mtDNA’dan kodlanan tRNALeu(UUR) geni MT-TL1’de meydana gelen nokta 

mutasyonlarının MELAS ile ilşkili olduğu ve MELAS hastalarının %80’inin 

m.3243A>G mutasyonu taşıdığı tespit edilmiştir (3,63). m.3243 A>G mutasyonu 

mitokondriyal translasyon mekanizmasını bozarak mitokondriyal protein sentezinin 

dolayısıyla da ETS komplekslerinin sentez mekanizmasında bozulmalara;  ETS 

kompleksleri sentezindeki azalma da mitokondriyal işlev bozuklukluğuna neden olur. 

Ayrıca nadir de olsa MT-TL1 geninde yer alan m.3256 C>T(64,65), m.3271 T>C 

(63,66,67) ve m.3291 T>C (68,69) mutasyonları da MELAS sendromuyla 

ilişkilendirilmiştir. 

mtDNA kaynaklı mutasyonların neden olduğu diğer hastalıklar gibi MELAS 

da maternal kalıtım gösteren bir sendromdur. Hastada farklı organ ve dokularda farklı 

oranda mtDNA bulunması ve eşik değer üzerinde mutant mtDNA bulunduran bu organ 

ve dokuların birbirinden farklı biyokimyasal eşik etkilerinin olması klinik tabloların 

birbirinden farklılık göstermesine neden olmaktadır. Örneğin m.3243 A>G mutasyonu 

taşıyan hastaların iskelet kas dokularında yapılan bir çalışmada, patolojik tablo için 

kasta biriken mutant mtDNA seviyesinin %50 olmasının gerekli olduğu gösterilmiştir 

(3). 

Bugün MELAS sendromunun prevalansının Japonya için  0.2:100,000 olduğu 

(70), başta MELAS olmak üzere diğer mitokondriyal hastalıklarla ilişkili m.3243 A>G 

mutasyonunun prevalansının Finlandiya için ise 16–18:100,000 olduğu bilinmektedir 

(71,72). 

 

 

 

 

 

 

 



16 
 

2.4 MT-TL1 Geni  

MT-TL1 (mitochondrially encoded tRNALeu(UUR)-1) mtDNA’nın 3230-3304 

nükleotidleri arasında bulunan, 75 baz çiftlik tRNALeu(UUR) genidir (bkz. Ek-1). 

tRNALeu(UUR) 10 bazlık DHU loop ve 7 bazlık oluşan TψC loop’a sahiptir (Şekil 2.5). 

Mitokondriyal genomda transkripsiyon terminasyonu için MTERF’ün (mitochondrial 

transcription termination factor) 13 bazlık terminasyon zincirine bağlanması 

gerekmektedir ve bu zincir MT-TL1 geni içerisinde 3237 ve 3249 nükleotidleri 

arasındadır (73). Yakubovskaya ve arkadaşları ise yaptıkları çalışmada MTERF1’in 

mtDNA’nın 3232 ve 3253. nükleotidleri arasında kalan dizisine yani tRNALeu 

terminasyon zincirinin de olduğu bölgeye bağlandığını keşfetmişlerdir (74). Bu 

bağlanmayla mtDNA’nın çözülüp 3 bazın içten dışa (flipping) dönerek bağlanmayı 

stabil hale getirmesi ve transkripsiyon terminasyonunun düzenlenmesi söz konusudur 

(74).  

mtDNA’nın etkili bir tamir mekanizması olmadığı için (Bkz. 2.1.1), mt-

tRNALeu(UUR) in de patojenik nokta mutasyonlarına açık olması kaçınılmazdır. 

tRNALeu(UUR) ‘de meydana gelen patojenik mutasyonlardan en sık görüleni m.3243 

A>G mutasyonudur (3) ve bu 

mutasyon MELAS başta olmak üzere 

bir çok mitokondriyal hastalıkla da 

ilişkilidir. MT-TL1 geninde meydana 

gelen diğer mutasyonlara ise m.3256 

C>T, m.3260 C>T, m.3271 T>C, 

m.3291 T>C ve m.3303 C>T 

mutasyonlarını örnek verebiliriz 

(Tablo 2.2). 

 

 

 

 



17 
 

Tablo 2.2 MT-TL1 geninde meydana gelen mutasyonlar ve ilişkili oldukları 

sendromlar. 
Ş 

Sendrom Mut. Referans 

MELAS / Leigh Sendromu A3243G Goto ve ark.(63) 

MELAS/MERRF C3256T Moraes ve Sato (64,65) 

MELAS T3271C Goto, Hayashi, 

Sakuta(63,66,67) 

MELAS / Miyopati / Sağırlık + 

Kognitif Bozukluk 

T3291C Goto ve ark. (68) 

Mitokondriyal Miyopati ve 

Kardiyomiyopati 

A3260G Zeviani ve Sweeney(75,76) 

Mitokondriyal Miyopati ve 

Kardiyomiyopati 

C3303T Silvestri ve ark.(77) 

 

 

MELAS hastalarının %80’inde görülen m.3243 A>G mutasyonu ilk kez Goto 

ve arkadaşları tarafından tanımlanmıştır (63,69). m.3243 A>G mutasyonunun ayrıca 

Leigh sendromu (78), MERRF ve MELAS’ın çakıştığı klinik tablolar ve annesel 

geçişli sağırlıkla seyreden diyabet tablolarında da bildirilmiştir (79). Hastaların 

periferik kan örneklerinde heterojenik olarak bildirilen m.3243 A>G mutasyonunun 

ilerleyen yaşla beraber periferik kandaki lökositlerde taşınma oranının da azaldığı 

gösterilmiştir (79). MT-TL1’in antikodonunda wobble pozisyonunda yer alan uridin, 

5-taurinometiluridine dönüştürülerek tRNA işlev kazanır. Yasukawa ve arkadaşları 

m.3243 A>G ve m.3271 T>C mutasyonlarının varlığında bu değişimin 

gerçekleşmediğini göstermiş; bu değişimin eksikliğinin lösin translasyonunda hatalara 

neden olduğunu belirtmişlerdir (80).  

m.3256 T>C mutasyonu ise ilk kez Moraes ve arkadaşları tarafından MERFF 

sendromuyla beraber gelen optik nöropati ve diyabet bulgularını gösteren bir hastanın 

kas dokusunda heteroplazmik olarak saptanmıştır (64). Hirai ve arkadaşları, sekiz 

kişilik bir ailede altı kişinin heteroplazmik olarak bu mutasyonu taşıdığını göstermiş, 

aile bireylerinden bazılarında kas atrofisinin yanında insüline bağımlı olmayan diyabet 

ve glukoz intoleransı görüldüğünü dolayısıyla bu mutasyonun glukoz metabolizmasını 

etkilediğini belirtmişlerdir (81). 



18 
 

Bir diğer MT-TL1 gen mutasyonu olan m.3260 A>G, iskelet kası miyopatisiyle 

ya da kas miyopatisi görülmeksizin seyreden kardiyomiyopatiyle ilişkilendirilmiştir 

(75). Erişkin dönem başlangıçlı olduğu tespit edilen m.3260 A>G mutasyonunun 

literatüre geçen örneğinde, konjestif kalp yetmezliği belirtileri gösteren 23 yaşındaki 

hastanın kas dokusunda %90’a ulaşan bir mutant yük olduğu tespit edilmiştir (82). 

Her 40 MELAS hastasının 3’ünde görülen patolojik MT-TL1 mutasyonu 

m.3271 T>C, Stenqvist ve arkadaşlarına göre ND6 altünitesinin sentezini engelleyerek 

ETS elemanı olan komplesk I’in aktivitesini düşürmektedir (4). Ayrıca m.3243 A>G 

mutasyonu gibi m3271 T>C mutasyonunun da lösinin hatalı translasyonuna neden 

olduğu düşünülmektdir (80). 

m.3291 T>C mutasyonu tRNALeu’nin TψC loop’unda yer alan ve MELAS 

sendromuyla ilişkilendirilen üçüncü mutasyondur (68). Literatürde MERRF ve 

MELAS sendromlarının klinik belirtilerini gösteren,  kan ve fibroblast örneğinde 

heteroplazmik, kas biyopsi örneğinde homoplazmik olarak m.3291 T>C mutasyonu 

taşıyan bir vaka da bildirilmiştir (83). 

MT-TL1 geninde meydana gelen patojenik m.3303 C>T mutasyonu ise 

kardiyomiyopatiyle ilişkilendirilmektedir (77). Silvestri ve arkadaşları mutasyonu 

tanımladıkları ilk vakada, aynı aileden letal infantil kardiyomiyopatinin görüldüğü üç 

bireyin tüm dokularında homoplazmik olarak bu mutasyonu taşıdığını göstermiştir 

(77). Aynı vakada anne tarafında akrabalık ilişkisi bulunan asemptomatik beş bireyin 

kan örneklerinde de heteroplazmik olarak bu mutasyonun varlığı gösterilmiş, üç 

akrabanın ise ilerleyen yaşlarında ani kalp yetmezliği nedeniyle hayatlarını kaybettiği 

belirtilmiştir. Bruno ve arkadaşları ise dört farklı aileden gelen sekiz hastada bu 

mutasyonu tanımlamış; kardiyomiyopatiye iskelet kası miyopatisinin de eşlik ettiği 

vakaların olduğunu belirterek mutasyonun patolojik olduğunu desteklemiştir (84).  

 

 

 

 



19 
 

2.5 Mutasyon Analiz Teknikleri 

 

2.5.1 Restriksiyon Endonükleazlar 

Restriksiyon endonükleazlar ilk kez bakteriyel savunma mekanizmalarında 

keşfedilmiş; bakterilerin kendi DNA’larını korumak adına hücre içine giren yabancı 

bakteriyofaj DNA’sını parçalara ayıran enzimler bulundurduğu gözlemlenmiştir (85). 

