T.C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YENİ SENTEZLENEN ANTİTİROZİNAZ AKTİVİTEYE SAHİP KOJİK ASİT TÜREVLERİNİN A375 MALİN MELANOMA HÜCRE HATTINDA SİTOTOKSİSİTE VE HÜCRE ÖLÜMÜ ÜZERİNE ETKİSİNİN AYDINLATILMASI Rıdvan FELEKOĞLU Biyokimya Programı YÜKSEK LİSANS TEZİ ANKARA 2021 T.C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YENİ SENTEZLENEN ANTİTİROZİNAZ AKTİVİTEYE SAHİP KOJİK ASİT TÜREVLERİNİN A375 MALİN MELANOMA HÜCRE HATTINDA SİTOTOKSİSİTE VE HÜCRE ÖLÜMÜ ÜZERİNE ETKİSİNİN AYDINLATILMASI Rıdvan FELEKOĞLU Biyokimya Programı YÜKSEK LİSANS TEZİ TEZ DANIŞMANI Doç. Dr. Ayşe ERCAN ANKARA 2021 iii ONAY SAYFASI iv YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI v ETİK BEYAN vi TEŞEKKÜR Lisansüstü eğitimim süresince bilgisinden ve tecrübelerinden faydalandığım, insani ve ahlaki değerlerini örnek aldığım, birlikte çalışmaktan onur ve gurur duyduğum, hoşgörüsü ve desteği ile her zaman yanımda olan ve arkamda duran Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı üyesi saygıdeğer tez danışmanım Doç. Dr. Ayşe ERCAN’a, Tez çalışmalarım esnasında, her aşamada desteğini hissetmiş olduğum, bilgisini ve deneyimlerini benimle paylaşan Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı üyesi değerli hocam Arş. Gör. Selin ÖNCÜL’e, Bu zorlu ve stresli dönemimde beni her daim destekleyen Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı ve Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı öğretim üyeleri ve çalışanlarına, Her zaman ve her şartta her daim yanımda olan, beni her konuda destekleyen ve güçlü kalmamı sağlayan sevgili annem Fatma FELEKOĞLU’na, Sonsuz teşekkür ederim. vii ÖZET Felekoğlu, R., Yeni Sentezlenen Antitirozinaz Aktiviteye Sahip Kojik Asit Türevlerinin A375 Malin Melanoma Hücre Hattında Sitotoksisite ve Hücre Ölümü Üzerine Etkisinin Aydınlatılması, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Biyokimya Programı Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2021. Bu tez çalışması kapsamında, tirozinaz inhibitörü olan kojik asit türevi bileşikler incelenmiştir. A375 insan malign melanoma hücrelerine karşı sitotoksik özelliği en kuvvetli bileşiğin malign melanoma hücresini hangi mekanizmalarla ölüme götürdüğü ve hücre içerisinde hangi moleküler ölüm yolaklarını tetiklediği araştırılmıştır. Sitotoksisite için yapılan SRB deneyi sonucunda IC50 değeri 9,81 µM olarak ölçülen Bileşik-15’in canlı hücreleri etkili bir biçimde ölüme götürdüğü gözlemlenmiştir. Bileşik-15’in tirozinaz inhibisyonu etkinliği için B16F10 hücrelerinin sitozolü ve kontrol olarak kojik asit kullanılarak spektrofotometrik olarak belirlenmiştir ve çıkan sonuçlarda kojik asitle yarışabileceği gözlemlenmiştir. Kojik asite ait IC50 değeri 59,20 µM iken Bileşik-15’in IC50 değeri 76,69 µM’dır. Ardından, apoptoz deneyi yapılmıştır, deney sonucunda Bileşik-15’in hücreleri apoptozun son aşamasına kadar götürdüğü gözlemlenmiştir. Bileşik-15’in A375 hücrelerinde hangi apoptotik genleri etkilediğini tespit etmek için hücrelerden RNA saflaştırılmış, ardından cDNA oluşturulmuştur. Apoptotik p53 ve Bax, anti-apoptotik Bcl- 2 ve ayrıca Jnk, Mdm2 ve Mdr1 gen düzeyleri incelenmiştir. Bcl-2’nin kontrole kıyasla 0,5 kat azalması ve Bax’ın kontrole kıyasla 2,4 kat artması ile Bileşik-15’in hücreleri 24 saatte apoptoza götürdüğü gözlemlenmiştir. p53’ün aktivitesini erkenden gösterdiği Mdm2’nin oranın p53’e göre 3 kat yüksek olması hücrelerde yükselmiş olan p53 seviyesinin kontrol altına alınmış olabileceğini desteklemiştir. Mdr-1 geni için ilk 24 saatte gördüğümüz tepkinin yüksek olduğu görülmüştür. Jnk geni için herhangi bir değişiklik gözlemlenmemiştir. Bileşik-15’in melanoma hücrelerinde tetiklediği ölüm yolağı akış sitometrisi ile belirlenmiş ve çalışmadan elde edilen sonuçlara göre geç apoptoz oranının %58.8 olması A375 hücrelerinin programlı bir şekilde ölüme gittiği söylenebilir. A375 hücrelerinde yapılan western blot analizi ile β-Aktin, P53 ve Mdr1 proteinleri için yapılan analizlerin sonucunda bulguların gen ekspresiyon sonuçları ile tutarlı olduğu gözlemlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Kojik asit, p53, apoptoz, gen ekspresyonu, sitotoksisite Bu tez Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimince desteklenmiştir. Proje No: 18107 viii ABSTRACT Felekoglu, R., The Effect of Kojic Acid Derivatives with New Synthesized Antithyrosinase Activity on Cytotoxicity and Cell Death in the A375 Malign Melanoma Cell Line, Hacettepe University Graduate School of Health Sciences Biochemistry Department of Master Thesis, Ankara 2021. In this thesis study, kojic acid derivative compounds which are tyrosinase inhibitors were investigated. The mechanisms that lead to death and molecular death pathways in the cells caused by which compound with the strongest cytotoxic properties against A375 human malignant melanoma cells have been examined. As a result of the SRB test conducted for cytotoxicity, it was observed that Compound-15, whose IC50 value was measured as 9.81 µM, effectively killed living cells. The enzymatic inhibition of Compound-15 was determined spectrophotometrically using the cytosol of B16F10 mice cells and kojic acid as a control. According to spectrophotometry results, it was demonstrated that Compound- 15 could compete with kojic acid. Furthermore, the IC50 values of kojic acid and Compound-15 were obtained as 59.20 µM and 76.79 µM respectively. The apoptosis test was carried out and as stated in test results, Compound-15 took the cells to the last stage of apoptosis. Then, to determine which apoptotic genes in A375 cells affected by Compound-15, RNA was purified from cells, and cDNA was synthesized. Apoptotic p53 and Bax, anti-apoptotic Bcl-2 as well as Jnk, Mdm2 and Mdr1 gene levels were examined. Bcl-2 levels decreased 0.5 times and Bax levels increased 2.4 times compared to control. Thus, it has been observed that Compound-15 leads cells to apoptosis in 24 hours. The ratio of Mdm2 in which p53 showed early activity, increased 3 times compared to p53, supports the idea that increased p53 level in cells may have been taken under control. The results obtained in the first 24 hours for the Mdr-1 gene were high. No significant change was observed in the Jnk gene compared to the control. The death pathway triggered by Compound-15 in melanoma cells was determined by flow cytometry and according to the results, it can be said that the late apoptosis rate of 58.8% leads A375 cells to more effective programmed death. As a result of the western blot and β-Actin, p53 and Mdr1 protein analysis performed on A375 cells, it was concluded that the findings were consistent with the gene expression results. Key words : Kojic acid, p53, apoptosis, gene expression, cytotoxicity This thesis was supported by Hacettepe University Scientific Research Coordination Unit. Project Number: 18107 ix İÇİNDEKİLER ONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT vii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER ve KISALTMALAR xi ŞEKİLLER xiii TABLOLAR xv 1.GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Kanser 3 2.2. Deri Kanseri 5 2.3. Malign Melanom 7 2.3.1. Malign Melanom Epidemiyolojisi ve Risk Faktörleri 8 2.3.2. Melanomadaki Genetik Faktörler 11 2.4 Apoptoz 12 2.4.1. Apoptozda Görülen Morfolojik Değişiklikler 17 2.5. MAPK Sinyal İletim Yolağı ve BRAF Mutasyonu 18 2.6. Melanomda tedavi 19 2.6.1. Vemurafenib 20 2.6.2. Dabrafenib 21 2.6.3. Trametinib 21 2.6.4. Dakarbazin 22 2.7. Tirozinaz Enzimi 22 2.7.1. Tirozinaz İnhibisyonları 25 2.7.2. Kojik Asit 26 3. GEREÇ ve YÖNTEM 32 3.1. Gereç 32 3.1.1. Hücreler 32 3.1.2. Kitler ve Kimyasal Maddeler 32 3.1.3. Cihazlar 34 3.2. Yöntem 35 x 3.2.1. Hücre Kültürü 35 3.2.2. B16F10 Hücrelerinden Tirozinaz Elde Edilmesi 36 3.2.3. B16F10 Hücreleri ile Enzim Aktivitesi Ölçümü 37 3.2.4. Sülforodamin B (SRB) Deneyi 37 3.2.5. Apoptoz Deneyi 38 3.2.6. Hücrelerden RNA Saflaştırılması 39 3.2.7. RNA’dan cDNA Sentezi 40 3.2.8. RT-PCR ile Gen İfadesi Analizi 41 3.2.9. Agaroz Jel Elektroforezi 43 3.2.10. Akış Sitometri ile Apoptoz ve Canlılık Tayini 44 3.2.11. Western Blot Uygulamsı 45 4. BULGULAR 49 4.1. SRB Deneyi Sonuçları 49 4.2. B16F10 Hücreleri ile Enzim Aktivitesi Ölçümü 63 4.3.Apoptoz Deneyi Sonuçları 64 4.4. Saflaştırılan RNA Örneklerinin Saflık Düzeyi ve Miktarı 66 4.5. A375 Hücrelerinden Elde Edilen Total RNA Örneklerinin Agaroz Jel Görüntüleri 66 4.6. cDNA Örneklerine Ait Derişim 67 4.7. A375 Hücresinde P53, MDM2, BAX, BCL-2, MDR-1 ve JNK Genlerinin Ekspresyon Düzeyi Bulguları 68 4.8. Akış Sitometri ile Apoptoz ve Canlılık Tayini 71 4.9. Protein Miktar Tayini Bulguları 75 4.10. Western Blot Bulguları 77 5. TARTIŞMA 78 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 87 7. KAYNAKLAR 88 8. EKLER EK 1. Orjinallik Ekran Çıktısı EK 2. Dijital Makbuz 9. ÖZGEÇMİŞ xi SİMGELER ve KISALTMALAR ATCC : Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu BAD : BCL-2 ile ilişkili ölüm promotoru BAK : BCL-2 homolog antagonist öldürücü BAX : BCL-2 ile ilişkili X proteini BID : BH3 ile etkileşen bölge ölüm agonisti BIK : BCL-2 ile etkileşen öldürücü Cdk : Siklin bağımlı kinaz Ct : Eşik döngüsü DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO : Dimetilsülfoksit EDTA : Etilendiamin tetraasetik asit EGTA : Egtazik asit EtBr : Etidyum bromür Fas-L : Fas ligandı FDA : Amerikan gıda ve ilaç dairesi FBS : Fetal Bovine Serum HCl : Hidroklorik asit IC50 : İnhibitör konsantrasyonu JNK : c-Jun N-Terminal kinaz kDa : Kilodalton L-DOPA : L-3,4-dihidroksifenilalanin MAPK : Mutajen ile aktive edilen protein kinaz MDR1 : Çoklu İlaç Direnci Geni NaCI : Sodyum Klorür NCI : Amerikan ulusal kanser enstitüsü NF- κB : Çekirdek faktörü kB PBS : Fosfat tamponlu salin PMSF : Fenilmetilsülfonilflorit PCR : Polimeraz zincir reaksiyonu RT-PCR : Eş zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ROS : Reaktif oksijen türleri xii SDS : Sodyum dodesil sülfat SRB : Sülforodamin B TE : Tris-EDTA TCA : Trikloroasetik asit TFA : Trifloroasetik asit THF : Tetrahidrofuran Tm : Erime sıcaklığı TMS : Tetrametilsilan TNF : Tümör nekroz faktörü TNFR1 : Tip 1 TNF reseptörü TRAIL : TNF-ilişkili apoptoz indükleyici ligand TRP-1 : Tirozinaz İlişkili Protein-1 TRP-2 : Tirozinaz İlişkili Protein-2 UV : Ultraviyole xiii ŞEKİLLER Şekil Sayfa 2.1. Kanserin temel özellikleri. 4 2.2. Epidermis hücrelerde görülen kanserler 6 2.3. Malign Melanoma için risk faktörleri. 9 2.4. UVA ve UVB ışınlarının insan derisi üzerindeki etkisi 10 2.5. Melanoma Sinyal Ağı: Melanomanın oluşmasında ve gelişmesinde görev alan 3 ana mekanizmanın gösterilmektedir. 12 2.6. Apoptozis ve kanser 13 2.7. Apoptoz mekanizması 15 2.8. Nekroz ve apoptozun karşılaştırılması. 16 2.9. Apoptozda oluşan morfolojik değişiklikler 18 2.10. Vemurafenib çalışma mekanizması 21 2.11. Dabrafenib ve Trametinib inhibitörlerinin çalışma mekanizması 22 2.12. Melanositler, melanozomlar ve deri içerisinde konumları. 23 2.13. Melanin pigmentinin biyosentetik yolağı 24 2.14. Kojik asitin kimyasal yapısı. 26 2.15. Melanin biyosentezinde KA'nın tirozinaz inhibitör mekanizması. 27 2.16. Tiroznaz inhibisyonu aktivitesi. 28 3.1. Işık mikroskobu altında gözlemlenen A375 hücreleri. 35 3.2. Işık mikroskobu altında gözlemlenen B16F10 hücreleri. 35 4.1. A375 hücrelerinde Bileşik-2 etkileşimi sonucu oluşan % canlılık grafiği 49 4.2. A375 hücrelerinde Bileşik-3 etkileşimi sonucu oluşan % canlılık grafiği 50 4.3. A375 hücrelerinde Bileşik-4 etkileşimi sonucu oluşan % canlılık grafiği 51 4.4. A375 hücrelerinde Bileşik-5 etkileşimi sonucu oluşan % canlılık grafiği 52 4.5. A375 hücrelerinde Bileşik-9 etkileşimi sonucu oluşan % canlılık grafiği 53 4.6. A375 hücrelerinde Bileşik-10 etkileşimi sonucu oluşan % canlılık grafiği 54 4.7. A375 hücrelerinde Bileşik-11 etkileşimi sonucu oluşan % canlılık grafiği 55 4.8. A375 hücrelerinde Bileşik-13 etkileşimi sonucu oluşan % canlılık grafiği 56 4.9. A375 hücrelerinde Bileşik-14 etkileşimi sonucu oluşan % canlılık grafiği 57 4.10. A375 hücrelerinde Bileşik-17 etkileşimi sonucu oluşan % canlılık grafiği 58 4.11. A375 hücrelerinde Bileşik-18 etkileşimi sonucu oluşan % canlılık grafiği 59 4.12. A375 hücrelerinde Bileşik-19 etkileşimi sonucu oluşan % canlılık grafiği 60 xiv 4.13. A375 hücrelerinde Bileşik-15 etkileşimi sonucu oluşan % canlılık grafiği (R2 : 0,9443) 61 4.14. A375 hücrelerinde Bileşik-15 etkileşiminin mikroskop görüntüleri 62 4.15. Kojik asitin B16F10 hücrelerindeki tirozinaz üzerine inhibitör etkisi 63 4.16. Bileşik-15’in B16F10 hücrelerindeki tirozinaz üzerine inhibitör etkisi 63 4.17. 