T.C HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ KULAK BURUN BOĞAZ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI PRP TATBİKİNİN TİMPANİK MEMBRAN İYİLEŞMESİ ÜZERİNE ETKİSİNİN RAT MODELİ ÜZERİNDE İNCELENMESİ Dr.Kamran Zeynallı Uzmanlık Tezi Olarak Hazırlanmıştır TEZ DANIŞMANI Doç.Dr.Gamze Atay ANKARA 2020 i TEŞEKKÜR Uzmanlık eğitimim sürecinde cerrahi ve akademik çalışma düzeni, disiplin ve deontoloji açısından bana her zaman örnek olup ilham veren, asistanlık sürecimin çeşitli aşamalarında varlığını her zaman yanımda hissettiğim Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Kulak Burun Boğaz ve Baş Boyun Cerrahisi anabilim dalı öğretim üyelerine en içten şükranlarımı sunuyorum. Tezimin planlanması, dizaynı ve gelişiminde çok değerli katkı ve desteklerinden dolayı tez danışmanım Doç.Dr.Gamze ATAY’a bilgisi ve rehberliği için teşekkür ederim. Tıbbi Patoloji Anabilim Dalı öğretim üyesi Doç.Dr.Sevgen ÖNDER’e, Biyoistatistik Anabilim Dalı öğretim üyesi Doç.Dr.Jale KARAKAYA’ya, Vet.Dr.Salih SALAR ve Kobay A.Ş. Deney Hayvanları Laboratuvarı ekibine katkılarından dolayı teşekkür ederim. Bana gösterdikleri sonsuz sevgi , destek ve sabırla bugüne gelmemde en önemli pay sahibi anne ve babama, sevgili eşim Sara Zeynallı’ya en içten şükranlarımı sunarım. ii ÖZET Zeynallı K, PRP tatbikinin timpanik membran iyileşmesi üzerine etkisinin rat modeli üzerinde incelenmesi. Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi KBB Anabilim Dalı, Uzmanlık tezi, Ankara, 2020. Platelet Rich Plasma (PRP) tıpta çeşitli alanlarda yara iyileşmesini arttırıcı özelliklerinden dolayı başarıyla kullanılan trombosit konsantresidir. Farklı çalışmalarda yara iyileşmesi ve doku rejenerasyonu üzerine olumlu etkileri gösterilmiştir. Literatürde bu yönde çalışma sayısı kısıtlı olduğu için çalışmamızda topikal PRP’nin kulak zarı iyileşmesine etkinliğinin incelenmesi amaçlanmıştır. Çalışma için 10-12 haftalık, sağlıklı, ortalama 250-300 gram ağırlığında 24 erkek Albino Wistar sıçanı kullanılmıştır. Anestezi sonrası deneklerden iki ml intrakardiyak kan alınmıştır. Alınan kandan santrifügasyon yoluyla PRP hazırlanmıştır. Cerrahi mikroskop altında deneklerin her iki kulağında malleus posterioruna pick yardımıyla subtotal perforasyon oluşturulmuştur. Perforasyon kenarları % 10 Gümüş Nitrat solüsyonuyla işlenmiştir. Elde edilmiş PRP içinde gelfoamlar beş dakika bekletilmiş ve deneklerin sol kulağındaki perforasyon kum saati şeklinde kapatılmıştır. Kontrol tarafı olan sağ kulak için jelfoam serum fizyolojik solüsyonunda beş dakika bekletildikten sonra aynı şekilde perforasyon kapatılmıştır. İşlem sonrası denekler düzenli aralıklarla mikroskopik incelemeye tabii tutulmuştur ve bu süreçte her hangi bir enfeksiyon sürecine rastlanmamıştır. Denekler 2. ve 4. haftalarda sakrifiye edilerek kulak zarları ekstrakte edilmiş ve histopatolojik incelemeye tabii tutulmuştur. Kulak zarındaki perforasyonun kapanma zamanları belirlenmiş olup deney grubunda ortalama sekiz gün, kontrol grubunda ortalama dokuz gündür. Bu fark istatistiksel olarak karşılaştırıldığında anlamlıdır (p=0.01). Kulak zarı perforasyonu kapanma oranları karşılaştırıldığında deney grubunda 21 (% 87.5), kontrol grubunda 15 (% 62.5) kulakta iyileşme oranı saptanmış olup istatistiksel olarak karşılaştırıldığında anlamlı fark yoktur (p=0.07). Histopatolojik incelemede lamina propriya iyileşme oranları karşılaştırıldığında deney grubunda 19 (% 92.9), kontrol grubunda dokuz (% 57.1) kulakta iyileşme saptanmış olup istatistiksel olarak karşılaştırıldığında anlamlı fark yoktur(p=0.063). İstatistiksel fark olmamakla birlikte, iii PRP kullanılan deney grubunda, hem perforasyon iyileşme oranı hem de lamina propriya oluşma sıklığının daha iyi olduğu görülmektedir. Literatürdeki bilgiler ve çalışmamızdaki bulguların ışığında topikal PRP’nin yara iyileşmesindeki etkinliği, belirgin yan etkilerinin olmaması ve maliyetinin düşük olmasından dolayı hem sağlıklı hem de çeşitli nedenlerden ve ek hastalıklardan dolayı yara iyileşmesinin bozuk olduğu hasta populasyonunda kullanımı önerilebilir. iv ABSTRACT Zeynalli K, Rat model study of the effect of PRP application on the healing of tympanic membrane. Hacettepe University Department of Otolaryngology, Ankara 2020. Platelet Rich Plasma (PRP) is a thrombocyte concentrate widely used in varios fields of medicine due to its wound healing enhancing properties. Its positive effects on wound healing and regeneration has been demonstrated in several studies. Owing to sparsity of the studies regarding this subject we intented to explore the outcomes of topical PRP application on the tympanic membrane healing. 