Aynı çalışmada bakteri içine giren yabancı DNA’yı parçalamak için kullanılan bu 

enzimlerin konak bakteri DNA’sına zarar vermediği, bakterinin DNA’sını 

metilleyerek bu enzimlerden koruduğu da bildirilmiştir (85). Restriksiyon 

endonükleazlar (RE), DNA dizisi üzerinde palindromik yapıdaki özgül kısa dizileri 

tanıyan ve bu dizilerin içinden veya dizilere yakın bölgelerden DNA’yı kesen 

enzimlerdir. 1968’de Meselson ve Yuan’ın ilk kez E.coli bakterisinden özgül 

bağlanma bölgelerine ihtiyaç duymayan bir RE’nin izolasyonu yapmış, 1970’de ise 

Smith ve Wilcox  H.influenza’dan özgül DNA dizisi tanımlayarak kesim yapan Hind 

II endonükleazını izole etmişlerdir (86,87). RE’ler; DNA metil transferaz 

aktivitelerine, alt ünite yapılarına, kesim özgüllüklerine ve kofaktör ihtiyaçlarına göre 

farklı şekillerde sınıflandırılırlar. 

Bilinen nokta mutasyonlarının doğrudan tespiti için kullanılan restriksiyon 

endonükleaz fragman analizleri, RE’lerin çift zincirli DNA’yı özgül tanıma 

bölgelerinden ya da bu bölgelere yakın noktalardan kesmesine dayanmaktadır. 

DNA’da meydana gelen mutasyonlar yeni enzim kesim bölgesi oluşturabildikleri gibi 

varolan enzim tanıma dizilerini de ortadan kaldırabilir. İncelenen mutasyonları içeren 

kesim bölgelerine sahip RE’ler ile kesilen Polimeraz Zincir Tepkimesi ürünleri jel 

elektroforezinde farklı fragmentlere ayrılarak mutasyon analizi gerçekleştirilir.  

 

2.5.2 ARMS-PZT (Amplification Refractory Mutation System) 

ARMS-PZT ya da diğer adıyla allele özgü polimeraz zincir tepkimesi, Newton 

ve arkadaşları tarafından 1989 yılında geliştirilen, bir DNA dizisinde yer alan ve 

önceden bilinen mutasyonların bu allellere özgü primerler yardımıyla hedef DNA’nın 

çoğaltılması temeline dayanmaktadır (7).  ARMS tekniği, restiriksiyon endonükleaz 

fragman analizlerinin gerektirdiği enzim kesim bölgeleri varlığına ihtiyaç 



20 
 

duymaksızın DNA zincirinde bulunan nokta mutasyonlarının veya varyasyonlarının 

doğrudan analizi için kullanılan bir polimeraz zincir tepkimesidir. 

Alelle özgü iki farklı primer tasarımına dayanan bu yöntem, mutasyon taşıyan 

nükleotidin iki zincirinde farklı allelere komplementer primerler varlığı ile hedef 

dizinin 5’ ve 3’ kollarında allele özgü iki farklı uzunlukta amplikon eldesine 

dayanmaktadır (88). Şekil 2.6’da biri nokta mutasyonu taşıyan allele özgü, diğeri 

yabanıl tipteki allele özgü iki farklı iç primer ve alele özgü olmayan iki farklı dış 

primerle gerçekleştirilen tek bir PZT gösterilmektedir. Bu tepkime sonucunda allele 

özgü olmayan uzun bir amplikon ile mutant ve yabanıl tipteki alele özgü primerlerin 

çoğalttığı daha kısa amplikonlar elde edilir.  

Şekil 2.6 ARMS-PZT’nin şematik gösterimi ve tepkime sonucunda elde edilen 

ürünlerin agaroz jel elektroforez görüntüsü (88). 

 

 Tepkimenin iyi optimize edilmesi durumunda analiz edilen örneğin mutasyon 

taşıyıp taşımadığı farklı uzunluktaki amplikonların agaroz jel elektroforez 

görüntüsünden anlaşılarak tek bir tepkimeyle mutasyon analizi yapılabilir. Eğer 

mtDNA üzerindeki bir gen hedeflendiyse mutasyon taşıyan örneğin heteroplazmik 

olması durumunda iki iç primerden de amplifikasyon alınır ve agaroz jelde üç farklı 

boyutta bant görünütüsü alınır (Şekil 2.6). 

Literatürde Leber’in herediter optik nöropati (LHON) hastalarında üç temel 

mitokondriyal mutasyonun belirlendiği (89) ve fenilketonüri hastalarında PAH 



21 
 

genlerinde meydana gelen altı farklı mutasyonun tanımlanabildiği (90) başarılı 

ARMS-PZT teknikleri bulunmaktadır. 

 

2.5.3 HRM (High Resolution Melting Analysis-Yüksek Çözünürlüklü 

Erime Analizi) 

Çift zincirli yapıda bulunan DNA molekülü, yüksek sıcaklıkta zincirleri 

arasındaki hidrojen bağlarının kırılmasıyla tek zincirli bir yapı halini alır. DNA 

moleküllerinin yarısının tek zincirli yapı halinde bulunduğu sıcaklık Tm olarak 

adlandırılan erime sıcaklığıdır. Tm sıcaklığı dizinin guanin (G) ve sitozin (C) içeriğine 

ve uzunluğuna bağlı olarak değişir. G ve C üç hidrojen bağıyla birbirine bağlandıkları 

için daha kararlı bir yapı oluşturur dolayısıyla bu yapıların sık tekrarlandığı dizilerin 

Tm sıcaklıkları, çoğunlukla adenin (A) ve timin (T) bazlarını içeren dizilerden 

yüksektir. 

Yüksek Çözünürlüklü Erime (HRM) analizi, çift zincirli DNA’nın yüksek 

sıcaklıkla denatüre olup tek zincirli yapıya dönüşmesinin (melting) floresan boyalar 

aracılığıyla gerçek zamanlı (real-time) görüntülenmesine dayanan bir yöntemdir. 

HRM’da süreç PZT ile başlar, tasarlanan özgül primerler hedef bölgeyi çoğaltırken 

floresan boyalar zincirler arasına yapışır ve ışıma verir (Şekil 2.7 A). Bu boyaların 

toksik olmaması ve PZT için bir engelleyici görevi görmemesi önemlidir. Bu amaçla 

genellikle piyasada bulunan SYTO, LC Green, EvaGreen, Chromofy gibi boyalar 

kullanılır (91). Son PZT döngüsünden sonra kademeli olarak sıcaklık artışı gerçekleşir 

ve çift zincirli amplikonlar tek zincirli yapıya dönüşürken floresanlı boyalar bu 

yapılardan çıkarak ortama yayılır ve ışımalarını kaybeder (Şekil 2.7 A). Bu süreçte 

gerçek zamanlı floroskopik ışıma ölçümü yapılır. Çift zincirli ürünün yarısının tek 

zincirli forma dönüştüğü noktada bir Tm değeri alınır ve tek bazlık değişimler, küçük 

insersiyon ve delesyonlar farklı erime profilleri gösterdikleri için farklı Tm değerlerini 

gösteren erime eğrisi grafikleri verir (Şekil 2.7 B) (92).  

 



22 
 

  

Şekil 2.7 Yüksek Çözünürlüklü Erime Analizi. A. HRM öncesi PZT basamakları. B. 

Erime eğrisi oluşturulması (93). 

 

2.5.4 Dizi Analizi 

 Hedeflenen gen bölgesinde meydana gelen mutasyonların belirlenmesi 

amacıyla kullanılan dizileme yöntemleri 1970’lerin sonunda iki farklı grup tarafından 

geliştirilmiştir. Bu yöntemlerden ilki “Sanger Dizileme” yöntemidir. Frederick Sanger 

ve arkadaşları tarafından geliştirilen bu yöntem, dizisi belirlenecek olan DNA 

parçasının yeni sentezlenecek DNA ipliğine kalıp olması ve belirli bir bazdan sonra 

bu sentezin durdurulması esasına dayanır (94). Dizileme tepkimesinde, polimeraz, 

DNA kalıbına hedefli bir primer, deoksiribonükleozit trifosfat (dNTP) karışımı ve 3’ 

ucunda hidroksil grubu (-OH) eksik olan dideoksiribonükleozit trifosfat (ddNTP) 

karışımı bulunur. Tepkime yüksek sıcaklıklarda kalıp DNA’nın çift zincirli yapısını 

kaybedip tek zincirli bir yapı halini almasıyla başlar. Daha sonra sıcaklık düşürülür 

DNA parçasına özgül primerler tek zincirli kalıp DNA’ya bağlanır ve yeni gelen 

dNTP’nin 5’ karbonu zincirin sonundaki 3’ karbonu ile birleşerek yeni DNA zincirinin 

sentezlenmesini sağlar. Ancak sentezlenen DNA’ya 3’ uçlarında hidroksil grubu eksik 

olan ddNTP’lerin katılması halinde sentez durur ve son bazı ddNTP’lerden birini 

içeren aynı kalıba ait farklı uzunlukta parçalar elde edilir.  