24 saat süresince Bileşik-15’in IC50 değerine maruz bırakılan A375 hücrelerinin kazpaz 3/7 yüzdeleri 64 4.18. 24 saat süresince Bileşik-15’in IC50 değerine maruz bırakılan A375 hücrelerinin sitotoksite yüzdeleri 65 4.19. 24 saat süresince Bileşik-15’in IC50 değerine maruz bırakılan A375 hücrelerinin canlılık yüzdeleri 65 4.20. Saflaştırılan total RNA örneklerinin jel fotoğrafı. 67 4.21. 24 saat süresince Bileşik-15’e maruz bırakılmış A 375 hücrelerinde P53 ve Mdm2 ekspresyon düzeylerinde saptanan değişiklikler 68 4.22. 24 saat süresince Bileşik-15’e maruz bırakılmış A375 hücrelerinde Bax ve Bcl-2 ekspresyon düzeylerinde saptanan değişiklikler 69 4.23. 24 saat süresince Bileşik-15’e maruz bırakılmış A 375 hücrelerinde Jnk ve Mdr-1 ekspresyon düzeylerinde saptanan değişiklikler 69 4.24. 24 saat süresince Bileşik-15’e maruz bırakılmış A 375 hücrelerinde TP53, Mdm2, Bax, Bcl-2, Jnk ve Mdr-1 genlerinin ekspresyon düzeylerinde saptanan değişiklikler 70 4.25. RT-PCR işlemi sırasında genlerin gösterdiği piklerin grafiği 71 4.26. Akış sitometri analizinde A375 hücrelerine 24 saat süresince kontrol uygulanmasından sonra Annexin V ve PI boyalarla boyanma şekline göre değerlendirilmesi.(Q1:Erken Apoptoz, Q2:Geç Apoptoz, Q3:Nekroz, Q4:Canlılık) 72 4.27. Akış sitometri analizinde A375 hücrelerine 24 saat süresince Bileşik-15’in uygulanmasından sonra Annexin V ve PI boyalarla boyanma şekline göre değerlendirilmesi. 72 4.28. A375 hücrelerine 24 saat süresince Bileşik-15’in uygulanması ile uygulanan deney ve kontrol gruplarındaki A375 hücrelerinin % hücre değerlerinin gösterimi 73 4.29. BCA deneyi sonucu elde edilen standart değerlerinin standart eğri grafiği ve denklemi. 76 4.30. Bileşik-15 uygulaması sonucunda elde edilen Mdr1 ve p53 genlerinin western blot analiz sonuçları. 77 5.1. Bileşik-15’in fiziksel ve kimyasal yapısı 79 5.2. Apoptoz mekanizması ve efektör kaspazları 81 5.3. Mdm2’nin p53’ü düzenlemesi 84 xv TABLOLAR Tablo Sayfa 2.1. Tahmini yeni kanser vakaları ve cinsiyete göre ölümlerde önde gelen on kanser türü 5 2.2. Tez kapsamında kullanılan Kojik asit ve türevleri 30 3.1. Kimyasal maddeler ve Kitler 33 3.2. cDNA için hazırlanan 1. karışım 40 3.3. cDNA için hazırlanan 2. karışım 41 3.4. RT-PCR reaksiyonu için kullanılmış olan ileri ve geri primer dizilerine ait erime sıcaklıkları ve %Guanin-Sitozin verileri. 42 3.5. RT-PCR deneyi için oluşturulan reaksiyon çözeltisi 42 3.6. RT-PCR döngü koşulları 43 3.7. Protein izolasyon için hazrılanan RİPA Çözeltisi 46 4.1. Bileşik-2’nin A375 hücrelerindeki % canlılık değeri 49 4.2. Bileşik-3’ün A375 hücrelerindeki % canlılık değeri 50 4.3. Bileşik-4’ün A375 hücrelerindeki % canlılık değeri 51 4.4. Bileşik-5’in A375 hücrelerindeki % canlılık değeri 52 4.5. Bileşik-9’un A375 hücrelerindeki % canlılık değeri 53 4.6. Bileşik-10’nun A375 hücrelerindeki % canlılık değeri 54 4.7. Bileşik-11’in A375 hücrelerindeki % canlılık değeri 55 4.8. Bileşik-13’ün A375 hücrelerindeki % canlılık değeri 56 4.9. Bileşik-14’ün A375 hücrelerindeki % canlılık değeri 57 4.10. Bileşik 17’in A375 hücrelerindeki % canlılık değeri 58 4.11. Bileşik-18’in A375 hücrelerindeki % canlılık değeri 59 4.12. Bileşik-19’un A375 hücrelerindeki % canlılık değeri 60 4.13. Bileşik-15’in A375 hücrelerindeki % canlılık değeri 61 4.14. 24 saat süresince Bileşik-15’e maruz bırakılan A375 hücrelerinin total RNA örneklerine ait 260/280 nM dalga boyu. 66 4.15. cDNA örneklerinin miktarı. 67 4.16. 24 saat boyunca Bileşik-15’e maruz bırakılmış A375 hücrelerinin Bileşik-15 uygulanmamış kontrol grubuna kıyasla elde edilen gen ekspresyon düzeylerine ait ortalama ve standart sapma değerleri. 70 4.17. A375 hücrelerine 24 saat süresince Bileşik-15’in uygulanması ile uygulanan deney ve kontrol gruplarındaki A375 hücrelerinin % hücre değerlerinin grafiği 74 xvi 4.18. 2000 μg/mL içerecek şekilde artan derişimlerde 8 adet protein standartına ait 562 nm’de ölçülen absorbans değerleri. 75 4.19. 48 saat boyunca Bileşik-15’e maruz bırakılan A375 hücrelerinin BCA deneyi ile ölçülen total protein düzeyleri. 76 1 1. GİRİŞ Deride pigmentasyon yapan hücrelerin malign tömörü olan melanoma, dünyada görülme sıklığı hızla artan ve yüksek mortalite oranına sahip bir kanser türüdür ve diğer kanser türlerine göre daha az sıklıkta görülmesine rağmen yüksek ölüm oranı melanomayı önemli kılmaktadır. Genetik sebeplerin yanı sıra en büyük etmenin ultraviyole ışınları olduğu düşünülmekte ve güneş ışığına maruziyetin fazla olduğu bölgelerde daha sık görülmektedir. Melanin cilt renginden sorumlu olan pigmenttir ve ultraviyole hasarına karşı cilt korunmasında rol oynamaktadır. Melaninin aşırı birikimi sonucunda melazma, çiller, ve yaşlılık lekeleri gibi çok sayıda cilt problemleri ile karşılaşılabilmektedir (1). Bu agresif kanser türü, V600E adlı bir nokta mutasyon ile metastatik özellik kazanmaktadır. BRAF geninin 600 numaralı kodonunda Valin’in Glutamat’a dönüşümü ile karakteristik özellik kazanan bu nokta mutasyon birçok metastatik kanser türünde de mevcuttur. Vemurafenib, özellikle bu mutasyonu hedef alan FDA onaylı bir ilaçtır. Ancak gösterdiği yüksek toksisite oranı ve V600E mutasyonunu taşımayan melanoma türlerinde tümör ilerlemesini arttırmaktadır. Tirozinaz, melanin pigmentinin biyosentezinde katalizör olarak görev alan ve fenolik bileşiklerin kinonlara oksidasyonunu sağlayan bir enzimdir. Melaninin görevlerinden biride, canlılarda ultraviyole ışınlarına karşı koruyuculuk sağlamaktır. Melanin pigmentin aşırı üretilmesi ve birikmesi hiperpigmentasyon, melazma, postinflamatuar pigmentasyon ve patolojik durumlarda melanomaya yol açmaktadır. Bu sonuçlar doğrultusunda tıp, gıda endüstrisi ve kozmetikte melanin üretimini engelleyen veya azaltabilen tirozinaz inhibitörleri için yoğun bir ilgi oluşmaktadır. Günümüzde doğal veya sentetik kaynaklı birçok tirozinaz inhibitörü bulunmuştur. Tirozinaz inhibitörlerinin geneli, yapısal olarak tirozin veya L-DOPA'ya benzeyen kateşol veya fenol türevleridir. Ancak kojik asitin de dahil olduğu bu türevlerin yağdaki çözünürlükleri sınırlıdır ve stabiliteleri dayanıksızdır. Kojik asit, etkili ve tersinir yarışmalı olarak insan melanosit tirozinazını inhibe eder ve böylece melanin oluşumunu önler. Hücresel melanin oluşumunda kojik asit önemli bir rol oynar ve bakır şelatörlerinin antikanser özelliğe sahip oldukları bilgisi literatürde bulunmaktadır. Kojik asitin tirozinaz ile bakır şelasyonu yapması ve bu özelliği 2 barındıran yeni antiproliferatif ajanların geliştirilmesi için oldukça güçlü bir örnek olarak görülmektedir. Bu tez çalışması kapsamında, üniversitemiz Eczacılık Fakültesi Farmasötik Kimya Anabilim Dalı öğretim üyesi ve proje araştırmacısı Prof. Dr. Mutlu Aytemir’in sentezlemiş olduğu kojik asit türevi bileşikler incelenmiştir. A375 insan malign melanoma hücrelerine karşı sitotoksik özelliği en kuvvetli bileşiğin malign melanoma hücresini hangi mekanizmalarla ölüme götürdüğü ve hücre içerisinde hangi moleküler ölüm yolaklarını tetiklediği araştırılmıştır. Bu amaçla, bu yüksek lisans tez çalışmasında, sentezlenen bileşiklerin A375 insan malig n melanoma hücrelerinin canlılığı nasıl etkilediği araştırılmıştır. Sitotoksik etkisi en yüksek olan bileşik seçilerek lüminometrik bir yaklaşımla hücre canlılığı, hücre sitotoksisitesi, efektör kaspaz 3/7 aktivasyonları açısından etkinlikleri tayin edilmiştir. Aynı bileşiğin melanoma hücrelerinde tetiklediği ölüm yolağı akış sitometrisi ile belirlenmiştir. Bu amaçla A375 hücrelerinin RNA’sı izole edilerek ölüm mekanizmalarında rol alan genlerin (p53, Bax, Bcl-2, Jnk, Mdm2, Mdr1) ekspresyon düzeyleri incelenmiştir. Gen ekspresyon verilerini takiben apoptotik p53 ve mdr1 proteinlerinin ekspresyon düzeyi western blotlama ile ölçülmüştür. Son olarak bileşiğin tirozinaz enzim inhibisyonu B16F10 hücrelerinin sitozolü ve kontrol olarak Kojik asit kullanılarak spektrofotometrik olarak belirlenmiştir. Bütün bu aşamaların sonucunda bu tez çalısmasının nihai amacı: sentezlenen bileşigin yarattığı sitotoksiteden kaynaklanan hücre ölümünün kalitatif ve kantitatif olarak belirlenmesi, ölüm mekanizmalarını belirleyen genlerin düzeylerinin kantitatif olarak incelenmesidir. Böylece seçilimli olarak kanser hücre hattında etkili ama sağlıklı hücreye zarar vermeyen bir bileşigin etkisi enzimatik, sitotoksik, gen ve protein ekspresyonu temelli olarak gösterilmiş olacaktır. 3 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Kanser En genel tanımıyla kanser, DNA hasarı oluşması sonucu hücrelerin düzensiz bir şekilde bölünerek kontrolsüz büyümesi ve yayılımasıdır. Kanserde hücreler her zamanki sınırları dışında büyüme gösterir, çevresinde bulunan normal hücreleri istila eder ve diğer organlara da yayılır. Kanser hücreleri, birçok etkenden dolayı değişim geçirerek kontrolsüz bir şekilde büyüme ve bölünme (hücre proliferasyonu) yeteneği kazanırlar ve bunlarla birlikte oluştuğu yerden vücudun başka bir bölümüne yayılım (metastaz) gösterme özelliğini kazanırlar. Bulundukları yerde kitle oluşturup çoğalan ve vücudun diğer bölümlerine yerleşme eğilimi göstermeyen tömürlere benign tümör denirken ortaya çıktığı yerden diğer dokulara yayılanlara ise malign tümör denilmektedir. Malign tümörler, primer lokalizasyonlarının dışına taşarak vücudun başka bölgelerini ele geçirerek metastaz yaparlar ve ölümcül hale gelirler. Kanser hücreleri metastaz yaparken kan, lenf ya da vücut boşluklarını kullanarak diğer organlara sıçrar, normal hücrelerden gelen sinyallere cevap vermez, birbirlerine yapışmaz ve apoptoz sürecine girmezler. Kanser ölümlerinin en önemli sebebi metaztazdır. Kanser meydana geldiği hücrelerin tipine göre değerlendirilerek dört ana başlık altında incelenir. Bu başlıklar; bağ dokusu hücrelerinde görülen sarkoma, epitel doku hücrelerinde görülen karsinoma, hematopoietik hücrelerde ve lenf damarlarında görülen lenfoma ve hematopoietik hücrelerde görülen lösemidir. Bir dokuda kanser oluşumu ve metastazın gelişiminin 10 temel özelliği vardır (Şekil 2.1 ) (2). Normal hücrelerde bölünme sayısı sınırlıdır ama bu durum kanser hücrelerinde sınırsız olarak karşımıza çıkmaktadır. İmmortalite olarak bilinen bu mekanizmada kromozom uçları olan telomerler bulunur. Normal hücrelerin farklılaşması durumunda telomeraz enzimi de gittikçe azalır ve bununla beraber telomerler de kısalır. Bu sebepten dolayı farklılaşmış bir hücre siklusu G0 fazında durur (senesans) ve sonunda çoğalma yeteneğini kaybeder. Kanser hücrelerinde ise telomeraz enzimi etkinliğini kaybetmez yani telomerlerin uzunluğu değişmez ve hücreler sınırsız çoğalma yeteneği kazanır. DNA tamir mekanizmasında saptanan eksiklikler genetik kararsızlığa neden olur. Bu durumlara bağlı olarak kanser hücrelerinin proliferasyon kontrol mekanizmalarına cevap vermesi azalır. Diğer doku ve organlarda yaşama yeteneği 4 elde eden klonlar oluştururlar ve metaztaz yapmaya başlarlar. Normal hücreler bulundukları kültür ortamında yüzeye yapışamama durumunda bölünemezler. Normal hücreler üzerinde büyüdükleri yüzeyi tek tabaka şeklinde (monolayer) doldurduklarında besiyerleri bölünmeleri için gerekli tüm faktörleri (büyüme faktörleri ve besinler) içerse bile bölünemezler. Kültür ortamında ise kanser hücreleri büyüme faktörlerinden ve besinlerden bağımsız bir şekilde proliferasyonuna devam eder. Kanser hücrelerinin yapısında genellikle hücreler arası matriks bileşenlerini sindirecek proteazlar bulunur, bu durumun ardından normal dokular işgale uğrar. Yeni kan damarlarının oluşumu için kanser hücrelerinde büyüme faktörleri bulunmaktadır ve tümör belli bir boyuta ulaştığı zaman kendisini beslemek için yeni kan damarları (anjiyogenez) oluşturulur (3). Şekil 2.1. Kanserin temel özellikleri (4). Kanserin oluşması sürecinde genetik faktörlerin dışında çevresel faktörlerin de etkisi vardır. Kanser oluşumunu tetikleyici güneş ışığı, ısı, radyasyon, kronik irritasyon, alkol, endüstriyel maddeler, beslenme şekli, stres, sigara, virüs, immun yetmezlik, hareketsiz bir yaşam tarzı, yüksek tansiyon gibi bir çok faktör vardır (5). Kanser insidans hızı ve profili az gelişmiş ve gelişmiş ülkelerde birbirinden oldukça farklıdır. Gelişmiş ülkeler bazında erkeklerde akciğer ve prostat kanserleri çoğunlukla görülürken, kadınlarda ise kolorektal ve meme kanserleri daha sık görülür, az gelişmiş ülkelerde bu durum erkeklerde akciğer, karaciğer ve mide kanserleri, kadınlarda ise serviks ve meme kanserleri olarak görülmektedir. Türkiye’de bu durum 5 erkeklerde mesane, akciğer ve mide kanserleri olarak görülür, kadınlarda ise kolorektal ve meme kanserlerinin daha sık görüldüğü tespit edilmiştir. Kanser hücreleri kaynak aldıkları organ-doku tiplerine göre çeşitlendirilir.100 civarında kanser çeşidi olsa da çok sık görülen birkaç tür kanser vardır (tablo 2.1). 2020 yılında Dünya sağlık örgütünden elde edilen verilere göre insidansı yüksek ve ölümcül olan kanserler meme,akciğer, prostat, kolorektal ve deri kanserleridir (6). Tablo 2.1. Tahmini yeni kanser vakaları ve cinsiyete göre ölümlerde önde gelen on kanser türü (7) 2.2. Deri Kanseri Deri, fiziksel koruyucu bariyer olarak sıklıkla ultraviyole ışınlarına, karsinojenlere ve serbest radikallere maruz kalan vücudun bir organıdır. Diyetle vücuda giren mikroorganizmalar ve ilaçlar toksik etkilerini deri üzerinde gösterebilirler. Deri kanserleri, beyaz tenlilerde fazla görülen ve ozon tabakasının incelmesinden ötürü artan radyoaktif ışınların etkisiyle insidansı sürekli artan 6 malignitelerdir. Deri kanserleri, epidermiste apoptoz mekanizmasının çok az olması veya hücrelerin prolifere olmasından dolayı diğer kanser türlerinden ayırt edilmektedir (8). Deri kanserleri; melanoma, bazal hücre karsinomu ve skuamoz hücre karsinomu olmak üzere üç başlıkta toplanır (Şekil 2.2 ). Bazal hücreli ve skuamöz hücre karsinomu, deri kanserleri arasında en yaygın olan kanser türleridir. Melanom deri kanseri ise skuamöz hücre ve bazal hücreli deri kanserlerine oranla daha az görünür ancak çok daha ciddi sonuçlara sebep olurlar (9). Şekil 2.2. Epidermis hücrelerde görülen kanserler (10) Bazal hücreli karsinom, kıl folikülünün dış kök bölgesinden veya epidermisin bazal hücrelerinden bir öncül lezyon olmaksızın geliştiği bilinen, yavaş büyüyen, tedavi edilmediği zaman doku hasarı ve lokal invazyon oluşturan, nadiren metastaz yapan bir deri kanseri türüdür. Deri kanserlerinin % 80’ini oluşturur ve beyaz tenli popülasyonda en çok rastlanan kanser türüdür. Tümör, epidermisin bazal tabakasında ve bazal tabakanın eklerinden kaynaklanmaktadır. Bazal hücreli karsinom insidansının dünya çapında her yıl yaklaşık olarak %10 oranında arttığı bilinmektedir (11). Bazal hücreli karsinom gelişiminin daha iyi anlaşılması hedgehog ileti yolağının keşfedilmesiyle başlamıştır. Bu yolak embriyonik büyüme sırasında kas- iskelet, sinir, hematopoetik sistem ve deride görev almaktadır. Hedgehog ileti yolağı derideki kök hücrelerin sağkalımı ve kıl foliküllerinin gelişimini de kontrol etmektedir. Embriyonik gelişme dönemde büyük bir öneme sahip olan bu yollar erişkin dönemde 7 oldukça azalmaktadır. Eğer erişkin dönemde bu yolak tekrar aktifleşirse tümörogenez ile sonuçlanmaktadır. Bazal hücre karsinomu ile ilişkili en önemli risk faktörlerinden biri de ultraviyole maruziyettir. Ultraviyoleye maruz kalınan yaş, ultraviyole miktarı ve süresi ile birlikte spesifik polimorfik genler arasındaki etkileşim bazal hücreli karsinom yatkınlığını belirleyen en önemli faktörlerden birisidir (12). Skuamöz hücreli karsinom mukozal ve derideki epitelyal keratinositlerden meydana gelen bir deri kanseri türüdür. Skuamoz hücreli karsinom hızlı büyüme, lokal invazyon ve metastaz yapabilme özellikleri barındırır ve en sık görülen ikinci malignitedir. Melanom dışı deri kanserlerinde, Bazal hücre karsinomunun oranı % 80 iken Skuamoz hücreli karsinom oranı ise % 20’sini kapsamaktadır (13). Genetik ve sonradan kazanılmış faktörler Skuamoz hücreli karsinom için eğilim yaratabilir. Ama yaşam boyu maruz kalınan ultraviyole B ışını miktarı Skuamoz hücreli karsinomda en önemli faktördür. Aralıklı olarak maruz kalından ultraviyole daha çok Malign melanom ve Bazal hücreli karsinom riskini artırır. Ultraviyole ışınlarından, özellikle ultraviyole (güneş spektrumunda 280-320 nm) B (UVB) ışını derideki Skuamoz hücreli karsinom’larının en önemli etken faktörü olduğu kanıtlanmıştır. Tüm bunların dışında genetik etkenlerin de rol aldığı bilinmektedir (14). 2.3. Malign Melanom Malign melanom (MM) melanosit hücrelerinden köken alarak primer şekilde ciltte oluşum gösteren bir deri kanseri türüdür. Melanosit hücreleri derinin epidermis kısmında yer alırlar ve epidermis hücrelerinin %10’luk kısmını oluşturmalarının yanı sıra cilt rengini oluşturan melanin pigmentlerini üretirler (15). Malign melanom, cilt, göz ve saça rengini veren melanositlerin malignant dönüşümü ile kontrolsüz çoğalmasına takiben oluşan ve çoklu ilaç direncinin eşlik ettiği agresif kanser türlerinden biridir. Malign melanomalar çoğunlukla epidermiste ortaya çıkmaktadır ve bunlar invaziv (dermise doğru ilerleyen) veya in-situ (tamamen epidermise gömülü) olabilirler. Melanom erken evresinde sadece epidermiste görülürken, ilerleyen evrelerde yüzeyel papillar dermise kadar uzanabilen mikroinvazyonlar ve daha sonraki evrelerde ise dermisin derinlerine kadar invazyon ile metastazlar görülmesi kaçınılmazdır (16). 8 Malign Melanom patogenezi oldukça komplekstir ve tam olarak anlaşılması oldukça güçtür. Tüm bunlarla birlikte genetik değişimlerin birikimi, çevresel faktörlerle olan etkileşimler, onkogenlerin aktivasyonları, tümör supresör genlerin inaktivasyonları ve mekanizması bozulmuş deoksiribonükleik asit (DNA) onarımları malign melanoma patogenezlerinde önemli rol oynamaktadırlar (17). Malign Melanom eğer tedavi edilmezse metastaz durumuna geçerek ölümle sonuçlanmaktadır. Bununla birlikte, Malign Melanoma için erken aşamada tanı mümkün olursa ve tanıdan hemen sonra tedaviye başlanırsa olguların yaşamını sürdürmesi sağlanabilir. Bu aşamada Malign Melanoma oluşumunda rol alan risk faktörleri bilinirse ve risk durumundaki kişiler için gerekli tedaviler sağlanırsa hasta sayısı ve ölümlerin azaltılması açışından büyük önem taşır. 2.3.1. Malign Melanom Epidemiyolojisi ve Risk Faktörleri Tüm deri kanserleri arasında malign melanoma kanseri en ölümcül olanı olarak bilinmektedir. Melanom deri kanserleri arasında %3’ten az bir orana sahip olmasına rağmen deri kanserine ilişkin ölümlerin yaklaşık olarak %75’inden sorumludur (18). Melanom insidansı diğer kanser formları ile kıyaslandığında, çok hızlı bir ivme gösterdiği (son 30 yıl içerisinde %237 kadar) bilinmektedir. Dünya Sağlık Örgütü verilerine göre yılda 132.000 yeni malign melanom vakası oluşmaktadır. En çok vaka Avustralya’da gözlenmektedir. Avustralya’daki insidans oranı 40/100.000 kişi iken, bu oran Kuzey Avrupa ülkelerinde ise 5/100.000 kişidir. Genel olarak tüm Avrupa’daki melanom insidansı ise 12/100.000 kişidir. Yaşam süresi boyunca melanom gelişme riski her yerde farklıdır, Avustralya’da bu risk %4 iken, Amerika ve Avrupa’daki ülkelerde ise bu risk %0,5 ile %1 arasında değişmektedir (19). Türkiye’nin de içinde bulunduğu Avrupa ülkelerindeki malign melanoma insidansının hesaplandığı GLOBOCAN araştırmasında, Türkiye’deki deri malign melanoma görülme aralığı 100.000 kişide 2.1 olarak bildirilmiştir (20). Diğer deri kanserleri, melanomdan yaklaşık olarak 20 kat daha sık görülebilmektedir. En sık görülen deri kanseri bazal hücreli karsinom, ikinci olarak görülen tür ise skuamöz hücreli karsinomdur. Bazal hücreli karsinom, skuamöz hücreli karsinomdan’dan yaklaşık olarak 4 kat daha sık görülebilmektedir (21). 9 Melanomun görülme olasılığı yaşla birlikte artan bir durumken genç yaşlarda ise (20-45 yaş arası) en üst noktaya ulaşır (22). SEER (Surveillance, Epidemiology, and End Results)’in 2014-2016 yılları arasında yaptığı çalışmanın sonuçlarında erişkinlerde, yaşam süresi boyunca malign melanoma gelişme riski yaklaşık %2.3 olarak tespit edilmiştir (23). Ultraviyole ışınlardan kaynaklanan maruziyetin artışı ve solaryum kullanımı nedeniyle genç kadınlarda malign melanom insidansında artış olduğu da bildirilmiştir. Malign melanomanın ortaya çıkması ile büyüme evresinde rol oynayan başlıca 3 ana risk faktörü vardır. Bunlar; çevresel olarak oluşan risk faktörleri, genetik olarak oluşan risk faktörleri ve gen-çevre etkileşimi ortaya çıkan fenotipik risk faktörleridir (Şekil 2.3.) (24). Çevresel ve genetik faktörler, DNA tamir mekanizmalarını bozabilen genetik mutasyonların birikmesine neden olur. Bu bozunmalar melanosit proliferasyonun oluşması, tümör invazyonu gerçekleşmesi, kan damarı oluşumları ve metastazların görülmesidir (25). Şekil 2.3. Malign Melanoma için risk faktörleri (26). Güneş yanığı, ışığa bağlı yaşlanma (fotoaging), bağışıklık sistemi sorunları, DNA hasarı ve deri kanserleri gibi potansiyel zararlı etkenler göz önüne alındığında, UV ışınlarından kaçınmak son derce önemlidir. Malign melanom oluşumu ve gelişiminde görülen son derece önemli olan çevresel risk faktörü ultraviyole radyasyonlarıdır. Aralıklı yada yoğun ultraviyole maruziyeti malign melanom oluşumu ve gelişimi için en önemli etkenlerden birisidir (27). Yeryüzüne ulaşan güneş ışığı iki tür zararlı ışından oluşur, bunlar uzun dalga ultraviole A (UVA, 320-380 nm) ve kısa dalga olan ultraviyole B (UVB, 280-320 nm) 10 olarak bilinirler. Derimiz için, UVA ışınları derinin en kalın tabakasına kadar yani dermise etki edebilirken UVB ışınları ise sadece epidermise kadar etki edebilir (Şekil 2.4.). Ultraviyole ışığın sebep olduğu deri hasarları genellikle fotosensitize işlemler tarafından oluşturulan serbest (singlet) oksijenler, süperoksit anyonlar ve hidrojen peroksitler gibi ROS (reaktif oksijen türleri) tarafından kaynaklandığı bilinmektedir (28). UV radyasyonu tarafından meydana gelen ROS, sadece deride doğrudan oksidatif hasara neden olmaz, bunun yanında hücre içindeki "serbest" demirde de ani artışlara neden olur. Serbest demirdeki ani artışlar ROS'un protein, lipid ve DNA'daki oksidatif reaksiyonlarda bir katalizör gibi davranış göstererek zararlı etkisini arttırdığını gösterir. Serbest demir, redoks döngüsüne hücre indirgeyici ajanların varlığında katılarak spesifik biyolojik hasarlar meydana getiren ilave ROS'un oluşmasına sebep olur. Bu sebeplerden dolayı demir katalizli oksidatif hasar önlenemeyecek durumlar oluşturmaktadır. Işınlanmaya maruz kalındıktan sonraki ilk birkaç saat boyunca demir hücre oksidatif hasarını şiddetlendirici kritik bir etki süresine sahiptir (29). Şekil 2.4. UVA ve UVB ışınlarının insan derisi üzerindeki etkisi (28) Ultraviyole maruziyeti çok kısa süreli olsa bile ROS'un hücre içerisinde mevcut olduğunu unutmamak gerekir. Hücrelerde mevcut olan ROS ilave fotosensitize olmamış mekanizmalar tarafından üretilmektedir. Bu durumun sebebi, NADPH oksidaz gibi enzimatik sistemlerin süperoksit radikaller üreten aktivasyonunun 11 olmasıdır. Hücredeki fazla ROS üretimi, iltihap oluşturucu maddelerin sentezini sağlayan sinyal iletim süreçlerini başlatır. Ayrıca ferritin sentezini de kapsayacak şekilde strese adaptif cevap oluşturan yeni gen ürünlerinin oluşumunu sağlar (28). 