23 
 

Sanger dizilemenin ilk yıllarında dört farklı ddNTP için dört farklı karışım 

hazırlanmaktaydı (94). Ayrı ayrı tüplerde gerçekleştirilen tepkimeler sonucunda elde 

edilen ürünler akrilamid jelde yan yana yürütülüp, en kısa parçadan en uzuna doğru 

okuma yapılarak dizinin baz içeriği belirlenmekteydi. Ancak otomatik dizileme 

cihazlarının gelişmesiyle aynı tepkime karışımı içerisine eklenen ve farklı dalga 

boyunda floresan ışımalar veren ddNTP karışımları kullanılmaya başlanmıştır. Bu 

cihazlarda floresan ddNTP ile işaretli farklı uzunluktaki parçalar elektroforez ile 

ayrışır, her bir parçanın sonundaki dideksinükleotidin yaptığı farklı dalga boylarındaki 

ışımalar saptanır ve simüle jel görüntüsü oluşturularak en kısa parçalardan en uzunlara 

doğru okumalar yapılır. Otomatik dizileme cihazları DNA dizisinin içeriğini her bir 

bazı farklı renklerin temsil ettiği elektroferogram grafikleri oluşturarak verir. 

İkinci dizileme yöntemi ise Maxam ve Gilbert’in geliştirdikleri DNA’nın 

kimyasal olarak belirli bazlardan sonra kırılmasını esas alan yöntemdir (95). Sanger 

dizilemede olduğu gibi bu yöntemde de çift zincirli yapıdaki DNA tek zincirli hale 

getirilir, zincir 5’ ucundan radyoaktif fosfat ile işaretlenir, dört ayrı tüpte dört farklı 

kimyasal işleme uğratılarak belirli nükleotidlerin kırılması sağlanır (96). Kırılmış bu 

nükleotidlerin farklı pozisyonda yer almasından dolayı farklı uzunluklarda moleküller 

elde edilir ve elektroforezde yürütülür. Elektroforez sonucunda otoradyografi 

uygulanarak jelde en önde yürüyen kısa parçadan en arkada kalan uzun parçaya doğru 

okumalar yapılır ve baz dizisi belirlenir. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



24 
 

3.GEREÇ VE YÖNTEMLER 

 

3.1 Gereçler 

Bu tez çalışması kapsamında, Hacettepe Üniversitesi Nöroloji Anabilim 

Dalı’ndan, Hacettepe Çocuk Hastanesi bölümlerinden ve dış merkezlerden, 1995’ten 

bu yana bölümümüzün tanı laboratuvarına yönlendirilen, “Mitokondriyal Sitopati” 

öntanısı almış 219 hastanın kan ve kas doku örnekleri taranmıştır. Tez kapsamında 

yapılacak tüm çalışmalar için Hacettepe Üniversitesi Girişimsel Olmayan Klinik 

Araştırmalar Etik Kurulu onayı alınmıştır (Tarih: 13.06.2017, Karar no: GO 17/519 -

08). (Bkz. Ek-4) 

3.1.1 Polimeraz Zincir Reaksiyonu ve PZR-Temelli Mutagenez 

 GoTaq® DNA Polymeraz ve 5X GoTaq DNA Tamponu (Promega, # 

9PIM300) 

 25 mM MgCl2 solüsyonu (Promega,  A3511) 

 dNTP seti (Promega, U1330) 

 IDT firmasında sentezletilen primerler 

 PZT cihazı (GeneAmp PCR Systems 9700)  

3.1.2 Real-Time ARMS-PZT ve HRM Analizi 

 SYTO™ 9 Yeşil Floresanlı Nükleik Asit Boyası (Invitrogen™, Thermo Fisher 

S34854) 

 Real-Time PZT Cihazı (Corbett-RotorGene 6000) 

3.1.3 Klonlama ve Bakteri Kültürü 

 pGEM-T Easy Vektörü (Promega, A1360) 

 T4 DNA Ligase (Promega, M1801) 

 T4 Ligasyon Tamponu (Promega, C126A) 

 EcoRI (Promega, R601A) 

 10X H Tampon (Promega, R008A) 

 Kompetan JM109 bakteri suşu (Promega, P9751) 

 Agar, bakteriyoloji kullanımı saflığında (AppliChem, A0949) 

 Sıvı Luria-Bertani (LB) Besiyeri (pH: 7,0) 



25 
 

 Maya özütü (AppliChem, A1552) (5 gr),  

 NaCl (5 gr) 

 Tripton (SRL, 32007)  (10 gr) 

Karışım, pH’ı NaOH ile 7’ye ayarlanıp distile suyla 1 lt’ye 

tamamlanarak otoklavlandıktan sonra kullanılmıştır 

 Katı LB besiyeri (%1,5 agar içeren sıvı LB besiyeri) 

 X-Gal (5-bromo-4-kloro-3-indoil β-D-galaktozoid) stok çözeltisi 

(dimetilsülfoksit içinde %5’lik çözelti) 

 IPTG (İzopropil-β-D-1-tiyogalaktopiranozoid) stok çözeltisi (su içinde 0,1 M) 

3.1.4 Plazmid İzolasyonu 

 The QIAprep® Spin Miniprep Kit (QIAGEN, 27104) 

3.1.5 DNA Dizi Analizi 

 BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, 

4336917) 

 %70 ve %95 oranlarında hazırlanmış soğuk etanol 

 3 M Sodyum asetat çözeltisi  

 Formamid 

 DNA dizi analizi cihazı (ABI 3130) 

3.1.6 DNA İzolasyonu 

 Taze ıspanak 

 Proteinaz K (Sigma, P2308) 

 STE Tamponu  

 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA içermektedir. 

 SDS (Sigma, L3771) 

 β-merkaptoetanol (Sigma, 516732) 

 Phenol 

 Kloroform (Carlo Erba) 

 Isoamyl alkol (Carlo Erba) 

 Isopropanol (MERCK) 

 Etanol (Sigma) 



26 
 

3.1.7 DNA Agaroz Jel Elektroforezi 

 Agaroz Biomax (Prona, HS-8000) 

 Yürütme tamponu - TAE Tamponu (Tris-Asetat-EDTA) pH: 8.0 

 Glasiyal asetik asit (Merck)  (1,14 mL) 

 Na2EDTA (Merck) (0,5 M) 

 Trisbaz (Merck) (2 M) 

Hazırlanan karışım 50X yoğunluğunda olup 50 kat seyreltilerek kullanılır. 

 Yükleme tamponu – Orange G 

 Gliserol (Merck)     5,5 mL 

 1X TAE Tamponu  4,5 mL 

 Orange G boyası (Merck)  0,01 gr 

 Etidyum Bromür (Sigma) (10 mg/ml) 

 Moleküler ağırlık belirleyicisi 100 bp DNA Ladder (Jena Bioscience, M-214S) 

 Agaroz jel görüntüleme sistemi (Biometra) 

3.1.8 Agaroz Jelden DNA İzolasyonu ve Kantitasyonu 

 Wizard SV Gel and Clean-Up System Kiti (Promega, A9282) 

 UV illuminator 

 Spektrofotometre (The NanoDrop 1000) 

 

3.2 Yöntemler 

3.2.1 ARMS Primer Tasarımı 

 ARMS-PCR primerleri, insan mitokondriyal genomu (NC_012920.1) referans 

alınarak tasarlanmıştır. Bu dizinin 75 bazlık MT-TL1 gen bölgesi ortada 

kalacak şekilde, öncesinde bulunan 229 bazlık bir alan ve gen dizisinin hemen 

ardından gelen 296 bazlık alanı da kapsayan toplam 600 bazlık bir bölge 

hedeflenilmiştir (Ek-2). 

 Primerler web temelli “PRIMER1: primer design for tetra-primer ARMS-

PCR” (http://primer1.soton.ac.uk/primer1.html) aracı kullanılarak 

tasarlanmıştır (Tablo 3.1) (97). 

 

http://primer1.soton.ac.uk/primer1.html


27 
 

Tablo 3.1. ARMS-PCR Primerleri. 

 

 

3.2.2 PZT Temelli Mutagenez 

 

ARMS-PZT taramalarında kullanılacak pozitif kontroller için megaprimer 

mutagenez yaklaşımı benimsenmiştir. İlk defa 1989 yılında Kammann ve 

arkadaşlarının geliştirdiği bu hedefli mutagenez yaklaşımı iki PCR aşamasından 

oluşur. İlk aşamada hedeflenen bölge, mutasyona özgü tasarlanan bir mutajenik primer 

ve komşu bir reverse primer ile amplifiye edilerek mutasyon taşıyan kısa bir amplikon 

elde edilir. İkinci aşamada ise mutasyon taşıyan bu amplikon, primer (megaprimer) 

olarak uzak bir forward primeriyle kullanılır, sonuç olarak istenilen mutasyonu taşıyan 

amplikon elde edilir  (Şekil 3.1) (98-100).  