2.3.2. Melanomadaki Genetik Faktörler Malign melanoma, hücre sikluslarındaki proto-onkogenlere yeni özellikler kazandıran mutasyonlar ve tümör baskılayıcı genlerindeki fonksiyonların kaybıyla sonuçlanan mutasyonlardan oluşmaktadır (25, 27). Bir çok kanser tipinde yaygın olduğu gibi malign melanoma kanserinde de protoonkogenlerin mutasyonlar sonucu onkogenlere dönüşmesine ek olarak, tümör baskılayıcı genler çalışmaktadır. Melanomagenezdeki onkogenlerden olan BRAF, NRAS, KIT aktif duruma geçerken, tümör baskılayıcı genlerden CDKN2A, p53 ve PTEN ise inaktiv duruma geçmektedirler (30). Hücre büyümesi ve bölünmesi için negatif bir düzenleyici olan CDKN2A genindeki sporadik ve germline olarak görelen mutasyonlar ile hücre döngüsündeki pozitif düzenleyicilerin aktivasyonu sonucu melanoma oluşumu görülmektedir. CDKN2A geni hücre döngüsünü yavaşlatabilen ve apoptozis mekanizmasında görev alan p14ARF ve p16INK4a proteinlerini kodlar. P16INK4a ise CDK4/6 yapısına bağlanarak bu yapıyı inhibe etmektedir (31). Bunun sonucunda tümör baskılayıcı proteinlerden olan RM-1 (retinablastoma), CDK4/6 tarafından fosforile edilemediği için P16INK4a proteininde görülen fonksiyon kayıplarına ek olarak hücre büyümesi ve bölünmesi döngüsünde hasarlar ortaya çıkar ve bu hasarlar tümör gelişimini hızlandırır (31). P14ARF, MDM2 proteinine bağlandığı zaman MDM2 proteinini parçalayarak p53’ün dengelenmesini sağlar. Yani p14ARF proteini MDM2’yi aktivasyon durumuna geçirerek p53 proteinin negatif olarak düzenlenmesini sağlar. P16INK4A proteini ve p14ARF proteininin inaktivasyonları sonucu p53 proteini de inaktive olur ve bu durum melanoma oluşum ve gelişiminde çok önemli bir basamak olarak görülmektedir (32). c-KIT reseptör tirozin kinaz, melanogenez oluşum sürecinde MAPK sinyal yolağını aktifleştirerek hücre çoğalmasında rol almaktadır. MAPK sinyal yolağı RAF, RAS, ERK, MEK proteinlerinin çeşitli fonksiyonlara sahip olduğu, hücre büyümesi ve hücre çoğalmasından sorumlu olan bir sinyal yolağıdır (25, 27). Malign melanom 12 tümörlerinde RAF ve RAS mutasyonları etkin bir şekilde görülmektedirler. RAF kinaz ailesinin bir üyesi olan BRAF geni mutasyonlarına erken melanoma evrelerinde sık bir şekilde rastlanılmaktadır (33). BRAF mutasyonlarının keşfedilmesi malign melanom çalışmalarında önemli ilerlemeler sağlarken, yeni tedavilerin geliştirilmesine de öncülük etmektedir (27). Şekil 2.5. Melanoma Sinyal Ağı: Melanomanın oluşmasında ve gelişmesinde görev alan 3 ana mekanizmanın gösterilmektedir (34). 2.4 Apoptoz Apoptoz organizmada hasara uğramış ya da görevini tamamlamış hücrelerin çevresindeki diğer hücrelere zarar vermeden yok edildiği, genetik olarak kontrol , metabolizmadaki homeostazı koruyan, programlanmış hücre ölümü denilen biyokimyasal bir olaydır. Apoptoz için enerjiye ihtiyaç duyulur. Homeostatik bir mekanizma olan apoptoz dokulardaki hücrelerin devamlılığını sağlar, bununla birlikte çeşitli hastalıklar durumunda ya da zararlı ajanların hücrelere zarar verdiğinde immün reaksiyonlara benzeyen bir savunma mekanizması oluşturur. Hücre içinde oluşan stres artışı, hücre içi kalsiyum oranının değişmesi, reaktif oksijen türlerinde oluşan artış gibi 13 sebepler sonucunda hücre dengesini kaybedip apoptoza gider. Bu olayların kontrol edilememesi sonucunda hücre içinde oluşan düzensizlik, olası genetik bozulmalar ve hatta kanser oluşumunun görülmesi ile sonuçlandığı için apoptoz bu tarz hücreleri yok ederek organizmanın genel korunumunu sağlar (Şekil 2.6.) (35). Şekil 2.6. Apoptozis ve kanser (36) Apoptoz mekanizmasının çalışma aşamları; ilk olarak apoptozun başlatılması, daha sonra hücre içi kaspazlarında (proteazlar) aktivasyonun oluşması, hücrede çeşitli biyokimyasal değişikliklerin meydana gelmesi ve son adım olan fagositoz ile birlikte dört aşamadan meydana gelir. Hücre tarafından harekete geçirilen genetik mekanizma hücrenin apoptoza gitmesini sağlar. Bu süreçte apoptoz için hücre içi veya hücre dışı oluşan sinyallerden sonra hücrede morfolojik ve biyokimyasal değişimler meydana gelir. Hücre içi kaspazların aktivasyonu, hücre içi ve hücre dışı oluşan sinyallerin yardımıyla sağlanır (Şekil 2.7.). Meydana gelen uyarılarla sonucunda hücre, yapışık olduğu zeminden ve etrafındaki hücrelerden ayrılarak küçülmeye başlar. Küçülen hücreler kondanse olur, hücre iskeleti parçalanır, çekirdek zarının bir bölümü erir ve çekirdeğin DNA’sı parçalarına ayrılır. DNA fragmantasyonu ve hemen ardından kromatin kondensasyonu ile süreç devam eder. Süreç devam ettikçe membran ile 14 çevrili olan veziküller görülür ve bu veziküller, fagositler ya da komşu hücreler tarafından fagosite edilir. Bir saniye içinde bir milyon kadar hücremiz apoptoz mekanizması tarafından vücuttan uzaklaştırılmaktadır. Mitoz ile bu hücrelerin yerine yeni hücreler yapılmaktadır. Mitoz (yapım) ile apoptoz (yıkım) arasında kontrollü bir denge durumu vardır. Homeostazi çok hücreli canlılarda, mitoz ve apoptoz arasındaki denge ile sağlanır. Bu denge durumunun apoptoz lehine ya da aleyhine gitmesi sonucunda birçok hastalık oluşur. Mekanizmada ortaya çıkan bir aksaklık apotozun inhibisyonuyla sonuçlanıp neoplastik hücrelerin kontrolsüz bir şekilde artmasına ve tümör hücrelerinin de bağışıklık sisteminden kaçmasına neden olabilmektedir. Apoptozun aktifleştiği durumlarda ise hepatit C enfeksiyonu, AIDS, nörodejeneratif hastalıklar, insülin bağımlı diyabet, ateroskleroz, miyokard enfarktüsü, gibi hastalıklar görülebilir. Tüm bu sebeplerden dolayı bu denge vücudumuz için büyük önem taşımaktadır (37). Ayrıca radyoterapi ve kemoterapinin apoptozu tetikleyerek etkilediği bilinmektedir, apoptoza yönelmeyen kanser hücrelerinde terapiye yanıt alınamıyabilir. Bu nedenle apoptoz mekanizmasına karşı kanser hücrelerinin oluşturduğu direnç büyük bir problem oluşturmaktadır. Tüm bu bilgilerin ışığında hücrelerin hangi yollarla veya sebeplerle hücre ölümüne karşı direnç kazandığı ve apoptoz yolağında oluşan bozulmaların kansere nasıl sebebiyet verdiğini anlamak çok önemli bir noktadır. Apoptoz mekanizmasının yeterince aydınlatılması mevcut tedavi yöntemlerinin geliştirilmesine katkı sağlayabilir (38). 15 Şekil 2.7. Apoptoz mekanizması (39) Apoptoz dışında bilinen bir başka hücre ölüm yolu da nekrozdur (Şekil 2.8.) . Nekroz mekanizmasında ise hücre zarı veya hücre içindeki metabolik süreçlerin hasar görmesi durumunda zarın geçirgenliği ve işlevi bozulur. Bunun sonucunda hücre şişmeye başlar, daha sonra hücre membranı patlar ve hücrenin içinde bulunan maddeler dışarıya doğru dağılır. Böylece inflamasyon uyarılır. Nekroz mekanizmasına uğrayan hücreler, biyolojik bir kaza sonucunda ölümle sonuçlanan patolojik bir yola girerler (40). 16 Şekil 2.8. Nekroz ve apoptozun karşılaştırılması (41). Bir hücrenin nekroza ya da apoptoza gideceği gelen sinyalin tipine veya seviyesine bağlıdır. Radyasyon, sıcaklık, sitotoksik antikanser ilaçları ve hipoksi gibi uyaranlar düşük dozda apoptoza, yüksek dozda ise nekroza sebep olabilmektedir. Apoptoz kanser ile bağlantılı olup, kaspazlar olarak bilinen bir grup sistein proteazın aktivasyonuna ve enerjiye gereksinim duyan bir süreçtir. Hücrede proapoptotik proteinlerin, antiapoptotoik proteinlere göre oranı daha yüksek düzeyde ise hücre apoptoza yatkındır. Bunun tam tersi durumunda antiapoptotik proteinlerin oranı daha fazla ise hücre apoptoza daha az yatkındır. Proapoptotik üyeler; BAK, BAX, BAD, BİD, BOK/MTD, BİM, NOXA, HRK, PUMA, p53 olarak sıralanabilir. Antiapoptotik üyeler ise BCL-W, BCL-XL, BCL-2, BCL-B/BCL-2L10, Al/BF-1 ve MCL-1, olarak sıralanabilir. Hücrenin apoptoza gitme durumu, hücre içi BCL-2/BAX oranının seviyesine göre değerlendirilir. Hücrede BAX oranın yüksek olduğu durumlarda apoptoza gidilir. Eğer hücrede BCL-2 oranı daha fazla ise apoptoza gidilmez. Aşırı miktarda BCL-2 ifadesinin, melanoma hücrelerinde TRAIL’in indüklediği apoptozu inhibe ettiği, tümör malignite derecesinde artışa sebep olduğu anlaşılmıştır (35). p53 proapoptotik bir proteindir. DNA koruyucusu ve tümör baskılayıcısı olarak görev yapar (40). Kaspaz 3, 7, 8 ve 9 enzimlerinin aktivasyonunu sağlayarak apoptoz 17 mekanizmasını uyarır. Böylece malignant oluşumu durdurulur. DNA veya hücre hasar gördüğü zaman p53, DNA’da belli genlerin aktivasyonuna (Apaf-1, Fas, BAX ), belli genlerinde baskılanmasına (BCL-XL, BCL-2) sebep olarak apoptoz mekanizmasını etkiler (40). Kanserde en sık rastlanan genlerden biri olan p53 (%50-55) mutant genidir. Normal hücrelerde DNA hasarı meydana geldiği zaman bununla birlikte p53 seviyeside artar. Artan p53 seviyesiyle, hücre siklusu bölünmesinin kontrol noktalarından biri olan G1’i durdurarak DNA tamiri için hücreye ekstra zaman kazandırır. Bu sürede hasarın tamir edilmemesi durumunda bile hücre apoptoza gidebilir (42). Ancak hasarlı hücrelerde p53 proteini mutantsyon geçirirse, hücre bölünmesinde G1 fazında duraklama olmaz, tamir için yeterli süre de sağlanmadığı için G1 fazından sonra oluşan S fazında hata oranı iki katına çıkar. Apoptozun belirlenmesinde belli başlı yöntemler kullanılmaktadır; agaroz jel elektroforezi, giemsa boyama, hematoksilen-eozin boyama, elektron mikroskopi, faz kontrast mikroskopi, TUNEL yöntemi, floresan mikroskopi, kaspaz 3-7 yöntemi, ELIZA yöntemi, flow sitometri ve western blotting olarak sayılabilir (43). 2.4.1. Apoptozda Görülen Morfolojik Değişiklikler Apoptoz başlatıcı sinyal yolakları aktif olduğu sürece hücre içindeki kalsiyum hücre dışına gönderilir ve hücredeki ATP’nin tamamı kullanılır. Hücre zarı patlamadan hücre küçülmeye doğru gider. Çekirdek zarına doğru kromatinler ilerlemeye başlar. Sırasıyla, yüzeydeki organellerin kaybı, sitoplazmik baloncukların görülmesi ve apoptotik cisimlerin oluşmasıdır. Hücreler apoptozun başlaması ile ilk olarak komşu hücrelerle olan temaslarını kaybederler ve ardından yuvarlaklaşır. Hücreden hücreye bu durumlar farklılık gösterebilir. Fakat çoğunlukla çekirdek büzüşür ve düzensizleşir. Kromatinler yoğunlaştıktan sonra parçalar halinde toplanmaya başlarlar. K+, Na+, Cl- pompalarında ve iyon kanallarında aktivasyon sistemi durur. Bunun sonucunda hücre içi ve hücre dışı arasındaki sıvı hareketi gerçekleşmez, hücreler tutunma bölgelerinden apoptozun başlamasından hemen sonra ayrılır ve büzülmeye başlarlar. Apoptozda görülen morfolojik değişiklikler (Şekil 2.9.)’da belirtilmiştir (44). 18 Şekil 2.9. Apoptozda oluşan morfolojik değişiklikler (44) 2.5. MAPK Sinyal İletim Yolağı ve BRAF Mutasyonu MAP kinaz (mitogen-activated protein kinases) ailesi serin, treonin ve tirozine özgü bir sinyal yolağıdır. Tüm hücrelerde bulunur ve bilgilerin hücre zarından çekirdeğe kadar aktarılmasında rol alır. Ayrıca MAPK sinyal yolağı RAF, RAS, ERK, MEK proteinlerinin fonksiyonel olarak çalıştığı, embriyogenezis, yaşama, poliferasyon, farklılaşma ve apoptozis olaylarının düzenlenmesinde görev alır (25, 27, 45). Tümörlerde sıkça görülen RAF, RAS ailesi mutasyonları sebebiyle MAPK sinyal yolağı aktiftir. İnsan tümörlerinin yaklaşık olarak %30’unda MAPK sinyal yolunun yoğun aktivasyonu görülüp melanomda ise bu oran yaklaşık olarak %90’dır. RAS ve RAF’ta görülen mutasyonlar bu yoğun aktivasyonun sorumlusu olarak bilinmektedir (45). RAS ve RAF protoonkogen olarak bilinirler. Dinlenme durumundaki hücrelerde RAS proteinleri inaktif durumda bulunurlar. Hücrelere sinyal gönderilmesi ile aktif duruma geçen bu proteinler sinyali hızlıca başlatırlar. Aktivasyon durumuna geçen RAS proteinleri, RAF kinazlara bağlanırken yüksek bir afinite gösterirler ve RAF kinazların hücre membranında yerleşmesini sağlarlar. Bu aktivasyonların ardından sırasıyla MEK ve ERK’in aktifleşmesi meydana gelir ve oluşan sinyal çekirdeğe iletilir. RAF kinaz’ın inhibitörleri birçok farklı kanser ve melanomda kullanılmaktadır (46). RAS kinaz üyesi olduğu bilinen BRAF mutasyonlarının keşfedilmesi melanom çalışmalarında ilerleme ve yeni tedavilerin bulunmasında çok önemli katkılar sağlamıştır (25, 27). BRAF geninin kodladığı bir serin/treonin kinaz proteini olan BRAF, MAPK/ERK sinyal gönderim yolağında görev alan Raf kinaz ailesine üyedir. Hücre bölünmesi ve hücre farklılaşması olaylarında görev alır. BRAF geninde ortaya çıkan mutasyonlar melanomun da içinde bulunduğu çoğu kanser türünde önemli roller oynamaktadır. BRAF geninde en çok görülen mutasyonlar nokta mutasyonlarıdır (47). Yapılan kanser çalışmalarında melanom hücrelerinin yaklaşık %60’ında aktif 19 durumda BRAF mutasyonu saptanmıştır (48). Normal olarak BRAF geni hücre büyüme sinyallerinin cevaplanmasında diğer RAF kinaz üyeleri ile homo- heterodimerizasyon durumunda bulunmaktadır. Fakat aktive edici bir mutasyon ile birlikte, BRAF sürekli kendi kendine yetebilen aktif monomer durumuna dönüşür. Tüm bu süreçlerin sonucunda ortaya çıkan kontrolsüz hücre çoğalması, tümör oluşumu ile büyümesi ve gelişmesinde rol oynamaktadır. BRAF’ın aktivasyon gösterdiği mutasyonların %90’ında glutamik asidin valin yerine geçerek V600E mutasyonu göstermesi ve bu mutasyonun tüm melanom vakalarının yaklaşık olarak %60’ını oluşturduğu bilinmektedir (48, 49). Melanom metastazlarındaki aktif BRAF varlığı, bu mutasyonun sürekli olarak hücre büyümesini stimüle ettiğini göstermektedir. Tüm bunların sonucunda, melanoma hastalarında gözlenen bu yüksek BRAFV600E oranı, anti-melanom tedavileri için potansiyel hedef olarak görülebilir (50). 