Primer Adı Primer Dizisi Tm °C 

Ortak Dış Forward 1 5'-CTCAACTTAGTATTATACCCACACCCAC-3' 61,4 

Ortak Dış Forward 2 5'-CGATTAAAGTCCTACGTGATCTGAGTTC-3' 61,4 

Ortak Dış Reverse 1 5'-TTTAGGGGCTCTTTGGTGAAGAGTTTTA-3' 60,6 

Ortak Dış Reverse 2 5'-GTAAGCATTAGGAATGCCATTGCGATTA-3' 61,9 

m.3243 A>G Forward 5'-AGAACAGGGTTTGTTAAGATGGCCGA-3' 63,9 

m.3243 A>G Reverse 5'-AAGTTTTAAGTTTTATGCGATTACCGGTCC-3' 60,5 

m.3256 C>T Forward 5'-TTAAGATGGCAGAGCCCGGTAATAGT-3' 63,9 

m.3256 C>T Reverse 5'-ACCTCTGACTGTAAAGTTTTAAGTTTTCTG-3' 58,2 

m.3271 T>C Forward 5'-CCCGGTAATCGCATAAAACTTAAACCT-3' 60,4 

m.3271 T>C Reverse 5'-GAAGAGGAATTGAACCTCTGACTGTCAG-3' 63 

m.3291 T>C Forward 5'-ACTTAAAACTTTACAGTCAGAGGTTCACTC-3' 60,2 

m.3291 T>C Reverse 5'-CCATGGGTATGTTGTTAAGAAGATGA-3' 59 

m.3260 A>G Forward 5'-TAAGATGGCAGAGCCCGGTAATCGCAGAA-3' 69,6 

m.3260 A>G Reverse 5'-TTGAACCTCTGACTGTAAAGTTTTAAGGTC-3' 59,9 

m.3303 C>T Forward 5'-CAGTCAGAGGTTCAATTCCTCTTCTTCAC-3' 62,9 

m.3303 C>T Reverse 5'-AGTAGGAGGTTGGCCATGGGTATGGTA-3' 67,9 

m.3260 A>G Forward B 5'-GCAGAGCCCGGTAATCGCAGAA-3' 61,8 

m.3260 A>G Reverse B 5'-TAAGTTTTATGCGATTACCGGTCC-3' 55,1 

m.3271 T>C Forward B 5'-AGCCCGGTAATCGCATAAAACTTAAACCT-3' 60.2 

m.3271 T>C Reverse B 5'-GAAGAGGAATTGAACCTCTGACTGTCAG-3' 58.6 



28 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 3.1. Megaprimer methoduyla mutagenez yaklaşımı. 

 

Bu çalışmada da 6 farklı MT-TL1 nokta mutasyonu için 6 farklı mutajenik primer 

tasarlanarak megaprimer metoduyla mutagenez gerçekleştirilmiştir. 

 

a) Mutajenik Primerlerin Tasarımı 

MT-TL1 geninde hedeflenen 6 nokta mutasyonu için 6 farklı mutajenik primer 

Tm dereceleri outer primerlere yakın olacak şekilde Tablo 3.2’deki gibi tasarlanmıştır. 

Tablo 3.2 Mutasyona özgü mutajenik primerler. 

Mutasyon Primer Dizisi 
m.3243A>G 5'-ggcagGgcccggtaatcgcata-3' 

m.3256C>T 5'-cgTataaaacttaaaactttac-3' 

m.3260A>G 5'-aGaacttaaaactttacagtca-3' 

m.3271T>C 5'-aaaacCttacagtcagaggttc-3' 

m.3291T>C 5'-caatCcctcttcttaacaacat-3' 

m.3303C>T 5'-aaTaacatacccatggccaacc-3' 

 

 



29 
 

b) Mega-primer üretimi 

 Şekil 3.1’de 1.PZT basamağı olarak belirtilen mega-primer üretimi aşağıdaki 

koşullarda gerçekleştirilmiştir: 

 

 Yukarıdaki şartlarda gerçekleştirilen reaksiyon sonucunda PZT ürünlerinin, 

yani mega-primerlerin agaroz jel elektroforez yöntemiyle kontrolü yapılmıştır. 

 Ürünlerin tamamı %0.8’lik agaroz jele yüklenerek Wizard SV Gel and Clean-

Up System kitiyle agaroz jelden pürifiye edilmiş, NanoDrop 1000 kullanılarak, 

saflık ve miktar tayini yapılmıştır. 

 

c) Mega-primerlerle PCR 

 

 Mega-primerler için yaklaşık 3000 baz çifti uzunluğunda bir kalıp DNA 

kullanılmıştır. Bu kalıp mtSeq02F ve mtSeq03R primerleriyle sağlıklı bir 

bireye (mitokondriyal herhangi bir rahatsızlığı olmayan) ait olan genomik 

DNA’nın çoğaltılması sonucunda elde edilmiştir. 

 

Tablo 3.3. Kalıp DNA için kullanılan primer çiftleri. 

 

mtSeq02F ACCTTAGCCAAACCATTTACCC      1713-1734 bç 

mtSeq03R TGATGAGTGTGCCTGCAAAGAT      4527-4506 bç 

  



30 
 

 

 3.2.2.2’de saflaştırılarak elde edilen mega-primerler’in konsantrasyonları 

temel alınarak molarite hesaplamaları yapılmıştır. Bu hesaplamalar sonucunda 

aşağıdaki şartlarda ikinci PZT kurulmuştur:  

 

 Wizard SV Gel and Clean-Up System kiti kullanılarak ikinci PZT ürünleri yani 

mutasyon taşıyan amplikon ürünleri saflaştırılmış ve miktar-saflık tayini için 

The NanoDrop spektrofotometrik ölçüm cihazı kullanılmıştır. 

 

 

 Mutagenezin başarısından emin olmak ve mutasyonların doğrulamasını 

yapmak için Sanger dizilemeye gidilmiştir. Sanger dizileme için PZT şartları 

aşağıdaki gibidir: 

 

 Dizileme tepkimesi sonrası sekans pürifikasyonu aşağıdaki basamaklar takip 

edilerek gerçekleştirilmiştir: 



31 
 

1. PZT ürünlerinin üzerine 1/10 oranında NaOAc (2 μl) eklenmiş, hafif 

vortexlenen ürünler yeni eppendorfa alınıp üzerine 2,5 volume denk gelecek 

şekilde soğuk %95’lik etanol eklenmiştir (60 μl). 

2. Örneklerin -80 oC’de 45 dakika bekletilerek presipitasyonu sağlanmıştır. 

3. 18,000 x g’de 30 dakika santrifüj edilen örneklerin çökmesi sağlanarak 

üzerlerindeki etanol uzaklaştırılmıştır. 

4. %70’lik etanolle bir yıkama adımı daha gerçekleştirilmiş ve örnekler 18,000 

x g’de 30 dakika daha santrifüje edilmiştir. 

5. Son santrifüjden sonra örneklerin üzerindeki tüm etanolün uçması için 

örnekler 37 oC’lik fırında 10-15 dakika bekletilmiştir. 

6. Etanolün tamamen uzaklaştığından emin olduktan sonra örneklerin üzerine 

20 μl formamid eklenmiş, çözüldüklerinden emin olduktan sonra da sekans 

platelerine yüklenmişlerdir. 

 

d) pGEM-T Easy Vektöre PCR ürünlerinin Takılması 

 Sanger dizilemeyle mutasyonları doğrulanan mutant amplikonlar, aşağıdaki 

ligasyon reaksiyonuyla pGEM-T Easy vektöre (Şekil 3.2) takılarak sonraki 

çalışmalar için stoklanmıştır. 

 

T4 Ligasyon Tamponu                                 2X 

pGEM-T Easy Vektör                                  50 ng 

PZT Ürünleri (mutant amplikonlar)             15 ng 

T4 Ligaz                                                        3u 

Toplam Hacim                                              10 μl 

  Oda sıcaklığında 4 saatlik inkübasyona bırakılmıştır. 



32 
 

 

Şekil 3.2 pGEM-T Easy vektörünün haritası. 

 

e) Transformasyon 

1. 1,5 μl ligasyon ürünü, 50 μl’lik JM109 kompetan hücrelerinin üzerine yavaşça 

bırakılarak 30 dakika buz üstünde bekletilmiştir. 

2. Ligasyon ürünleriyle aynı tüplerin içerisinde bulunan bakteriler 42 °C’lik sıcak su 

banyosunda 2 dakika kadar bekletilip tekrar buz üstüne alınarak heat-shock’a 

uğratılmıştır. 

3. Bakteriler 8 dakika kadar buz üstünde bekletildikten sonra 900 μl LB medium 

içerisine alınarak 37 °C’de 1 saat, 250 rpm’de çalkalanmaya bırakılmıştır. 

4. 1 saatin sonunda bakteriler 6,500 x g’de santifüjlenip çöktürülmüştür. 

5. 100 mM IPTG ve 50 mg X-Gal içeren platelere boncuklar yardımıyla yayılan 

bakteriler ertesi sabah Mavi-Beyaz koloni seleksiyonu yapılmak üzere 37 oC’lik 

inkübatörde tüm gece bekletilmiştir. 

Mavi-beyaz koloni seçiminde PZT ürünlerini içine alan bakterilerin beyaz 

koloniler şeklinde gözükürken, boş vektörlere sahip bakterilerin mavi koloniler 

şeklinde görüneceği bilgisinden yola çıkarak beyaz kolonilerin mutant ürünler 

taşıdığı söylenebilir. 



33 
 

6. Ertesi sabah platelerden beyaz kolonilerin seçilmiş, bu koloniler 2 μl carbenisilin 

içeren 900 μl LB besiyerlere ekilip 37 C’de 250 rpm’de 6-7 saatlik bir inkübasyona 

bırakılmıştır. 

f) Transformasyon Ürünlerinin Saflaştırılması ve Kalite kontrolü  

İnkübasyon sonunda QIAprep Spin Miniprep Kiti kullanılarak plazmidler izole 

edilmiştir. İzole edilen plazmidlerin  EcoRI enzim kesimi ile kontrolü yapılmıştır. 

EcoRI Şekil 3.2’de görüldüğü gibi, iki farklı kesim bölgesi olan ve vektörle içerisine 

aldığı PZT ürününü rahatlıkla ayıran birbirinden ayıran bir enzimdir. Enzim kesim 

tepkimesi aşağıdaki gibi hazırlanmış ve kesim sonrasında ürünler %2’lik agaroz jelde 

yürütülerek kontrol edilmiştir. 

EcoRI Enzim Kesim Tepkimesi 

10X Enzim KesimTamponu      2 μl 

EcoRI Enzimi                           0,5 μl 

Vektör                                       150 ng 

dH2O                                         20 μl’ye tamamlanmıştır. 

  

 

3.2.3 Farklı Heteroplazmi Oranlar İçeren Pozitif Kontrollerin 

Hazırlanması 

 

Mitokondri genetiğinin kendine özgü doğasını laboratuvar şartlarında taklit 

edebilmek için PZT temelli mutagenezle oluşturulan sentetik mutantlardan %0-%100’ 

kadar farklı heteroplazmi seviyeleri içeren 5 farklı içerik hazırlanmıştır. Bunun için 

insan MT-TL1 genine özgü tasarlanan primerler tarafından çoğaltılamayan bir 

“arkaplan”  DNA’sına ihtiyaç duyulmuştur. Yapılan karşılaştırılmalar sonucunda, 

ıspanak mitokondriyal genomunun tRNA-leu geninin (GenBank: KY768855.1) (101) 

insanınken farklılık gösterdiği NCBI Nucleotid BLAST programı kullanılarak tespit 

edilmiştir.  

 

Tüm gece 37 oC’de bekletilmiştir. 



34 
 

a) Ispanaktan DNA izolasyonu 

1. Taze ıspanak yaprakları kıvamlı bir sıvı hale gelene kadar STE tamponu ve %10’luk 

SDS ile havanda ezilip eppendorf tüplere aktarılmıştır. 

2. Ezilmiş ıspanaklar 20 μl Proteinaz K, 200 μL β-merkaptoetanol eklenerek tüm gece 

56 oC’de kalacak şekilde karıştırıcıya yerleştirilmiştir. 

3. Ispanaklara ertesi sabah, 400 μl olacak şekilede 25:24:1 oranında Fenol- kloroform-

izoamyl alkol karışımı eklenmiş ve örnekler 13,000 rpm’de 15 dakika 

santrifüjlenmiştir. 

4. Santrifüj sonunda debristen kurtulmak için üst faz yeni bir eppendorfa alınarak aynı 

işlem tekrarlanmıştır. 

5. Üst faz tekrar yeni bir eppendorfa alınarak üzerine 300 μl kloroform:isoamyl alkol 

(24:1) eklenerek 5 dakika 13,000 rpm’de santrifüjlendi. Bu işlem bir kere daha 

tekrarlanmıştır. 

6. Son santrifüjden sonra üst faz yine temiz bir eppendorfa aktarılarak toplam hacmin 

1/10’u kadar NaOAc eklendi ve yine total hacim kadar izopropanol eklenerek örnekler 

-20 C’ye bırakılmıştır. 

7. Örnekler 13,000 rpm’de 15 dakika santrifüjlendi ve izopropanol uzaklaştırılmıştır. 

8. Tüpün dibinde çökmüş olarak bulunan pellet etanolle yıkama aşamalarından sonra 

30 μl suda çözülerek saflık ve miktar tayini yapılmıştır. 

Ispanak DNA’sı elde edildikten sonra in silico analizleri doğrulamak adına 

m.3243 A>G mutasyonuna özgü iç primerler ve ortak dış primerlerle bir PZT daha 

hazırlanmıştır. Tepkime sonunda tasarlanan primerlerin ıspanağa özgül olmadığı 

belirlenmiştir (Şekil 3.3). 

 

Şekil 3.3 Ispanak mtDNA’sı ve insan 

mtDNA’sıyla yapılan 

m.3243 A>G mutasyonu 

analizi. 

 

 



35 
 

b) Hesaplamalar 

Diploid bir insan hücresinin 6,5 pg DNA içeriğine sahip olduğu bilinmektedir 

(102). Miller ve arkadaşlarının çeşitli yaş grupları kullanarak yaptığı iskelet ve kalp 

kasında mtDNA kopya sayısını belirleme çalışmaları temel alınarak, bir iskelet kası 

hücresinde ortalama 3000 mtDNA kopyası olduğu varsayılmıştır (37). 6,5 pg toplam 

DNA içeriğinde 3000 kopya mtDNA vardır, dolayısıyla bir PZT’ine koyulan ortalama 

200 ng’lık hasta örneğinde mtDNA kopya sayısının 108 civarında olması 

beklenmektedir. 1 ng T-Easy vektör 5,64 x 108 kopya içermektedir. Dolayısıyla mutant 

mtDNA fragmanı içeren T-Easy vektörün 1 ng’ı 5,64 x 108 mutant mtDNA kopyası 

içermektedir. PZT’sine her bir sentetik kontrolden 1 ng konulması halinde reaksiyon 

içinde insan örneklerinin 200 ng DNA’sına karşılık gelecek mtDNA kopya sayısı 

sağlanmış olur.  

Sonuç olarak pozitif kontrollerimizin her biri 1 ng vektör ve arka planda 100 

ng ıspanak DNA’sı içerecek şekilde hazırlanmıştır (Şekil 3.4). 

 

Şekil 3.4 Farklı oranlarda heteroplazmi içeren sentetik pozitif kontrol karışım 

kalıplarının hazırlanması. 

 

3.4 Yüksek Çözünürlüklü Erime Eğrisi Analizi Koşulları 

ARMS-PZT ürünlerinin analizi için kullanılan yüksek çözünürlüklü erime 

eğrisi analizi, Corbett-RotorGene 6000 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. ARMS-

PZT’sinin son döngüsünden sonra ürünlerin bulunduğu sıcaklık 75 °C’den 90 °C’ye 

her 2 saniyede 0.1 °C artacak şekilde çıkartılmış ve analiz gerçekleştirilmiştir.  

 



36 
 

3.5 MT-TL1 Geni Mutasyon Taramaları için ARMS-PCR Koşulları 

3.5.1 m.3243A>G Mutasyonu Optimizasyonu 

m.3243 A>G mutasyonu primerleriyle yapılan optimizasyon çalışmalarında 

farklı oranlarda heteroplazmi içeren sentetik kontroller, heteroplazmik m.3243 A>G 

mutasyonu taşıyan MELAS hastası ve bu mutasyona sahip olmayan bir kontrol örneği 

kullanılmıştır. Klasik PZT cihazlarında gerçekleştirilen döngülerde 72 °C’deki uzama 

süresinin özgül olmayan primer bağlanmalarına neden olduğunu göstermiştir (Şekil 

3.5). Bu nedenle Corbett-RotorGene 6000 ile yapılan gerçek zamanlı PZT’si iki 

basamaklı planlanmış, uzama süresi 5 sn ile sınırlandırılmıştır (Tablo 3.4). Tepkime 

sonuçlarının agaroz jel elektroforez sonuçları Şekil 3.6’da gösterilmiştir. 

 

 

 

 

 

 

Şekil 3.5 ARMS-PZT m.3243 A>G mutasyonu optimizasyon öncesi agaroz jel 

görüntüsü (%2’lik jel). 

 

Tablo 3.4 ARMS-PZT m.3243 A>G mutasyonu şartları. 

Malzemeler  Konsantrasyon   

Klasik PZT x30 döngü 

94 
o
C – 2 dk 

94 
o
C – 15 sn 

60 
o
C – 15 sn      

72 
o
C – 20 sn 

72 
o
C – 2 dk 

 

  Real-time  x40 döngü 

94 
o
C – 1 sn        

60 
o
C – 5 sn 

  

GoTaq Polimeraz Tamponu 1X 

MgCl2 3,5 mM 

dNTP mix 0,5 mM 

Dış Forward 2 Primeri 0,4 µM 

Dış Reverse 1 Primeri 0,4 µM 

İç Forward Primeri 0,4 µM 

İç Reverse Primeri 0,4 µM 

SYTO9 1,5µM 

DNA 200 ng 

GoTaq Polimeraz (5u/µL) 0,5u 

Toplam Hacim 20 µL 



37 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 3.6 ARMS-PZT m.3243 A>G mutasyonu agaroz jel görüntüsü (%2’lik jel). 

 

3.5.2 m.3256C>T Mutasyonu Optimizasyonu 

 m.3256 C>T mutasyonu taramaları için yapılan optimizasyon çalışmalarında 

tıpkı m.3243 A>G mutasyonunda olduğu gibi döngünün uzama süresinin kısaltılması 

prensibi izlenmiştir. Ancak primerler hedef diziye özgül olmayan bağlanmalar yaparak 

özgül olmayan amplikonlar vermeye devam etmiştir. Optimize edilmiş tepkime 

sonucunda oluşan ürünlerin agaroz jel elektroforez görüntüsü Şekil 3.7’de, optimize 

edilmiş tepkime koşulları Tablo 3.5’te gösterilmiştir. 

 

Şekil 3.7 ARMS-PZT  m.3256 C>T mutasyonu agaroz jel görüntüsü (%2,8’lik jel). 

 

 



38 
 

Tablo 3.5 ARMS-PZT m.3256 C>T mutasyonu şartları. 

Malzemeler  Konsantrasyon   

Klasik PZT x30 döngü 

94 
o
C – 2 dk 

94 
o
C – 15 sn 

60 
o
C – 15 sn      

72 
o
C – 20 sn 

72 
o
C – 2 dk 

 

  Real-time   x40 döngü 

94 
o
C – 1 sn        

60 
o
C – 5 sn 

  

GoTaq Polimeraz Tamponu 1X 

MgCl2 3,5 mM 

dNTP mix 0,5 mM 

Dış Forward 2 Primeri 0,4 µM 

Dış Reverse 1 Primeri 0,4 µM 

İç Forward Primeri 0,4 µM 

İç Reverse Primeri 0,4 µM 

SYTO9 1,5µM 

DNA 200 ng 

GoTaq Polimeraz   (5u/µL) 0,5u 

Toplam Hacim 20 µL 

 

3.5.3 m.3260A>G Mutasyon Optimizasyonu 

 m.3260 A>G mutasyonu taramaları için tasarlanan ilk forward primer (A alleli 

için) ve reverse primer (G alleli için) çiftinin Tm’leri sırasıyla 59,9 °C ve 69,5 °C’dir. 