2.6. Melanomda tedavi Kanserdeki tedavi yöntemleri hastaya bağlı olarak değişkenlik gösterir. Bu değişkenlikler hastanın cinsiyetine, yaşına, etnik kökenine, sosyoekonomik durumuna, aile geçmişine, herhangi bir mutasyonun gözlenip gözlenmediği, daha önce kanser geçmişi olup olmadığına, bir otoimmun hastalığının bulunup bulunmadığına, kanserin evresine ve kanserin köken aldığı dokuya göre belirlenir. Bazı durumlarda ilk olarak tümörün küçülmesi için ameliyat öncesinde kemoterapi uygulanmaktadır ve daha sonra kullanılmak istenen yöntem ise cerrahi müdahale ile kanser kitlesinin vücuttan uzaklaştırılmaya çalışılması işlemidir. Daha sonra ise kemoterapi ve radyoterapi yöntemlerine başvurulur, immunoterapi ve hedeflenmiş tedavi (hasta odaklı tedavi, hastada gözlenen mustasyon ve diğer durumlara göre o hastaya özgü tedavi yöntemleri belirlenebilir) yöntemleri de destek tedavi olarak uygulanabilmektedir (51). Kanser hastalığında yaygın olarak kullanılan yönetemlerden birisi kemoterapidir. Kemoterapi kanserin ilaç ve kimyasal maddeler ile tedavi edilmesi sürecidir. Kemotarepi, hücrelerin biyokimyasal süreçleri hedef alınarak hücrelerin poliferasyonunu engellemek, normal hücrelere zarar vermeden önce anormal hücreleri etkisiz hale getirmek, metastaz olasılığını düşürmek ve tümör gelişimini durdurmak için kullanılır . Kemoterapide kullanılan ilaçlar DNA alkilleyici ajanlar, topoizomeraz inhibitörleri, mitotik inhibitörler, anti-tümör antibiyotikler ve kortikosteroidlerdir (52). 20 BRAF mutasyonu için kullanılan BRAF inhibitörleri pozitif hastalarda metastatik melanoma tedavisi için çok önemli gelişmeler sağlamıştır. BRAF mutasyonunun tedavisinde kullanılan bu inhibitörler daha sonra BRAF-MEK mutasyonları için de ikili ajan kombinasyonları olarak kullanılmaya başlanmıştır. BRAF mutasyonu inhibitörleri olan Vemurafenib ve Dabrafenib malign melanom olgularında antitümoral etkinlik göstermiş olup ve FDA tarafından kullanım onayları alınan ilaçlardır. MEK inhibitörleri olan Trametinib ve Cobimetinib ise 2013 yılında tek ajan inhibitörleri olarak FDA tarafından onay almışlardır (49). Vemurofenib ve Dabrafenib tedavileri Dakarbazin tedavisiyle kıyaslandığında malign melanom olgularında önemli ölçüde kanser progresyonunu durdurduğu, hastaların genel sağkalımını artırdığı gözlemlenmiştir. Ayrıca BRAF inhibitörleri MEK inhibitörleri ile kombine edildikleri aktivasyonlarda MAP kinaz sinyal yolağında inhibisyonu desteklediği ve genel sağkalımı önemli bir derecede artırdıkları gözlemlenmiştir. BRAF-MEK inhibitörleri arasındaki kombinasyon dabrafenib- trametinib ve vemurofenib-cobimetinib şeklinde yapılıp melanom tedavisinde geçerli standart bir tedaviye dönüşmüştür (53). Melanom tedavisinde BRAF ve MAPK inhibitörlerinin gösterdiği umut verici gelişmelere rağmen, MAPK yolağındaki aktivasyonlara bağlı olarak oluştuğu düşünülen bir takım mekanizmalar sonucunda bu ilaç ve ilaç kombinasyonlarına karşı direnç gelişebilmektedir (54). 2.6.1. Vemurafenib Vemurafenib BRAF mutant kinazlara karşı güçlü bir inhibitörüdür. Mutant form BRAF’ın inhibisyonunu sağlayarak etki gösterdiği için, Vemurafenib melanomdaki BRAF mutasyonları için önemli ölçüde özgüllük sağlamaktadır. İlk defa kanser tedavisi alacak olan 675 hastada, Vemurafenib ve Dakarbazin’in etkinliği karşılaştırılmış ve çalışmanın sonuçlarına bakıldığında Vemurafenib’in, toplam sağkalım ve toplamda en iyi cevap süresi açısından Dakarbazin’e göre oldukça üstün sonuçlara sahip olduğu gözlemlenmiştir (49, 55). Yapılan klinik çalışmaların sonucunda, Vemurafenib’in oldukça etkili ve hastalar tarafından iyi bir şekilde tolere edilebildiği gösterildiği için 2011 yılında FDA tarafından, BRAFV600 mutasyonlu melanom hastalarında kullanım onayı verilen bir ilaç olmuştur (55). 21 Şekil 2.10. Vemurafenib çalışma mekanizması 2.6.2. Dabrafenib Dabrafenib, Vemurafenib’in etki mekanizmasına benzer aktivasyonu olan bir ilaçtır. BRAFV600E mutasyonuna sahip 250 melanoma hastası üzerinde yapılan bir çalışmada, Dabrafenib ile Dakarbazin ilaçlarının etkinlikleri karşılaştırılmıştır ve elde edilen verilere göre Dabrafenib’in daha güvenli ve etkili olduğu anlaşılmıştır. Aynı zamanda sağkalım açısından değerlendirildiğinde Dakarbazin’den daha üstün olduğu anlaşılmıştır (54). 2.6.3. Trametinib Trametinib, BRAFV600E mutasyonuna sahip ileri evre melanom hastalarında anlamlı sonuçlar gösteren bir MEK inhibitörüdür. Etki mekanizması Vemurafenib ve Dabrafenib’den farklılık gösteren bir ilaçtır. Tramatenib’in etki mekanizması, MEK ekstraselüler sinyal-düzenleyici kinazlarda oluşturulacak inhibisyon ile BRAF’ın baskılanması esas alınmıştır (55). Trametinib’in tek ajan hedefli olarak kullanıldığı tedavilerde ve Vemurafenib ile kombinasyon şeklinde kullanıldığı tedavilerde etkinliği gözlemlenmiştir (56). 22 Şekil 2.11. Dabrafenib ve Trametinib inhibitörlerinin çalışma mekanizması 2.6.4. Dakarbazin Dakarbazin melanoma tedavisinde öncelikli olarak kullanılan kemoterapi ilacı olarak bilinir. Dakarbazin için tıbbi kullanım onayı 1975 yılından bu yana Amerika Birleşik Devletleri'nde alınmıştır. Dünya Sağlık Örgütü’nün ilaç listesinde bulunan bir ilaçtır (57). Dakarbazinin etki mekanizması iki şekilde çalışmaktadır; birinci etki mekanizması DNA replikasyonunu baskılama iken ikincisi alkilleyici ajan olarak normal DNA yapıları ile reaksiyona girip zincir kırıklarına neden olmaktır (58). Ayrıca p53 genini aktivite ederek melanoma hücre ölümlerini arttırmaktadır. Melanoma tedavilerinde ilaç ajanı olarak Dakarbazin’in kullanıldığı tedavilerde yaklaşık olarak %24 oranında küçülme görülmüştür (58). 2.7. Tirozinaz Enzimi Melanin pigmenti çeşitli biyolojik çalışma fonksiyonlara sahiptir. Bunlar arasında en çok bilinenler, antitümör, antioksidan ve antiviral aktiviteleridir. Sahip olduğu radyasyon koruyucu özellikler nedeniyle çok kuvvetli bir UV filtresi görevi göstermektedir (59). Melaninlerin bir çok türü oldukça geniş aralıklarda elektromanyetik dalgalar ile benzersiz bir etkileşime girme kapasitelerine sahiptirler. Bu sebepten dolayı enerji 23 toplayıcı ve koruyucu bir pigment olarak kendini göstermektedir. Radyoaktif olmadığı bilinen fotonların dağılımını sağlarken ve bunun sonucunda da serbest radikallerin temizlenmesinde etkilidir. Metaller ile çok güçlü bir şekilde şelatlama yapabilir. Bu işlemin sonucunda da hücreler kendilerini toksik metal iyonlarının etkisinden korurlar (60). Melanin pigmenti özellikle kozmetik uygulamalarında sıkılıkla kullanılır. Deri kusurlarının giderilmesinde, cilt tonunun eşitlenmesinde ve özellikle saç beyazlamasının sürecinin durdurulmaya çalışılması işlemlerinde melanin ve melanin öncülleri çeşitli formulasyonlarda kullanılmaktadır (61). Yüksek antioksidan kapasitesi sebebiyle de oksidatif stresten koruyan bir biyomakromalekül olmasından dolayı farmasötik alanı için önemli bir biyopolimerdir. Melanositler, melanoblast olarak bilinen pigmentsiz, renksiz ve embriyonik nöronal krest hücrelerinin evrilmesinden oluşurlar (62). Melanositler derideki keratinosit tabakasının içerisinde gömülü olarak bulunurlar (Şekil 2.12.) (61). Şekil 2.12. Melanositler, melanozomlar ve deri içerisinde konumları (61). Melanin üretilmesi süreci olarak adlandırılan melanogenez; melanositlerde oluşan enzimatik ve kimyasal reaksiyon süreçlerinden oluşmaktadır. Bu sürecte ise bir çok farklı hücre sinyalizasyon yolağı düzenleyici olarak katılmaktadır. Melanin üretiminde temel olan üç önemli yapıtaşı; tirozinaz enzimi, dopakrom tatomeraz ve tirozin-ilişkili protein-1 olarak adlandırılan enzimleridir (63). Ancak bunların arasında; tirozinaz enzimi melanin üretiminde kilit bir noktadadır. Ayrıca tüm sürecin hız kısıtlayıcı basamağıda tirozinaz enzimidir. L-tirozin amino asidinin Dopakinon’a veya L-DOPA’ya oksidasyonu ile melanin sentezi başlamaktadır. Bu dönüşüm aşaması çok kritiktir ve bu aşamada 24 meydana gelen her hangi aksamada, melanin üretim sürecinde de aksamaya ve inhibisyona sebep olmaktadır (64). Şekil 2.13. Melanin pigmentinin biyosentetik yolağı (65) Polifenol oksidaz (PPO) sınıfına ait enzimlerden olan tirozinaz enzimi, bitkiler, hayvanlar, funguslar ve diğer mikroorganizmalarda bulunmaktadır. Günümüze kadar en iyi şeklide tanımlanmış ve yapısı ayırt edilmiş polifenol oksidaz enzimleri arasındaki tirozinaz enzimi ilk sırada kendine yer bulmaktadır. Tirozinaz enziminin aktif bölgesinde bulunan iki tane bakır atomu reaksiyonlarda önemli bir role sahiptir (66). Tirozinaz enzimi çift yönlü olarak reaksiyonu katalizler; monofenolaz aktivitesindeki mono-fenollerin o-hidroksilasyonunu ve difenolaz aktivitesindeki o- difenollerin o-kinonlara oksidasyonunu sağlamaktadır (67). Tirozinaz hemen hemen tüm canlı yapılarda bulunan ve organizmanın türünü esas alarak farklı fizyolojik görevler üstlenen bir enzimdir. Tirozinaz enzimi omurgalı canlılar ve funguslarda melanin pigmentinin üretilmesinden sorumludur. Bitkilerdeki yaralanma ve doku hasarlarında ise fenolik bileşiklerin enzimatik olarak kararmasından dolayı kahverengileşmeye sebep olmaktadır (68). Melanin üretiminin bitkilerde bir tür stres adaptasyonu sağladığı bilinmektedir. Bu adaptasyonun aynı zamanda bitkisel bağışıklık sisteminin bir yanıtı olduğu bilinmektedir. Tirozinaza bağlı olarak gıdalarda normal rengi dışında kararmalar oluşabilir. Bu durumun nedeni tirozinaz aktivitesidir. Bu tür durumlar tüketiciler ve üreticiler 25 tarafından istenmemektedir. Gıda sektörünün maruz kaldığı en önemli sorunlardan bir tanesi de tercih edilmeyen bu tür gıdalardır. Böyle bir durum için çözüm olarak tirozinaz inhibitörleri kullanmaktadır (69). 2.7.1. Tirozinaz İnhibisyonları Tirozinaz enziminin kontrol altına alınmaya çalışılması bir çok alanda ihtiyaç duyulan bir arayıştır. Bu arayışın başlıca nedenleri tarımsal ürünlerinin uzun süre saklanma ihtiyacı, zirai böceklerle mücadele, özellikle kozmetik alanlarında deri beyazlatıcı ürün ve estetik amaçlı kullanılabilecek formulasyonların geliştirilmesi gibi arayışlar diğer alanlara göre daha fazla olmaktadır (70). Tirozinaz ile melanogenez inhibitörleri arasında önemli farklar bulunmaktadır. Bir molekülün tirozinaz inhibitörü olarak kabul edilmesi için DOPA ya da Tirozin varlığında dopakrom oluşumunun inhibisyonunun sağlanması gerekmektedir (71). Mantar tirozinaz enzimi (Agaricus bisporus) olarak bilinen ve izole edilen bu enzim çalışmalarda en çok kullanılan enzim türüdür. Ancak memeli tirozinaz enzimi ile mantar tirozinaz enzimi arasındaki işlevsel ve yapısal farklılıklar sebebiyle kozmetik ve özellikle de farmasötik alanda kullanılmak istenen maddelerin aktivite çalışmalarında aldatıcı sonuçlar da görülebilmektedir (72). Memeli tirozinaz enzimi glikoprotein yapıdadır ve pek çok hücre içi sinyal yolağı ile sürekli bir iletişim halindedir. Fakat mantar tirozinaz enzimi ise sitozol içerisinde serbest bir halde bulunmaktadır. Bu sebeplerden dolayı bilinen bu yapısal farklılıklar doğrultusunda mutlaka memeli hücre kültürlerinin laboratuvar çalışmalarında tirozinaz enzim aktivitesi ve sitotoksisite deneylerinin yapılması yeni etkili moleküllerin bulunmasında en güvenli yöntemlerden birisi olarak görülmektedir (73). Inhibisyon mekanizmasının yanı sıra inhibisyon gücü olarak bilinen ve enzim aktivitesinin yaklaşık olarak yarısını inhibe etmekte kullanılacak madde konsantrasyonu (IC50) da inhibisyon için önemli bir değerdir. Bu değerler dorultusunda kendini kanıtlamış olan kojik asit, arbutin ve hidrokinon gibi moleküller değerli referanslar olarak kullanılmaktadır. (71). 