Bu primer çifti ile yapılan optimizasyon çalışmalarında aşağıdaki tepkime koşullar 

denenmiştir: 

a) Bağlanma sıcaklığının 60 °C olduğu 30 döngülük; iç ve dış primerlerin eşit 

konsantrasyonda (0,4 μM) olduğu tepkimeler gerçekleştirilmiştir. 

b) Bağlanma sıcaklığının 60 °C olduğu 30 döngülük; dış primer çiftlerinin 

farklı kombinasyonlarıyla gerçekleştirilen tepkimeler (Ortak dış forward 2 ve ortak dış 

reverse 1 çifti; ortak dış forward 2 ve ortak dış reverse 2 çiftiyle) gerçekleştirilmiştir 

(Şekil 3.8).  

c) Bağlanma sıcaklığının 63-65-67 °C olduğu 35 döngülük, iç primer 

konsantrasyonunun (0,8 μM) dış primer konsantrasyonunun (0,4 μM) iki kat daha fazla 

olduğu tepkimeler gerçekleştirilmiştir (Şekil 3.9) 

 

 



39 
 

 

 

 

 

 

 

Şekil 3.8 ARMS-PZT m.3260 A>G mutasyonunun farklı dış primerlerin 

kombinasyonlarıyla yapılan optimizasyon çalışmaları (%2,5’lik jel). 

 

 

Şekil 3.9 ARMS-PZT m.3260 A>G mutasyonunun üç farklı sıcaklıkta gerçekleştirilen 

optimizasyon tepkimesi (%2,5’lik jel). 

 

Tasarlanan ilk primerlerin Tm sıcaklıklarının birbirinden oldukça farklı olması 

nedeniyle yukarıdaki koşullarda optimizasyonu sağlanamayan tepkime için yeni bir 

primer çifti tasarlanmıştır. Tasarımda Tm sıcaklıklarının dengelenmesi esas alınmıştır. 

A alleli için Tm’i 61,8 °C olan FinAb (5'-GCAGAGCCCGGTAATCGCAGAA-3') ve 

G alleli için Tm’i 55,1 °C olan  RinGb (5'-TAAGTTTTATGCGATTACCGGTCC-3) 

primerleri tasarlanmıştır. Tasarlanan yeni primerlerle tepkime optimizasyon 

çalışmalarına aşağıdaki koşullarla devam edilmiştir: 



40 
 

1) Bağlanma sıcaklığı 56 °C olduğu 30 döngülük; yeni tasarlanan iç primerler 

konsantrasyonun (0,8 μM) dış primer konsantrasyonunun (0,4 μM) iki kat daha fazla 

olduğu tepkimeler gerçekleştirilmiştir. 

2) Bağlanma sıcaklığının 57 °C olduğu 35 döngülük; yeni tasarlanan iç 

primerlerle eski iç primerlerin farklı kombinasyonlarıyla tepkimeler hazırlanmıştır. 

Sonuç olarak yeni tasarlanan FinAb (Tm: 61,8 °C) ve eski iç reverse primer  

(Tm: 59,9°C) çifti ile ortak dış forward 2 ve ortak dış reverse 2 primer çifti kullanılarak, 

57 °C’de 5 saniyelik bağlanma basamağının olduğu iki adımlık real-time PZT ile 

optimizasyon sağlanmıştır (Tablo 3.6). Şekil 3.10’da bu tepkime sonucunda elde 

edilen ürünlerin agaroz jel elektroforezde ayrışma düzeni bulunmaktadır. 

Tablo 3.6 ARMS-PZT m.3260 A>G mutasyonu şartları. 

 

 

 

 

 

 

 

Malzemeler  Konsantrasyon   

Klasik PZT   x30 döngü 

94 
o
C – 2 dk 

94 
o
C – 10 sn 

57 
o
C – 10 sn 

72 
o
C – 15 sn 

72 
o
C – 2 dk 

 

Real-time    x35 döngü 

94 
o
C – 1 sn 

57 
o
C – 5 sn 

  

GoTaq Polimeraz Tamponu 1X 

MgCl2 3,5 mM 

dNTP mix 0,5 mM 

Dış Forward 2 Primeri 0,4 µM 

Dış Reverse 2 Primeri 0,4 µM 

İç Forward Primeri 0,8 µM 

İç Reverse Primeri 0,8 µM 

SYTO9 1,5 µM 

DNA 200 ng 

GoTaq Polimeraz (5u/µL) 0,5u 

Toplam Hacim 20 µL 



41 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 3.10 ARMS-PZT  m.3260 A>G mutasyonu agaroz jel görüntüsü (%2,5’lik jel). 

 

3.5.4 m.3271T>C Mutasyon Optimizasyonu 

 m.3271 T>C mutasyonu tarama tepkimeleri için yapılan optimizasyon 

çalışmalarında aşağıdaki koşullar denenmiştir: 

a) Bağlanma sıcaklığı 55-69 °C arasında değişen 40 döngülük; dört ortak dış 

primerin, iki iç primerle farklı kombinasyonlarıyla tepkimeler hazırlanmıştır. 

b) Bağlanma sıcaklığ 60 °C olan 40 döngülük; ortak forward 1 ve ortak reverse 

1 primerlerinin kullanıldığı, iç primerlerin dış primerlerden iki kat ve beş kat daha 

fazla konsantrasyonda olduğu tepkimelerle hazırlanmıştır. 

c) İç primerlerin arasında bir rekabet olup olmadığını belirleyebilmek için 

bağlanma sıcaklığının 60 °C olduğu bir tepkime tasarlanmış ve aynı tepkimenin 25. 

döngüsü ile 35. döngüsünden alınan örnekler agaroz jel elektroforez ile kontrol 

edilmiştir (Şekil 3.11) 

Şekil 3.11 m.3271 T>C mutasyonu için tasarlanan primerler arası rekabetin kontrolü. 



42 
 

Optimizasyonu oturmayan bu protokol için yeni iç primer tasarımına 

gidilmiştir. T alleli için Tm’i 60,2 °C olan FinTb (5'-

AGCCCGGTAATCGCATAAAACTTAAACCT-3') ve C alleli için Tm’i 58.6 °C olan  

RinCb (5'-GAAGAGGAATTGAACCTCTGACTGTCAG-3') primerleri 

tasarlanmıştır. Bu yeni primer için de aşağıdaki koşullar denenmiştir: 

1)Bağlanma sıcaklığı 60 °C olan 35 döngülük; ortak dış primerlerle aynı 

konstarasyonda (0,4 μM) yeni iç primerlerin olduğu tepkimeler hazırlanmıştır. 

2)Bağlanma sıcaklığı 60 °C olan 35 döngülük; ortak dış primerlerin 

konsantrasyonunun (0,4 μM), yeni iç primerlerin konsantrasyonundan (0,8 μM) daha 

düşük olduğu tepkimeler hazırlanmıştır. 

Sonuç olarak tepkime optimizasyonu Tablo 3.7’de belirtilen şartlarla optimize 

edilerek agaroz jel elektroforezde kontrol edilmiştir (Şekil 3.12). 

Tablo 3.7 ARMS-PZT m.3271 T>C mutasyonu şartları. 

Malzemeler  Konsantrasyon  

Klasik PZT x30 döngü 

94 
o
C – 2 dk 

94 
o
C – 10 sn 

60 
o
C – 10 sn      

72 
o
C – 15 sn 

72 
o
C – 2 dk 

 

 

Real-time       x35 döngü 

94 
o
C – 1 sn 

60 
o
C – 5 sn 

GoTaq Polimeraz Tamponu 1X 

MgCl2 3,5 mM 

dNTP mix 0,5 mM 

Dış Forward 1 Primeri 0,4 µM 

Dış Reverse 1 Primeri 0,4 µM 

İç Forward Primeri 0,8 µM 

İç Reverse Primeri 0,8 µM 

SYTO9 1,5 µM 

DNA 200 ng 

GoTaq Polimeraz 0,5u 

dH
2
O 20 µL 

 

 

 

 

 

 



43 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 3.12 ARMS-PZT m.3271 T>C mutasyonu agaroz jel görüntüsü (%2,5’lik jel). 

 

3.5.5 m.3291 T>C Mutasyon Optimizasyonu 

 m.3291 T>C mutasyonu tarama tepkimeleri için optimizasyon sürecinde 

MgCl2 titrasyonu yapılmıştır (2,5 - 3,5 μM arası konsantrasyonlarda). Üç farklı 

bağlanma sıcaklığının (58-60-62 °C) denendiği tepkimelerde (Şekil 3.13), iç primer 

konsantrasyonları da değiştirilmiştir. Tepkime şartları Tablo 3.8’de belirtildiği gibi 

optimize edilmiş ve agaroz jel elektroforez sonucunda sentetik kontroller arasında 

Şekil 3.14’te görülen ayrışma sağlanmıştır. 

 

Şekil 3.13 m.3291 T>C mutasyonu farklı bağlanma sıcaklıklarında optimizasyon 

denemeleri (%2.5’lik jel). 

 

 



44 
 

Tablo 3.8 ARMS-PZT m.3291 T>C mutasyonu şartları. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 3.14 ARMS-PZT m.3291 T>C mutasyonu agaroz jel görüntüsü (%2,5’lik jel). 

 

3.5.6 m.3303 C>T Mutasyon Optimizasyonu 

 m.3303 C>T mutasyonu için optimal koşullar Tablo 3.9’da gösterilmiş olup, 

PZT ürünlerinin %2’lik agaroz jel elektroforez görüntüsü Şekil 3.15’te verilmiştir. 