26 2.7.2. Kojik Asit Kojik asit endüstrideki ticari uygulamalar sebebiyle son derece ilgi çekmekte ve kozmetik, kimya, gıda endüstrilerinde sık kullanılmaktadır. Ayrıca tıp ve tarım gibi çeşitli alanlarda çok önemli uygulamaları bulunmaktadır. Günümüzde Kojik asit, kozmetikte çok önemli bir yere sahiptir, en önemli uygulanma alanı ise UV radyasyonuna karşı cilt bakım ürünlerinde yer almasıdır. Bunun yanı sıra cilt beyazlatıcı kremler sabunlar, cilt koruyucu özellikli losyonlar ve diş bakım ürünlerinde ultraviyole ışınlara karşı koruyucu göreve sahiptir. Kojik asit, cilt pigmentasyonun ana enzimi olan tirozinaz oluşumunu inhibe eder. Böylece melanin oluşumunu sınırlayarak insan cildindeki hiperpigmentasyonu baskılama görevini yerine getirir (74). Elma, patates, pirinç ve bir çok kabuklu çeşidi ile farklı sebze ve meyvelerde polifenol oksidaz için inhibe edici bir aktiviteye sahiptir. Temelde enzimatik nedenlerle oluşan kararma için kullanılan oksijene etki ederek o-kinonları difenollere indirger ve melanin pigmenti oluşmasını engeller (75). Ayrıca Kojik asit’in ağrı kesici ve antiinflamatuvar ilaç olarak tıp alanında kullanılabilirliği öngörülmektedir. Kojik asitin kimyasal yöntemler ile yapılan sentezinde canlı hücrelerde serbest radikal üretimi görülmektedir. Böyle bir riskten kaçınmak adına Kojik asit üretimi için alternatif yöntemler seçilmektedir. Yapılan bu yöntemler güvenli ve toksik olmayan mikroorganizmalar tarafından gerçekleştirilen Kojik asit üretimine odaklanmıştır. Aspergillus türlerinin yaptığı aerobik fermantasyon sonucu üretilen Kojik asit, çoğu endüstride kullanılan en iyi tekniklerin başında gelmektedir. Kojik asit üretimi için kullanılan Aspergillus,Penicillium ve Mucor gibi 5’e yakın farklı mantar türü vardır (76). Şekil 2.14. Kojik asitin kimyasal yapısı (77). Ultraviyole ışıktan etkilenen insan cildi güneş yanığı, oksidatif stres ve cilt kanseri gibi önemli cilt hastalıklarına sebep olabilir ve bu şekilde oluşan hastalıklar UV ışığına maruz kalma miktarı ve yoğunluğuyla ilişkilidir. Kojik asit, hiperpigmentasyon etkisini tirozinaz inhibitör olarak sınırlama işlevine sahiptir ve 27 bununla birlikte bir UV koruyucu olarakta kullanılabilir. Önemli bir cilt açıcı olarak bilinen hidrokinonun (HQ) yan etkileri yüzünden Kojik asit kozmetik alanında daha tercih edilebilir bir konuma yükselmektedir (77). Bunun yanı sıra Kojik asit yüksek dozlarda irite edici ve toksik olabilmektedir. Bu yüzden yan etkileri en aza indirip etkinliğini arttırmak için Kojik asit türevleri sentezlenilmektedir. Kojik asit yapısı sebebiyle geniş biyolojik aktivitelere sahiptir. Bu nedenle tıbbi kimya araştırmalarında mükemmel bir yere sahiptir. Melanositler epidermisin alt katmanında bulunur ve melanin üretiminden sorumludurlar. Epidermal keratinositler içerisinde bulunan melanositler özgül dendritik hücrelerin bulunduğu kategoride sınıflandırılır ve melanozom olarak isimlendirilen bir organelde melanin üretiminde ana rol alırlar ve bu şekilde çevre keratinositlere yayılırlar. Melanositlerin her biri dendritik hücrelerin farklı derecelerinde melanozomlarla temas ederek birçok keratinositte dağılır. Karmaşık polimerler olan melaninler, tirozin ve diğer ara maddelerden üretilir. Çok kademeli bir oksidasyon sürecinden sonra siyah-kahverengi varyasyon olan eumelanin ve sarı-kırmızı varyasyon olan feomelanine dönüşürler (78). Tirozinaz, aktif bölgesinde bakır iyonlarına sahiptir. Cilt ultraviyole ışınlara maruz bırakıldığında bakır iyonları tirozinazın daha aktif forma geçmesini sağlarlar. Kojik asit; tirozinazı yavaş, etkili ve tersinir yarışmalı olarak enzimin aktif merkezindeki bakır iyonuyla şelasyon sonucu inhibe ederek melanin oluşumunu önlemektedir. Kojik asitin gerçekleştirdiği inhibisyon ile tirozinaz aktiviteleri önlenebilir (Şekil 2.15 ve 2.16) (79). Şekil 2.15. Melanin biyosentezinde KA'nın tirozinaz inhibitör mekanizması (80). 28 Şekil 2.16. Tiroznaz inhibisyonu aktivitesi (80). Melanin sentezinden sorumlu olan genlerinin transkripsiyonel inhibisyonunu sağlayan hücre içi sinyal aktivasyonunu veya inhibisyonunu düzenleyen ve bunların dışında tirozinaz inhibisyonuna sahip olan çok az bileşik vardır. Cilt rengini açan birçok bileşiğin, tirozinaz enzim aktivasyonunu inhibe ederek melanin sentezini önemli ölçüde azalttığı bilinmektedir. Ayrıca bu bileşikler melanositlerde düşük toksisite etkisi göstermektedir. Bu cilt rengini açan bileşiklerden birkaçının, hücre içi sinyal yollarında düzenleyici aktiviteye sahip olduğu ve melanosit hücre ölümünde de belli bir ölçüde artışa neden olduğu bilinmektedir (81). Melanomda melanositlerin farklılaşması ve proliferasyonu çoğunlukla epidermisin bazal hücre katmanında gelişir. Melanositlerin bu değişimi diğer organlara geçebilir (metastaz) ve o organların fonksiyonlarında bozulmalara sebebiyet verebilir. Melanom sürecindeki moleküler ve hücresel mekanizmaların daha iyi anlaşılması için, in vitro incelemelerde insan melanom hücrelerinin deri modelleri yaygın şekilde kullanılmaktadır. Hücre ölümünü düzenleyen anti-apoptotik mekanizmalar bu şekilde aydınlatılabilir. Tüm bu sebeplerden dolayı, tümör hücresi ölümüne neden olan sinyal iletim yollarının detaylı bilgisi, ilaç direncine karşı daha etkili ve melanom tedavisini daha ileriye taşımak için yeni hedef moleküller bulunabilir. Protein ve gen ekspresyonunda meydana gelen modifikasyonların dışında da enzimatik değişikliklerde melanomlarda melanogenezi tetikleyebilir. Melanogenez sentezindeki düzenleyicilerin kontrolü hormonlar, sitokinler, büyüme faktörleri ve nörotransmiterler tarafından aktivasyonu sağlanan reseptör aracılı yollardır. Kojik asitin etkisinin araştırılmasında A375 insan melanom hücrelerinde gen ve protein ekspresyon mekanizmasının incelenmesi ve kanser tedavisi üzerindeki etkisinin 29 araştırılması büyük önem taşımaktadır (82). Bu tez çalışmasında da Kojik asit türevi olan bileşiklerin in vitro deneyleri için A375 insan melanom hücreleri kullanılmıştır. Kojik asit türevi olan bileşikler çeşitli biyolojik aktivite göstermektedirler. Kojik asitin kendisi ve türevleri antiviral, antimikrobiyal, antidiyabetik, antikanser, antitümör (83), anti-parazitik ve böcek öldürücü faaliyetler olmak üzere çeşitli biyolojik aktiviteler göstermeleri sebebiyle giderek daha da önemli hale gelmiştir. Ayrıca Kojik asit ve türevleri antioksidan olarakta kullanılmaktadır, tirozinaz inhibitörlerinin aktiviteleri sebebiyle ilaç ve kozmetik ürünlerdeki antiinflamatuvar, anti-proliferatif, radyasyon koruyucu ve cilt aydınlatma ajanları en bilinenleridir (84). A375 insan melanoma hücreleri kanser tedavisinde kullanılarak Kojik asit ve türevlerinin genotoksisitesi incelenmiştir. Kojik asit ve türevlerinin konsantrasyonunun artmasıyla A375 hücrelerindeki büyümenin de direkt olarak inhibisyona uğradığı görülmüştür (85). Yapılan bir çok çalışmada A375 melanoma hücre hattında Kojik asit ve türevlerinin antikanserojen etkisini öğrenmek için Kojik asit ve türevlerinin uygulandığı A375 melanoma hücre hattında bazı proteinlerin kanser aşamalarında önemli roller oynadığı, bu nedenle malign melanomanın tanı ve tedavisinde belirleyici bir basamak olarak kullanılabilirliği fark edilmiştir (83). Bu tez çalışması kapsamında, üniversitemiz Eczacılık Fakültesi Farmasötik Kimya Anabilim Dalı öğretim üyesi ve proje araştırmacısı Prof. Dr. Mutlu Aytemir’in sentezlemiş olduğu kojik asit türevi bileşikler incelenmiştir. A375 insan malign melanoma hücrelerine karşı sitotoksik özelliği en kuvvetli bileşiğin malign melanoma hücresini hangi mekanizmalarla ölüme götürdüğü ve hücre içerisinde hangi moleküler ölüm yolaklarını tetiklediği araştırılmıştır. Bu amaçla, bu yüksek lisans tez çalışmasında, sentezlenen bileşiklerin A375 insan malign melanoma hücrelerinin canlılığı nasıl etkilediği araştırılmıştır. Sitotoksik etkisi en yüksek olan bileşik seçilerek lüminometrik bir yaklaşımla hücre canlılığı, hücre sitotoksisitesi, efektör kaspaz 3/7 aktivasyonları açısından etkinlikleri tayin edilmiştir. Aynı bileşiğin melanoma hücrelerinde tetiklediği ölüm yolağı akış sitometrisi ile belirlenmiştir. Bu amaçla A375 hücrelerinin RNA’sı izole edilerek ölüm mekanizmalarında rol alan genlerin (p53, Bax, Bcl-2, Jnk, Mdm2, Mdr1) ekspresyon düzeyleri incelenmiştir. Gen ekspresyon verilerini takiben apoptotik p53 proteininin ekspresyon düzeyi western 30 blotlama ile ölçülmüştür. Son olarak bileşiğin enzimatik tirozinaz inhibisyonu için B16F10 hücrelerinin sitozolü kullanılarak spektrofotometrik olarak belirlenmiştir. Tablo 2.2. Tez kapsamında kullanılan Kojik asit ve türevleri 31 32 3. GEREÇ ve YÖNTEM 3.1. Gereç 3.1.1. Hücreler A375 İnsan Malign Melanoma ve B16F10 Fare Melanoma hücreleri, Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu (ATCC) isimli firmadan temin edilmiştir. 3.1.2. Kitler ve Kimyasal Maddeler Tez kapsamında kullanılan kimyasal maddeler ve kitler tablo 3.1’de listelenmiştir. 33 Tablo 3.1. Kimyasal maddeler ve Kitler Kitler ve Kimyasal Maddeler Firma DMEM Yüksek Glikozlu (hücre kültürü ) Biological Industries, İsrail Fetal Sığır Serumu FBS (hücre kültürü ) Biological Industries, İsrail ApotoxGlo Triplex Assay Kiti (sitotoksisite) Promega, USA LOT: 0000300702 NucleoSpin® RNA izolasyon kiti (gen ekspresyonu) Macherey-Nagel, Almanya LOT: 1706/004 GScript First-Strand Synthesis Kit (gen ekspresyonu) Gene Direx, USA LOT: MB10860135 GoTaq® qPCR Master Mix (gen ekspresyonu) Promega, USA LOT: 0000300603 Bcl-2 primer antikor (Western Blotting) Bio Legend, USA LOT: B177370 Mdr1 primer antikor (Western Blotting) Chemicon International, Almanya LOT: 0605029843 P53 primer antikor (Western Blotting) Chemicon International, Almanya LOT: 22120968 Tyripsine EDTA %0,25 Bio.Ind (hücre kültürü ) Biological Industries, İsrail Penisilin/Streptomisin (hücre kültürü ) Biological Industries, İsrail L-glutamin (hücre kültürü ) Biological Industries, İsrail Sulforhodamine B (sitotoksisite) Santa Cruz Biotechnology, ABD LOT: DO714 DMSO (hücre kültürü) Merck, Almanya LOT: 67-68-5 Precision Plus Protein Marker (western blotting) BIO RAD, ABD LOT: 161-0374 (L-DOPA) (sitotoksisite) Sigma-Aldrich, Almanya LOT: MKBQ8894V Power® SYBR Green Master Mix ThermoFisher, ABD LOT: 4367659 FITC Annexin V (Flow sitometri) BioLegend, Japonya LOT: 640945 2X Laemmli Sample Buffer (western blotting) BIO RAD, ABD LOT: 161-0737 2-Mercaptoethanol (western blotting) Merck , ALMANYA LOT: TBF4973V Nu PAGE jel membran (western blotting) ThermoFisher, ABD LOT: 19021170-0745 Western Bright™ Sirius (western blotting) Advansta, ABD LOT: 160229-95 Western Bright™ Peroxide (western blotting) Advansta, ABD LOT: 160229-94 Protease Inhibitor Cocktail (western blotting) ThermoFisher, ABD LOT: 58715 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Reaction (western blotting) ThermoScientific, ABD LOT: RG131971 BCA Assay Standart (western blotting) Santa Cruz Tec., ABD LOT: F1014 BCA Assay Reagent A (western blotting) Santa Cruz Tec., ABD LOT: F1014 BCA Assay Reagent B (western blotting) Santa Cruz Tec., ABD LOT: F1014 34 3.1.3. Cihazlar A375 ve B16F10 hücrelerinin çoğalması için kullanılan inkübatör 37°C sıcaklık ve %5 CO2 içermektedir (Panasonic MCO-18 AC-PE, Japonya). Hücrelerin gözlemlenmesi için NIKON Eclipse TS100 (ABD) marka ışık mikroskobu kullanılmıştır. Hücre kültürü santrifüj işlemlerinde Hettich Rotina 35R D78532 (Almanya) adlı santrifüj cihazı kullanılmıştır. RNA izolasyonu gibi yüksek devirli işlemler için Hettich Universal 32R D78532 (Almanya) adlı santrifüj cihazı kullanılmıştır. Hücreler ve RNA örnekleri, yeniden kullanılmak üzere -86°C’lik derin dondurucu (Panasonic MDF-U5386S-PE, Japonya)’da muhafaza edilmiştir. SRB deneylerinde floresans ışıma ölçülmesi için FLUOstar® Omega adlı cihaz (BMG LabTech, Almanya) kullanılmıştır. RNA örnekleri için kullanılan jel elektroforez tankı Invitrogen (Amerika Birleşik Devletleri) markadır. ZOOM Dual Power Supply (Amerika Birleşik Devletleri) adlı güç kaynağı kullanılmıştır. RNA örneklerinin UV altında görüntülenmesi için ise Gel Logic 200 Imaging System adlı cihaz ve KODAK MI SE adlı programdan yararlanılmıştır. RNA saflaştırılması ve cDNA için gerekli istenilen sıcaklık periyotları, 96 kuyucuklu termal döngü cihazı (Applied Biosystems Veriti, ABD) tarafından yapılmıştır. Gen ekspresyon tayini ve analizi içinse Applied Biosystems ViiA™ 7 (ABD) markalı RT-PCR sistemi ile gerçekleştirilmiştir. Flow sitometri deneyi için, Hacettepe Üniversitesi Onkoloji Enstitüsü Temel Onkoloji Anabilim Dalı’na ait Flow sitometri (BD FACSCanto™ ll Flow Cytometer, BD Biosciences, ABD) ile gerçekleştirilmiş ve elde edilen sonuçlar BD FACS Diva Software yazılımı ile analiz edilmiştir. Protein örneklerinin jel elektroforezinde yürütülmesi için Invitrogen Novex Mini-Cell (Amerika Birleşik Devletleri) marka dikey jel elektroforez tankı ve ZOOM Dual Power Supply (Amerika Birleşik Devletleri) adlı güç kaynağından yararlanılmıştır. Jel trasferi için iBlot™ (INVITROGEN, USA) cihazından yararlanılmıştır. Protein örneklerinin Trans UV altında görüntülenmesi için BIO RAD Universal Hood II adlı cihaz ve BioRad Image LabTM Software adlı bilgisayar programı kullanılmıştır. Protein örnekleri için miktar tayini FLUOstar® Omega adlı (BMG LabTech, Almanya) cihaz ile yapılmıştır. 35 3.2. Yöntem 3.2.1. Hücre Kültürü Çalışmalarda kullanılan A375 ve B16F10 hücre hatları için, %1 penisilin/streptomisin, %1 L-glutamin ve %10 FBS içeren DMEM besin ortamı kullanılmıştır. Bu hücre hatları T75 hücre kültür flaskları içinde 37°C sıcaklık ve %5 CO2 içeren inkübatörde büyümeye bırakılmıştır. Hücrelerde gözlenen morfolojik özellikler ve büyüme durumları ışık mikroskobu yardımıyla gözlemlenmiştir (Şekil 3.1.) ve (Şekil 3.2.). 1.Gün 3.Gün 5.Gün Şekil 3.1. Işık mikroskobu altında gözlemlenen A375 hücreleri (10X). 1.Gün 3.Gün 5.Gün Şekil 3.2. Işık mikroskobu altında gözlemlenen B16F10 hücreleri (10X). Hücre Serilerinin Kültüre Edilmesi Çalışmalarda kullanılan hücreler için kullanılacak olan; %1 L-glutamin, %1 penisilin/streptomisin ve %10 FBS içeren içeren DMEM besi yeri su banyosunda 37 °C’ye getirilir ve daha sonra T75 kültür kapları için 13 mL besiyeri aktarılır. -80 °C 36 ‘deki saklanan hücreler 37 °C’deki su banyosunda hızlıca eritilip T75 kültür kaplarına aktarılır ve hücreler 37°C‘de, % 5 CO2 içeren inkübatörde kültüre edilir. Hücre Serilerinin Pasajlanması Hücreler kültür kabında yaklaşık % 80 ile % 90 doluluğa ulaştığında hücre kültüründeki kullanılmış eski besi vakumla çekilmiştir. Daha sonra hücrelerin bulunduğu yüzeye 1X % 0,25 tripsin-EDTA solüsyonu eklenerek hücreler kalkıncaya kadar (yaklaşık 3 dakika) 37°C inkübatörde bekletilmiş ve yapışan hücreler mikroskopta kontrol edilerek flasktan kaldırılmıştır. Tripsinin aktivasyonunu durdurmak için hücreler hemen besiyeri ilave edilmiştir. Toplanan hücreler 15 mL’lik santrifüj tüplerine aktarılır ve 250xg’de 5 dk santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonrasında hücreler 1mL besiyeri içinde süspanse edilmiş ve flasklara bölünmüştür. Hücre Serilerinin Stoklanması Yeterli miktarda hücre yoğunluğuna ulaşan hücre soyları, 1X tripsin-EDTA yardımıyla kaldırılmıştır. Kültür kabına eklenen tripsin-EDTA, hücreler kalkıncaya kadar (yaklaşık 3 dakika) 37°C inkübatörde bekletilmiş ve bu süre içerisinde hücrelerin kalkıp kalkmadığı mikroskopta kontrol edilmiştir. Tripsinin hücrelere zarar vermesini engellemek için hücreler kalktıktan sonra hemen besi ortamı ilave edilmiş ve homojenize bir hal alması için karıştırılmış daha sonrada 250xg’de 5 dk santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonrasında besiyeri yardımıyla hücre süspansiyonu hazırlanmış. Süspanse hücrelerin canlılık oranları belirlenmiştir. Her bir kryotüp için 1000 μL hücre kültür içeriği konulmuş ve her bir kryotüpe %10 oranında 100 μL DMSO çözeltisi ilave edilmiş ve bu işlemden sonra üzerlerine tarih yazılarak kryotüpler -20°C’ye kaldırılmıştır. 3-4 saat sonra kryotüpler, -86°C derin dondurucuya yerleştirilerek stoklama işlemi tamamlanılmıştır. 3.2.2. B16F10 Hücrelerinden Tirozinaz Elde Edilmesi Bu deney için, öncelikle B16F10 hücreleri steril T75 flaska ekilmiştir. Hücrelerin kuyucuklardaki doluluk oranı %90’a ulaştığı zaman, hücreler tripsinize edilerek toplanmıştır. 250xg’de 5 dakika santrifüjleyip süpernatanı dökülmüş ve pelletin üzerine 1 mL soğuk PBS eklenmiş tekrardan 250xg’de 10 dakika 37 santrifüjlenmiştir. Santrifüjden sonra süpernatan uzaklaştırılmıştır. Tekrardan pelletin üzerine 1 mL lizis tamponu % 0,1 Triton X-100 eklenmiş ve 3 kere homojenize edilmiştir. Elde edilen karışım 1,5 mL ependorf tüpüne aktarılımış ve 12000xg’de 10 dakika ve 4⁰C’de santrifüjlenmiştir. Süpernatan yeni bir ependorf tüpe aktarılmış ve pellet atılmıştır. Deneyin tüm aşamalarında hücre buzun içinde tutulmuştur. 3.2.3. B16F10 Hücreleri ile Enzim Aktivitesi Ölçümü Bu çalışmada kullanılan enzim B16F10 hücrelerinden elde edilmiştir. Bileşik- 15’in tirozinaz enzimi üzerindeki etkisini belirlemek için 96 kuyucuklu plakanın içerisine 100 L (pH 6,8) 50 mM fosfat tamponu, 25 L enzim, 15 L inhibitör, 15 L 3 mM L-DOPA konulmuştur. Kontrol grupları için Bileşik-15 ve Kojik asit yerine aynı hacimde DMSO eklenmiştir. İlk aşamada enzim ve inhibitör eklenmiş ve 37°C’de 20 dakika süre ile preinkübasyona tabi tutulmuştur. Daha sonraki aşamada ise L- DOPA eklenmiştir. Plaka 37°C’de 10 dakika boyunca inkübasyona bırakılmıştır. Plaka 475 nm’de BioTek PowerWawe HT Elisa Plaka Okuyucuda absorbans değerleri ölçülmüştür. Örnek ve kontrol çözeltileri için n=3 olarak alınmıştır. Maddelerin % inhibisyonları kontrol çözeltisine kıyaslanarak formüle edilmiştir. % inhibisyon = [(A-B)/A] x 100 Formülde A; DMSO, B ise örneklerin absorbansını göstermektedir. Veriler GraphPad Prism 5.03 kullanılarak çizilmiş, standart sapmaları ve IC50 değerleri hesaplanmıştır. 3.2.4. Sülforodamin B (SRB) Deneyi SRB deneyi, hücre canlılığının ölçülmesi için in vitro olarak kullanılan yöntemlerden biridir (86). Aminoksanten bir boya olan SRB, yapısındaki sülfonik gruplar sayesinde proteinlerin bazik amino asit kalıntılarına bağlanmaktadır. Boyanmış hücrelerdeki ölçülen boya miktarı hücre kütlesi ile orantılı olarak kabul edilir (87). A375 hücreleri 96 kuyucuklu plakalara, kuyucuk başına 5×103 hücre olacak şekilde eklenmiştir. Hücrelerin kuyucuklardaki doluluk oranı %90’a ulaştığında, kojik asit türevleri uygulanmıştır. Hücreler 48 saat boyunca inkübatörde bekletildikten sonra deney başlatılmıştır. 38 İlk adımda hücreler, %10 (w/v)’luk Trikloroasetik asit (TCA) ile 1 saat boyunca 4°C’de inkübasyona bırakılarak plakaya fikse edilmiştir. Daha sonra dH2O ile yıkanan hücrelerden TCA’nın uzaklaştırılması sağlanmıştır. Plaka kurutulmuş ve hemen ardından kuyucuklara %0,06 (w/v) SRB çözeltisi eklenmiştir. Plaka 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübasyona bırakılmıştır. Bu işlem sonucunda boya hücresel proteinlere bağlanmıştır. İnkübasyonun ardından, plaka %1 (v/v) asetik asit ile yıkanmış ve bağlanmamış boyalar ortamdan uzaklaştırılmıştır. Plaka tekrar kurutulmuş. Plakadaki her bir kuyucuğa 200 μL 10 mM Tris bazı (pH 10,5) eklenmiş ve homojen olması için 10 dakika boyunca çalkalayıcıda çalkalanılmıştır. Son aşamada ise her bir kuyucuk için 510 nm dalga boyunda absorbans ölçülmüştür. Hiç bileşik eklenmemiş kuyucuklardaki hücre canlılığı %100 kabul edilmiştir. Her bir bileşik için IC50 değerleri hesaplanmıştır. Bu deney n=3 olacak şekilde yapılmıştır. 3.2.5. Apoptoz Deneyi A375 hücre hattı 96 kuyucuklu plakalara her bir kuyucukta 100 µL besiyeri içinde 5×103 hücre olacak şekilde ekilip hücrelerin tutunması için 48 saat boyunca inkübe edilmiştir. A375 hücreleri % 1 (w/v) P/S, % 10 FBS ve % 1 1 X L-Glu karışımı içeren DMEM besi ortamında çoğaltılmıştır. 48 saatlık inkübasyondan sonra, hücreler kuyucuklarda yaklaşık % 80 doluluğa ulaşmış ve hücreler FBS içermeyen besi ortamında inkübatörde inkübe edilmiştir. Sitotoksisite deneylerinin sonucunda kullanılması karar verilen Bileşik-15 maddesinin IC50 konsantrasyonu n=3 olacak şekilde kuyucuklara eklenip 24 saat boyunca IC50 dozu etkileştirilmiştir. 24 saatlik sürenin sonunda seçili kuyucuklardaki hücrelere değişiklikler ApoTox-Glo Triplex Assay Kiti kullanılmış hücre canlılık yüzdesi, sitotoksisite yüzdesi ve kaspaz 3/7 oranları belirlenmiştir. Bu deneyin sonucunda elde edilecek bulgular ilaç ve sentezlenen bileşiğin artan dozlarında yüzde canlılık seviyesinin miktarını ve efektör kaspaz aktivasyonu üzerinden apoptotik hücre ölümünü kesin bir şekilde gösterecektir. İlk aşama için hücre canlılığı ve sitotoksisitesinin reaktifleri olan, GF-AFC ve bis-AAF-R110 substratları 37°C’de çözdürülmüştür. 2 mL hacme sahip olan test tamponuna her bir örnek için her bir substrattan 2 µL eklenmiş ve pipetleme yöntemi ile homojenize edilmiştir. Daha sonraki aşamada belirlenen her bir kuyucuk için homojenize edilmiş reaktiften 20 µL eklenilmiş ve 37°C’de 30 dakika boyunca 39 inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresinin sonunda plaka FLUOstar® Omega floresanslı plaka okuyucuda okunmuştur. Aşağıdaki iki dalga boyu setinde floresan ölçümü yapılmıştır: • 400 Ex/ 505 Em (Canlılık) • 485 Ex/ 520 Em (Sitotoksisite) Kazpaz 3/7 aktivitesinin ölçümü için belirlenen kuyucuklara 100 µL Caspase- Glo® 3/7 reaktifi eklenmiş ve pipetleme yöntemi ile iyice karıştırılmıştır. Daha sonra 30 dk oda sıcaklığında inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresinin sonunda plaka FLUOstar® Omega floresanslı plaka okuyucuda lüminansı okunmuştur. 3.2.6. Hücrelerden RNA Saflaştırılması Öncelikle A375 hücreleri 6 kuyucuklu plakaların içerisine her bir kuyucukta 100,000 hücre olacak şekilde ekilmiştir. Bu hücreler % 1 (w/v) P/S, % 10 FBS ve % 1 1 X L-Glu karışımı içeren DMEM besi ortamında çoğaltılmıştır. Hücreler kuyucuklarda yaklaşık % 80 doluluğa ulaştığında artan dozlarda ilaç uygulaması yapılmış ve hücreler FBS içermeyen besi ortamında inkübatörde inkübe edilmiştir. 24 saatlik sürenin sonunda total RNA, NucleoSpin RNA II izolasyon kiti (Macharey Nagel) kullanılarak, üretici firmanın belirlediği kullanma talimatına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. İlk adım olarak hücreler tripsin ile toplanıp 250 × g’de 5 dakika süresince santrifüj edilmiş ve süpernatan atılmıştır. Pellet kısmına 3,5 μL β-merkaptoetanol eklenmiştir. Hemen ardından hücre lize edici RA1 tamponundan 350 μL eklenmiş ve homojen hale getirilmiştir. Daha sonra filtreli toplama tüpüne alınan lizat hemen ardından 1 dakika süresince 4⁰C’de 11000 × g’de santrifüj edilmiştir. Tekrardan lizata 350 μL hacim içerisinde %70’lik alkol eklenmiştir. Tekrardan örnekler yeni bir filtreye sahip olan toplama tüplerine alınmış ve 30 saniye süresince 4⁰C’de 11000 × g’de santrifüj edilmiştir. Bu aşamada örnekler filtre kısmında tutunduğu için yeni bir toplama tüpüne yerleştirilmiş ve üzerine 350 μL MBD (Membrane Desalting Buffer) eklenmiş ve 1 dakika süresince 4⁰C’de 11000 × g’de santrifüj edilmiştir. Örneklere seyreltilmiş olan stok DNaz’dan 95 μL eklenmiş daha sonra da 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edilmiştir. Bu sürenin sonunda örneklere 200 μL ikinci tampon olan RAW2 eklenmiş ve 30 saniye süresince 4⁰C’de 11000 × g’de santrifüj edilmiştir. 40 Daha sonra örneklerin bulunduğu filtreli tüp yeni toplama tüpüne alındıktan sonra örneklere 600 μL hacimdeki 3. tampon olan RA3 uygulanmış ve 30 saniye süresince 4⁰C’de 11000 × g’de santrifüj edilmiştir. Örneklerin içinde bulunduğu filtreli tüpler tekrardan yeni toplama tüplerine alınmış ve tekrardan üçüncü tampon olan RA3’ten bu sefer 250 μL eklenmiş ve yeniden 2 dakika süresince 4⁰C’de 11000 × g’de santrifüj edilerek filtreli tüpler yeni toplama tüplerine taşınmıştır. Son olarak örneklere 60 μL RNaz içermeyen dH2O eklenmiş ve 1 dakika süresince 4⁰C’de 11000 × g’de santrifüj edilmiştir. Elde edilmiş olan RNA’nın 2 μl‘si RNA saflık ve konsantrasyon ölçümü için kullanıldı. Kalan kısım ise cDNA sentezi yapılmak üzere -80 ˚C’lik derin dondurucuya kaldırılmışıtır. RNA kalitesi ile miktarının belirlenebilmesi için nanospektrofotometre cihazı kullanılmıştır. İzole edilmiş olan RNA örneklerindeki A260/A280 oranlarının 1,8-2 civarı olmasına dikkat edilmiştir. 