 

 

Malzemeler  Konsantrasyon  

Klasik PZT   x30 döngü 

94 
o
C – 2 dk 

94 
o
C – 10 sn 

57 
o
C – 10 sn  

72 
o
C – 15 sn 

72 
o
C – 2 dk 

 

Real-time   x35 döngü 

94 
o
C – 1 sn 

60 
o
C – 5 sn 

  

GoTaq Polimeraz Tamponu 1X 

MgCl2 3,5 mM 

dNTP mix 0,5 mM 

Dış Forward 2 Primeri 0,4 µM 

Dış Reverse 1 Primeri 0,4 µM 

İç Forward Primeri 0,4 µM 

İç Reverse Primeri 0,8 µM 

SYTO9 1,5µM 

DNA 200 ng 

GoTaq Polimeraz 0,5u 

dH
2
O 20 µL 



45 
 

Tablo 3.9 ARMS-PZT m.3303 C>T mutasyonu şartları. 

Malzemeler  Konsantrasyon  

Klasik PZT x30 döngü 

94 
o
C – 2 dk 

94 
o
C – 10 sn 

60 
o
C – 10 sn      

72 
o
C – 15 sn 

72 
o
C – 2 dk 

  

Real-time    x35 döngü 

94 
o
C – 1 sn        

60 
o
C – 5 sn 

  

GoTaq Polimeraz Tamponu 1X 

MgCl2 2,5 mM 

dNTP 0,5 mM 

Dış Forward 2 Primeri 0,4 µM 

Dış Reverse 1 Primeri 0,4 µM 

İç Forward Primeri 0,4 µM 

İç Reverse Primeri 0,4 µM 

SYTO9 1,5 µM 

DNA 200 ng 

GoTaq Polimeraz 0,5 u 

dH
2
O 20 µL 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 3.15 ARMS-PZT m.3303 C>T mutasyonu agaroz jel görüntüsü (%2,5’lik jel). 

 

 

 

 

 

 

 



46 
 

4. BULGULAR 

4.1 m.3243A>G Mutasyon Taraması ve dizi analizi ile doğrulama 

ARMS-PZT, farklı oranlarda heteroplazmi içeren sentetik kontroller, 

heteroplazmik m.3243 A>G mutasyonu taşıyan MELAS hastası ve bu mutasyona 

sahip olmayan başka bir kontrol ile kurulmuştur. Tablo 3.4’teki şartlarda Corbett 

RotorGene 6000 cihazında gerşekleştirilen gerçek zamanlı reaksiyon sonucunda 

yapılan yüksek çözünürlüklü erime eğrisi analizi Şekil 4.1’de gösterilmiştir. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 4.1 m.3243 A>G mutasyonu ARMS-PZT erime eğrisi analizleri. 



47 
 

Şekil 4.2’de sentetik kontrollerin ayrıntılı 

erime eğrisi analizleri verilmiştir. Yukarıdan 

aşağıya doğru örnekler içerisinde mutant allel 

kopya sayısı artmaktadır. Değişen heteroplazmi 

içeriğiyle beraber erime eğrisinin de farklılık 

gösterdiği, yabanıl tipteki allelin (A allelinin) 83 

°C’de erime tepesi oluşturuken, mutant allelin (G 

allelinin) 81,5 °C’de erime tepesi oluşturduğu 

görülmektedir. 

 

Şekil 4.3, Şekil 4.4 ve Şekil 4.5’te 219 

hastanın ARMS-PZT yöntemi ile m.3243 A>G 

mutasyonu taramalarına ait agaroz jel görüntüleri 

verilmiştir. Bu taramalar sonucunda 

heteroplazmik olarak m.3243 A>G mutasyonu 

taşıyan hastalara ait jel görüntüleri ve erime eğrisi 

analizleri de Şekil 4.6 ve Şekil 4.7’de 

bulunmaktadır. Hastalar taşdıkları m.3243 A>G 

mutasyonu nedeniyle farklı erime profillerine 

sahiptir; mutant ve yabanıl tipteki alleller için iki 

farklı erime tepesi vermektedir. 

 

 

 

 

Şekil 4.2 m.3243 A>G 

mutasyonuna sahip 

sentetik kontrollerin 

ayrıntılı erime eğrisi 

analizi. 

 



48 
 

Şekil 4.3 m.3243 A>G mutasyonu ARMS-PCR hasta taramaları-1. 



49 
 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 4.4. m.3243 A>G mutasyonu ARMS-PCR hasta taramaları-2. 



50 
 

 

Şekil 4.5. m.3243 A>G mutasyonu ARMS-PCR hasta taramaları-3. 

 



51 
 

 

Şekil 4.6 m.3243 A>G mutasyon 

taramalarında pozitif çıkan 111 numaralı 

hasta örneğinin agaroz jel elektroforezi, erime 

eğrisi ve dizileme sonuçları 

 

 

 

 

 

Şekil 4.7 m.3243 A>G mutasyon taramalarında 

pozitif çıkan 135 numaralı hasta örneğinin 

agaroz jel elektroforezi, erime eğrisi ve dizileme 

sonuçları. 

 

 

 

 

 

 

 

 



52 
 

4.2 m.3256 C>T Mutasyon Taraması ve dizi analizi ile doğrulama 

Tablo 3.5’teki şartlara uygun olarak hazırlanan ARMS-PZT’nin farklı 

oranlarda heteroplazmi içeren sentetik kontrollerine ait yüksek çözünürlüklü erime 

eğrisi analizi Şekil 4.8’de verilmiştir. Erime eğrisi analizinde yabanıl tipteki allel ile 

mutant allelin erime tepeleri arasındaki fark görülmektedir.  Yapılan taramalar 

sonucunda m.3256 C>T mutasyonuna sahip bir  hasta belirlenmemiştir. ARMS-PZT 

taramalarının agaroz jel görüntüleri Şekil 4.9-4.11’de bulunmaktadır. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 4.8 m.3256 C>T mutasyonu ARMS-PZT erime eğrisi analizleri. 



53 
 

Şekil 4.9 m.3256 C>T mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları-1. 



54 
 

 

 

Şekil 4.10 m.3256 C>T mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları-2. 



55 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 4.11 m.3256 C>T mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları-3. 

 

 

 



56 
 

4.3 m.3260 A>G Mutasyon Taraması ve dizi analizi ile doğrulama  

Tablo 3.6’daki şartlara uygun olarak hazırlanan ARMS-PZT’nin farklı 

oranlarda heteroplazmi içeren sentetik kontrollerine ait yüksek çözünürlüklü erime 

eğrisi analizi Şekil 4.12’de verilmiştir. HRM analizleri sonucunda sentetik kontrollerin 

erime grafikleri arasında belirgin bir fark görülmemiştir. Yapılan taramalar sonucunda 

m.3260 A>G mutasyonuna sahip bir  hasta belirlenmemiştir. ARMS-PZT taramalarına 

ait agaroz jel görüntüleri Şekil 4.13 ve 4.14’te gösterilmiştir. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 4.12 m.3260 A>G mutasyonu ARMS-PZT erime eğrisi analizleri. 



57 
 

  

Şekil 4.13 m.3260 A>G mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları -1. 



58 
 

Şekil 4.14 m.3260 A>G mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları -2. 

 

            ARMS-PZT hasta taramalarında m.3260 A>G mutasyonun pozitif olduğu 

belirlenen beş hasta için dizileme analizine gidilmiş, dizileme sonucunda hastalarda 

mutasyon tespit edilmemiştir (Şekil 4.15 ve Şekil 4.16).  

Şekil 4.15 ARMS-PZT m.3260 A>G mutasyonu taramalarında belirlenen yalancı 

pozitif sonuçların agaroz jel ve dizileme analizleri -1. 



59 
 

 

 

Şekil 4.16 ARMS-PZT m.3260 A>G mutasyonu taramalarında belirlenen yalancı 

pozitif sonuçların agaroz jel ve dizileme analizleri -2. 

 

4.4 m.3271 T>C Mutasyon Taraması ve dizi analizi ile doğrulama 

Tablo 3.7’deki şartlara uygun olarak hazırlanan ARMS-PZT’nin farklı 

oranlarda heteroplazmi içeren sentetik kontrollerine ait yüksek çözünürlüklü erime 

eğrisi analizi Şekil 4.17’de verilmiştir. Mutant allel ve yabanıl tipteki allellerin erime 

eğrisi analizlerinde ayrıştırıcı bir fark tespit edilmemiş, farklı mutant allel oranına 

sahip örneklerin 84 °C’de erime tepeleri verdiği belirlenmiştir. 

Yapılan taramalar sonucunda m.3271 T>C mutasyonuna sahip bir  hasta 

belirlenmemiştir. ARMS-PZT taramalarının agaroz jel görüntüleri Şekil 4.18 ve 

4.19’da gösterilmiştir. 

 

 



60 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 4.17 m.3271 T>C mutasyonu ARMS-PZT erime eğrisi analizleri. 

 

 

 



61 
 

 

 

Şekil 4.18 m.3271 T>C mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları -1. 

 

 

 

 

 



62 
 

 

Şekil 4.19 m.3271 T>C mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları -2. 

 

4.5 m.3291 T>C Mutasyon Taraması ve dizi analizi ile doğrulama 

Tablo 3.8’deki şartlara uygun olarak hazırlanan ARMS-PZT’nin sentetik 

kontrollerine ait yüksek çözünürlüklü erime eğrisi analizi Şekil 4.20’de verilmiştir. 

Erime eğrisi analizinde farklı oranlarda mutant allel içeren sentetik kontrollerin farklı 

noktalarda erime eğrisi oluşturduğu belirlenmiş olsa da %100 yabanıl tipteki allel 

içeriğine sahip olan kontrolün mutant kontrolle aynı noktada kesişerek bir erime tepesi 

oluşturduğu gözlemlenmiştir. Hastalara ait ARMS-PZT taramalarının agaroz jel 

görüntüleri Şekil 4.21-4.23’de bulunmaktadır.  