3.2.7. RNA’dan cDNA Sentezi cDNA sentezi için GScript First-Strand Synthesis Kit kullanıldı. DNA sentezi için, protokole göre aşağıdaki adımlar takip edildi. GScript First Strand Kit çözündükten sonra 10-15 saniye santifüj edildi. Aşağdaki tabloya göre RNA örneklerinden her biri için karışım hazırlandı. Karışım dikkatli şekilde santrifüj edildi (Tablo 3.1.). Tablo 3.2. cDNA için hazırlanan 1. karışım Madde Hacim (μl) RNA solusyonu 1 µg/µl Oligo(dT)20 1 μl dNTP karışımı 1 µl dH2O 13 µl’ye kadar Toplam 13 µl Elde edilen karışım 65ºC’de 5 dakika inkübe edildi. Daha sonra hemen buz içerisinde 1 dakika bekletildi. 13 µL karışım içeren her tüpe 4 µL 2. adım karışımı eklendi. Pipet ile alt-üst edilerek dikkatlice karıştırıldı. 2. adım karışımı aşağdaki tabloya göre hazırlandı (Tablo 3.2.). 41 Tablo 3.3. cDNA için hazırlanan 2. karışım Madde Hacim(μl) 5X 1st strand buffer 4 µl DTT (0.1 M) 1 μl GScript RTase 1 µl Toplam 6 µl Hazırlanan tüpler PCR cihazına yerleştirilerek amplifikasyon basamakları 1. basamak 50°C - 60 dk, 2. basamak 70°C - 15 dk ve 3. Basamak ise 4°C- ∞ dk soğuma olarak ayarlanmıştır. Bu aşamalar için 96 kuyucuklu termal döngü cihazı kullanılmıştır. cDNA örnekleri - 20°C’de muhafaza edilmiştir. 3.2.8. RT-PCR ile Gen İfadesi Analizi A375 hücresinden saflaştırılan total RNA’lardan belli işlemler sonucu elde edilmiş olan cDNA örnekleri, çoklu ilaç direnci genlerinin ekspresyon düzeyleri ve belirli apoptotik yolakların araştırılmasında kullanılmıştır. Bu sebeple TP53, Mdm2, Bax ve Bcl-2 genleri apoptotik yolakların incelenmesinde kullanılmıştır. Mdr-1 geni ise çoklu ilaç direncinin incelenmesi için seçilmiştir. Gapdh ise referans gen olarak seçilmiştir. Gapdh’ın ekspresyon düzeyi ile seçilmiş olan genlerinki normalize edilmiştir. İfadelenmede ölçülecek olan her bir gen tasarımı için, Biyoteknoloji Bilgisi için Ulusal Merkez (National Center for Biotechnology Information, NCBI) veri tabanı kullanılmıştır. Kullanılmış olan primer dizileri için erime sıcaklığı (melting temperature, Tm) ve guanin-sitozin yüzdesi (Tablo 3.3.)’de verilmiştir. 42 Tablo 3.4. RT-PCR reaksiyonu için kullanılmış olan ileri ve geri primer dizilerine ait erime sıcaklıkları ve %Guanin-Sitozin verileri. Primer Primer Dizisi (5' → 3') Erime Sıcaklığı (Tm, °C) Guanin Sitozin Yüzdesi (%GC) TP53 ileri CACCATGAGCGCTGCCTCAGATAGC 67,60 60 TP53 geri ACAGGCACAAACACGCACCTCAAA 65,97 50 Mdm2 ileri AGGTCACTCCGATGAAAGGT 58,35 50 Mdm2 geri GTTGTCTAGTACCATTAACC 50,61 40 Bax ileri TTTCATCCAGGATCGAGCAG 57,39 50 Bax geri AAAGTAGAAAAGGGCGACAA 55,19 40 Bcl-2 ileri GTGTGTGGAGAGCGTCAACCGG 65,78 63,64 Bcl-2 geri TCAAACAGAGGCCGCATGCTGG 65,90 59,09 Mdr-1 ileri TTCAACTATCCCACCCGACCGGAC 66,03 58,33 Mdr-1 geri ATGCTGCAGTCAAACAGGATGGGC 66,01 54,17 Gapdh ileri GTCGTATTGGGCGCCTGGTCAC 65,93 63,64 Gapdh geri GCCAGCATCGCCCCACTTGATT 66,00 59,09 Jnk ileri TCAAGAAGCTAAGCCGACCA 60,55 50 Jnk geri AAACTCGTTCCTGCAGTCCT 61,62 55 RT-PCR için “Power® SYBR Green Master Mix” kiti kullanıldı. 0.2 mL’lik tüplere her bir primer için mastermiks karışımları ayrı hazırlanmıştır ve bu çalımada 6 primer kullanılmıştır. Primer sayısı kadar (6) mastermix hazırlandı. Toplam örnek sayısı 6 olduğu için “6x” şeklinde her bir mastermiks miktarı aşağdaki tabloya göre hesaplandı (Tablo 3.4.) Tablo 3.5. RT-PCR deneyi için oluşturulan reaksiyon çözeltisi Materyal Final SYBR Green Karışımı (2X) 12.5 µL İleri Primer (10 μM) 1 μM Geri Primer (10 μM) 1 μM cDNA 100 ng dH2O Değişken Toplam 25 μL 43 Oluşturulan reaksiyon çözeltisi, RT-PCR deneyi için cihaza uyumlu 96 kuyucuklu plakaya yüklenmiştir. Aşağdaki şartlara göre PCR döngü programı uygulanılarak çalıştırılmıştır (Tablo 3.5.). Tablo 3.6. RT-PCR döngü koşulları Sıcaklık Zaman Döngü 95⁰C 10 dakika 1 95⁰C 15 saniye 40 60⁰C 1 dakika 40 Elde sonuçlar daha sonra genlerin ekspresyon düzeyinin belirlenmesi için ve ilgili genlerin eşik döngüsü (treshold cycle, Ct) değerlerinden referans Gapdh geninin Ct değeri çıkartılarak ΔCt hesaplanmıştır. Ekspresyon düzeylerindeki değişimler kat cinsinden ΔΔCt verileri kullanılarak elde edilmiştir. Bu deneyde n=3 tekrar yapılmıştır. 3.2.9. Agaroz Jel Elektroforezi 1 X Tris Asetik Asit EDTA (40 mM Tris, 20 mM Asetik Asit, 1 mM EDTA , pH 8 ) tamponu için % 2,5 agaroz jel hazırlandı. Hazırlanan solüsyon mikrodalgada ısıtılmıştır. Hazırlanan solüsyona denatüre etmesi için % 1 çamaşır suyu eklenmiş ve homojenize edilmiştir. Solüsyona son derişim 2,5 µL 10 mg/mL olacak şekilde etidyum bromür eklenmiştir. Daha sonra jel elektroforez kasetine dökülmüştür. Jel kalıp haline geldikten sonra içerisinde 1 X TAE tamponu bulunduran elektroforez tankınandaki özel bölmeye yerleştirilmiştir ve -86°C’de saklanan RNA örnekleri alınmıştır. Her bir kuyucuğa dH2O ile seyreltilmiş örneklerin her birinden 8 µL ve nükleik asit boyası olarak bilinen Track It Cyan/Orange boyasından 2 µL kullanılmıştır. Örnekler jele yüklenip 30 dakika boyunca 100 V’da yürütülmüştür. Jel KODAK jel görüntüleme cihazına yüklenmiştir. UV ışığı altında fotoğrafı çekilen jel hemen ardından görüntü kaydedilmiştir. Görüntülerde RNA 2 bant şeklinde görülmüştür. Bu şekilde de RNA’nın degrade olmadığı anlaşılmıştır. 44 3.2.10. Akış Sitometri ile Apoptoz ve Canlılık Tayini Apoptoz olayına giren hücrelerde plazma membranındaki fosfolipid dengesi kaybolmaktadır. Plazma membranında bulunan fosfotidilserin iç membrandan dış membrana çıkmaktadır. Bu olay hücrelerdeki membran bütünlüğünün bozulmadığı apoptozun erken aşamalarında görülmektedir. Ölmekte olan hücrelerin tespitinde ise fosfotidilserinlerin ortaya çıkması güçlü bir işaret olarak kabul edilmektedir. Annexin V, kalsiyum varlığında fosfotidilserine kararlı bir şekilde bağlanır. Floresan (FITC) işaretli Annexin V ile apoptoza giden hücrelerin sayısı akış sitometri ile tespit edilebilir. Ölü hücrelerin plazma membranından geçen Propidyum iyodür (PI) boyası ise kromozomal DNA’ya bağlanabilme özelliği taşıdığından geç apoptotik ve ölü hücrelerin sayısının belirlenmesinde kullanılmaktadır. Non-vital boya olan Propidiyum iyodür (kırmızı floresan) ve Annexin V (yeşil floresan) ile aynı zamanda hücreler boyanır. Canlı hücreler (FITC-PI-), erken apoptotik hücreler (FITC+PI-) ve geç apoptotik veya nekrotik hücrelerin (FITC+PI+) birbirinden ayırt edilmesine izin vermektedir (43). A375 hücrelerindeki apoptotik aktivitenin tespiti BD FACSCanto™ ll Flow Cytometer cihazı kullanılarak yapılmıştır. 6 kuyucuklu kültür kaplarına kuyucuk başına 3,0x105 olacak şekilde hücre ekimi yapıldıktan sonra 48 saat süreyle hücreler besi ortamı içinde iyice homojenize edildikten sonra 37°C‘de, % 5 CO2 içeren inkübatörde kültüre edilmiştir. İnkübasyon süresinin ardından ortamdan besiyerleri uzaklaştırılmış, hücrelere FBS içermeyen besi ortamı eklenmiş ve kuyucuklara n=3 olacak şekilde Bileşik-15 maddesi ekilmiş ve n=3 olacak şekilde de kontrol grubu bırakılmıştır. 24 saatlik 37°C ve % 5 CO2 ortam koşullarındaki inkübasyonundan sonra kuyucuklardaki hücreler besiyerleri ile birlikte deney tüplerine alınmıştır. Tabanda kalan hücreler için kuyucuklar 2 mL PBS ile yıkanmış sonra kuyucuklardaki PBS aynı deney tüplerine aktarılmıştır. Ardından her kuyuya 100 µL tripsin/EDTA enzim çözeltisi ile 5 dakika süreyle 37ºC’de inkübe edilmiştir. Tabandaki yüzeyden ayrılan hücrelerin üzerine taze besiyeri eklenerek ve pipetaj yapılmıştır. Kuyucuklardaki hücre+tripsin+besiyeri içeren tüm karışımlar aynı deney tüplerine aktarılmıştır. Hücreler 2000xg’de 5 dakika santrafüj edilmşitir. Süpernatant uzaklaştırılmış ve pellet 100 µL bağlama solusyonu nazikçe karıştırılarak resüspanse edilmiştir. Ardından 100 µL hücre süspansiyonun üzerine 5 µL Annexin V FITC ve 1 µL Propidiyum iyodür 45 eklenmiş ve nazikçe karıştırılmıştır. Hücreler karanlıkta 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edilmiştir. İnkübasyondan sonra hücreler hemen flow sitometre cihazında (BD FACSCanto™ ll Flow Cytometer) ölçüm yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar BD FACS Diva Software yazılımı ile analiz edilmiştir. 3.2.11. Western Blot Uygulamsı Western Blot uygulaması, içerisinde çok sayıda protein olan bir örneğin içerisinden istenilen tek bir proteini özgün olarak saptamaya yarıyan yöntemdir. Bu uygulama sonunda ilgilenilen bir proteinin örnekte belirlendikten sonra yarı kantitatif bir şekilde farklı gruplar arasındaki miktarı hesaplanabilir. Protokol ve kullanılan boyalar değişiklik gösterebilir, bu yöntem sayesinde membran üzerindeki 5 ng miktarındaki proteinler bile tespit edilebilir. Western blot işlemi sırasıyla, 1 proteinin membrana aktarılma işlemi 2 bloklama işlemi 3 birincil antikor uygulanması işelmi 4 ikincil antikor uygulanması işlemi 5 görüntüleme işlemi işlemlerinden olmak üzere temel olarak beş basamaktan meydana gelir. Western blot işlemine başlamadan önce, örnekte karışım halinde bulunan proteinler genellikle belli oranda bir ön ayrıma tabi tutulmaktadır. Bu işlem sayesinde elde edilen parametreler aranan proteinin tespitinde kullanılır. Hücre Kültürü Hazırlama Aşaması Öncelikle A375 hücreleri 6 kuyucuklu plakaların içerisine her bir kuyucukta 105 hücre olacak şekilde ekilmiştir. Bu hücreler % 1 (w/v) P/S, % 10 FBS ve % 1 1 X L-Glu karışımı içeren DMEM besi ortamında çoğaltılmıştır. Hücreler kuyucuklarda yaklaşık % 80 doluluğa ulaştığında IC50 dozunda Bileşik-15 uygulaması yapılmış ve hücreler FBS içermeyen besi ortamında inkübatörde inkübe edilmiştir. 48 saatlik sürenin sonunda A 375 hücreleri tripsin-EDTA ile muamele edilmiş ve ardından 5 dakika boyunca 500xg'de santrifüjlenmiştir. Hücre pelleti PBS ile süspanse edilerek hücreler yıkanmıştır. Daha sonra pellet 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüplerine aktarılmış 46 ve yüksek hızda 2-3 dakika vortekslenmiş, pellet toplanmıştır. Daha sonra pelletler 500 µL RİPA çözeltisi ( 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, % 1 Triton x 100, % 0,1 SDS, 150 mM NaCI, 1 mM PMSF, pH 8 ) içerisinde çözülmüştür. RİPA çözeltisi içeriği Tablo.3.6.’da gösterilmiştir. Mikrosantrifüjlerdeki örnekler homojenizatör kullanılarak 20 tekrar olmak üzere homojenize edilmiştir. Örnekler 5 dakika süre ile buzda bekletilmiş ve 4°C’de 15 dakika 14000xg’de santrifüjlenmiştir. Santrifüj işlemin hemen ardından süpernatant önceden soğutulmuş bir tüplere aktarılmıştır ve bu tüpler tekrar kullanılmak üzere -86°C’ye kaldırılmıştır. Tablo 3.7. Protein izolasyon için hazrılanan RİPA Çözeltisi 10 mM Tris pH 8 100 mL 1 mM EDTA 37,2 mg 0,5 mM EGTA 19 mg % 1 Triton x 100 1 mL % 0,1 SDS 1mL 150 mM NaCI 820 mg 1 mM PMSF (proteaz inhibitörü deney başlamadan hemen önce en son ekleniliyor) 1,74 mg Protein Miktar Tayini Bir önceki adımda hazırlanan proteinler miktarlarına uygun olarak normalize edilmek için BCA deneyine tabi tutulmuştur. Bu deney amino asit kalıntılarının Cu+2’ı Cu+1’a indirgemesi temeline dayanmaktadır. Yüksek sıcaklıklarda, proteinlerde bulunan peptit bağlarında da bu reaksiyon görülmektedir. Bu nedenle her bir Cu+1 iyonu BCA çözeltisi ile mor renkli bir kompleks oluşturmaktadır. İlk aşama olarak öncelikle 2000 μg/mL’e kadar artan derişimler için 8 adet standart çözeltisi hazırlanmıştır. Daha sonra 96 kuyucuklu bir plakada belirlenmiş kuyucuklara iki tekrarlı şekilde 25 μL eklenmiştir. Örnekler için ise kuyucuklara her bir örnekten de 25 μL eklenmiştir. Tekrardan standart çözelti ve örneklerin olduğu kuyucuklara 1:50 oranında bakır sülfat ve bikinkoninik asit solüsyonlarından oluşan çözeltiden 200 μL eklenmiştir. 96 kuyucuklu plaka 37°C’de 30 dakika boyunca inkübe edilmiştir. İnkübasyonun hemen ardından 562 nm dalga boyunda absorbans değerleri 47 ölçülmüştür. Standart kuyucuklarından ölçülen absorbans değerleri yardımıyla standart eğri grafiği ve denklemi hesaplnamıştır. Hesaplanan bu denklem sayesinde de örneklerdeki protein miktarı bulunmuştur. Western Bloot Aşaması Western Bloot uygulamasına geçmeden elimizdeki proteinler 10 µg olacak şekilde hepsi eşitlendi. Daha sonra elde ettiğimiz proteinlerin primer yapsını istediğimiz için proteinler 96 kuyucuklu