Yapılan taramalar sonucunda m.3291 T>C mutasyonuna sahip bir  hasta 

bulunmazken, m.3290 T>C varyasyonu taşıyan bir hasta tespit edilmiştir. Hastanın 

homoplazmik olarak bu varyasyonu taşıdığı dizi analizi ile doğrulanmıştır (Şekil 4.24). 

 

 



63 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 4.20 m.3291 T>C mutasyonu ARMS-PZT erime eğrisi analizleri. 

 



64 
 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 4.21 m.3291 T>C mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları -1. 



65 
 

 

Şekil 4.22 m.3291 T>C mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları -2. 

 

 

 

 



66 
 

Şekil 4.23 m.3291 T>C mutasyonu ARMS-PZT hasta taramaları -3. 

 

 

 

 



67 
 

 

 

 

 

 

Şekil 4.24 m.3291 T>C mutasyonu taramalarında m.3290 T>C varyasyonu pozitif 

çıkan 814 numaralı hasta örneğinin agaroz jel elektroforezi, erime eğrisi 

ve dizileme sonucu. 

 

 4.6 m.3303 C>T Mutasyon Taraması ve dizi analizi ile doğrulama 

Tablo 3.9’da verilen şartlara uygun olarak hazırlanan ARMS-PZT’nin sentetik 

kontrollerine ait yüksek çözünürlüklü erime eğrisi analizi Şekil 4.25’de verilmiştir. 

Erime eğrisi analizinde farklı oranlarda mutant allel içeren sentetik kontrollerin mutant 

ve yabanıl tipteki alleller için verdiği erime tepelerinin farklı noktalarda bulunduğu 

tespit edilmiştir. Belirgin olarak yabanıl tipteki allel için 84,5 °C’de, mutant allel için 

83,5 °C’de erime tepesi oluştuğu gözlemlenmiştir. (Şekil 4.25).  219 hasta örneğiyle 

yapılan taramaların agaroz jel elektroforez sonuçları Şekil 4.26-4.28’de 

bulunmaktadır. 



68 
 

ARMS-PZT taramaları sonucunda bir hastanın homoplazmik olarak m.3303 

C>T mutasyonu taşıdığı belirlenmiş, bu mutasyonun HRM ve dizileme yöntemiyle 

analizi yapılmış, mutasyonun varlığı doğrulanmıştır (Şekil 4.29). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 4.25 m.3303 C>T mutasyonu ARMS-PZT erime eğrisi analizleri. 



69 
 

Şekil 4.26 m.3303 T>C mutasyonu ARMS-PCR hasta taramaları -1. 



70 
 

 

Şekil 4.27 m.3303 T>C mutasyonu ARMS-PCR hasta taramaları -2. 

 

 

 



71 
 

 

 

 

 

 

 

 

Şekil 4.28 m.3303 T>C mutasyonu ARMS-PCR hasta taramaları -3. 



72 
 

 

 

 

 

 

 

Şekil 4.29 m.3303 T>C mutasyonu taramalarında pozitif çıkan 641 numaralı hasta 

örneğinin agaroz jel elektroforezi, erime eğrisi ve dizileme sonuçları. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



73 
 

5. TARTIŞMA 

 

Mitokondriyal sitopatiler, mitokondriyal oksidatif fosforilasyon işlev 

bozukluklarının neden olduğu, klinik ve genetik heterojenitenin görüldüğü, multi-

sistemik bir hastalık grubudur. Mitokondriyal sitopati öntanısı, hastanın klinik 

bulguları, aile geçmişi ve biyokimya testleri göz önünde bulundurularak verilir. Klinik 

kimya incelemelerinde hasta serumunda, yüksek laktat/piruvat oranı, yüksek alanin 

düzeyi ve TCA döngüsü ara ürünlerinde bir artış olması durumu mitokondriyal işlev 

bozukluklarına işaret etmektedir (5). Ancak bu belirteçler mitokondriyal hastalıkların 

taranmasında ve tanılanmasında tek başına kullanılabilecek hassasiyette ve 

güvenirlikte değildir. Moleküler tanı testler bu belirteçlerin yanında açık, güvenilir ve 

hızlı sonuçlar sağlayabildikleri için mitokondriyal sitopati ön tanılı hastalarda mtDNA 

nokta mutasyonlarının incelenmesinde ilk adım olarak değerlendirilir (5).  

Bu tez çalışması kapsamında mitokondriyal sitopati öntanılı hastalar için MT-

TL1 geninde belirlenen altı nokta mutasyonunun hedeflendiği ARMS-PZT tabanlı bir 

tarama testi geliştirilmiştir. Taramalarda hastalara ait periferik kan ve kas doku 

örnekleri kullanılmıştır. Periferik kan örnekleri, kolay ulaşılabilir olmalarıyla genetik 

tanı ve tarama testlerinde sıklıkla tercih edilse de mitokondriyal sitopati analizlerinde 

düşük heteroplazmi nedeniyle yalancı negatif sonuç verme olasılığı yüksek olan 

örneklerdir. Örneğin m.3243 A>G mutasyon yükünün negatif seçilimle yaşam süresi 

boyunca azaldığı ve ilerleyen yaşlarda periferik kan örneklerinde belirlenmesinin 

güçleştiği bilinmektedir (103,104). Bu nedenle çalışmada, dağılım hacmi göz önünde 

bulundurularak tutulumun en sık gözlemlendiği doku olan kas doku örneklerinin 

kullanılmasına öncelik verilmiş; mitokondriyal sitopati öntanısı alan hastalara ait 78 

kan örneğine karşı, 140 kas doku örneği ve bir karaciğer doku örneği taranmıştır. 

Tarama sonucunda iki pediyatrik hastanın periferik kan örneklerinde heteroplazmik 

m.3243 A>G mutasyonu belirlenirken, pediyatrik bir hastanın kas örneğinde 

homoplazmik m.3290 T>C varyasyonu ve başka bir pediyatrik hastanın kas örneğinde 

homoplazmik m.3303 C>T mutasyonu tespit edilmiştir (Tablo 5.1). 

m.3243 A>G mutasyonunun Finlandiya’da yapılan bir çalışmada yetişkin 

popülasyonundaki prevelansının 16,3/100,000 olduğu belirlenmiştir (71). Bu çalışma 



74 
 

kapsamında 219 hasta arasında m.3243 A>G mutasyonu taşıdığı tespit edilen iki hasta 

bulunmaktadır. Hastalar 1996 yılında anabilim dalımıza yönlendirilmiş olup, genetik 

tanı laboratuvarımızda PZT ve ApaI enzim kesimleri sonucunda m.3243 A>G 

mutasyonu taşıdığı belirlenerek raporlanmış hastalardır. Geliştirilen tarama testi 

sonucunda bu mutasyonların hastalardaki varlığı doğrulanarak, tarama testinin 

hassasiyeti ortaya konulmuştur.  

m.3291 T>C mutasyonu için tasarlanan ARMS-PZT taramaları sonucunda bir 

hastanın kas doku örneğinde homoplazmik m.3290 T>C varyasyonu belirlenmiştir. 

Hastanın 2005 yılında çocuk nöroloji birimine başvurduğu ve klinik muayenesinde 

yağlı karaciğer ve hipotoni  bulgularının belirgin olduğu raporlanmıştır. Geçmişte 

genetik tanı laboratuvarında yapılan testlerde hastanın kas doku örneğinde MELAS ile 

ilişkilendirilen m.3243 A>G mutasyonu, MERRF ile ilişkilendirilen m.8344 A>G 

mutasyonu ve common delesyon negatif olarak raporlanmıştır. MITOMAP veri 

tabanında patojenik olmayan varyasyon olarak geçen m.3290 T>C, literatürdeki bazı 

vakalarda yüksek tansiyon (105) ve ani bebek ölümü sendromuyla (106) 

ilişkilendirilmiştir. 

 ARMS-PZT taramaları sonucunda bir hastada homoplazmik olarak nadir 

m.3303 C>T mutasyonu belirlenmiştir. Bu mutasyonun raporlandığı vaka sayısı 

literatürde oldukça az olmakla birlikte 1994’te Silvestri ve Bruno’nun yaptığı 

çalışmalar mutasyonun kardiyomiyopati ilişkili olduğunu göstermektedir (Bkz. 2.4 

MT-TL1 Geni bölümü). 2003 yılında Metabolizma Hastalıkları Bilim Dalı’na başvuran 

hastanın klinik muayenesinde retinada tuz-biber manzarası, başını dik tutamama ve 

azalmış cilt altı yağ dokusu belirlenmiş; geçmişte yapılan genetik tanı testlerinde 

hastanın kas doku örneğinde m.3243 A>G, m.8344 A>G mutasyonları ve common 

delesyon negatif olarak raporlanmıştır. 

 

 

 

 

 



75 
 

Tablo 5.1 ARMS-PZT taramaları sonucunda MT-TL1 geninde mutasyon tespit edilen 

hastalar. 

Hasta Örnek 

türü 

Mutasyon Cinsiyet 

111 Kan m.3243 A>G Heteroplazmi Kız 

135 Kan m.3243 A>G Heteroplazmi Erkek 

814 Kas m.3290 T>C Homoplazmi Erkek 

641 Kas m.3303 C>T Homoplazmi Erkek 

 

Tez çalışması kapsamında geliştirilen ARMS-PZT, m.3243 A>G, m.3256 

C>T, m.3291 T>C, m.3303 C>T mutasyonları iç