10-12 weeks old, healthy, 24 Albino Wistar rats weighed 250-300 grams on average were used in this study. two ml of intracardiak blood was obtained following the anesthesia. PRP acquired by the way of centrifugation from the obtained blood. Subtotal perforation was created posterior to malleus in both ears under the surgical microscope. %10 Silver Nitrate used to process the margins of the perforation. After the gelfoams were submerged in the obtained PRP for five minutes, left ear perforations were repaired in the hourglass fashion. For the right ears in control group, gelfoams were submerged in physiological saline for five minutes before the perforations repaired in similar fashion. Animals were subjected to microscopic examination with regular intervals following the procedure and the infection was observed in none. Subjects were sacrified in 2. and 4. weeks followed by the extraction and hystopathological examination of specimens. Duration for the closure of the tympanic membran was assessed to be eight and nine days on average in study and control groups respectively. This difference was found to be significant following statistical comparison(p=0.01). Closure rate for the perforated tympanic membrane was found to be 21 (%87.5) and 15 (%62.5) in study and control groups respectively with difference being insignificant following statistical comparison(p=0.07). Healing rates of lamina propria assessed by hystopathological examination were 19 (%92.9) and nine (%57.1) in study and control groups respectively with difference being insignificant following statistical comparison(p=0.063). Though difference being v insignificant following statistical comparison, the closure rate of the perforated tympanic membrane, and healing rate of lamina propria observed to be better in PRP utilized study group. Considering the reports from literature and findings of our study usage of PRP can be recommended for its effectiveness in wound healing, lack of evident side effects, and low-cost in patient population beset with impaired wound healing due to various reasons and additional diseases. vi İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR .................................................................................................. i ÖZET ........................................................................................................... ii ABSTRACT ................................................................................................ iv SİMGELER VE KISALTMALAR ............................................................ viii ŞEKİLLER .................................................................................................. ix TABLOLAR ................................................................................................ x 1. GİRİŞ ....................................................................................................... 1 2. GENEL BİLGİLER .................................................................................. 2 2.1. ZAR HİSTOLOJİSİ ............................................................................... 2 2.2. TİMPANİK MEMBRAN İYİLEŞMESİ ............................................. 3 2.3. MİRİNGOPLASTİ ............................................................................. 4 2.4. TROMBOSİTTEN ZENGİN PLAZMA ............................................. 6 2.4.1. ETKİ MEKANİZMASI ............................................................... 7 2.4.2. GÜVENLİK................................................................................. 7 2.4.3. KLİNİK UYGULAMA ................................................................ 8 2.4.4. KULAK BURUN BOĞAZ ALANINDA KULLANIMI .............. 8 3. GEREÇ VE YÖNTEM ............................................................................10 3.1.DENEK SEÇİMİ................................................................................10 3.2.ETİK KURUL İZNİ ...........................................................................10 3.3.DENEK SAYISI VE GRUPLAR .......................................................10 3.4.DENEY ORGANİZASYONU VE CERRAHİ ...................................10 3.4.1.BAKIM VE SAKRİFİKASYON .................................................11 3.5. HİSTOPATOLOJİK İNCELEME .....................................................11 4. BULGULAR ...........................................................................................17 vii 4.1.İSTATİSTİKSEL ANALİZ ................................................................17 4.2.MAKROSKOPİK BULGULAR ........................................................17 4.3.HİSTOPATOLOJİK BULGULAR .....................................................20 5. TARTIŞMA ............................................................................................24 6. SONUÇ ...................................................................................................35 7. KAYNAKLAR ........................................................................................36 viii SİMGELER VE KISALTMALAR PRP Platelet Rich Plasma TGF-B Transforming Growth Factor PDGF Platelet Derived Growth Factor IGF-1 Insulin Like Growth Factor VEGF Vascular Endothelial Growth Factor EGF Epidermal Growth Factor FGF Fibroblast Growth Factor DKY Dış Kulak Yolu TMP Timpanik Membran Perforasyonu ABD Amerika Birleşik Devletleri HIV Human Immunodeficiency Virus LP Lamina Propriya ix ŞEKİLLER Şekil Sayfa Şekil 3.4-1: Santrifügasyon ve PRP elde edilmesi ………………………....12 Şekil 3.4-2 : Deney düzeneği ………………………………………...…… 12 Şekil 3.4-3: Mikroskop altında zarın görüntüsü ............................................12 Şekil 3.4-4: Perforasyon oluşturduktan sonra görünüm …………………....12 Şekil 3.4-5: Miringoplasti sonrası görünüm ………………………………..14 Şekil 3.4.1-1: Temporal kemikten diseke edilmiş kulak zarı spesimeni …...15 Şekil 3.5-1: Mikroskop altında işlem alanının çini mürekkeple işaretlenmesi ……………………………………………………………………………… 16 Şekil 4.2-1: Mürekkeple işaretli bölgede lamina propria olmaksızın iyileşen atrofik kulak zarı ………………………………………………...………….22 Şekil 4.2-2: Mürekkeple işaretli bölgede lamina propria rejenerasyonu ile iyileşen kulak zarı segmenti …………………………………….…………..23 x TABLOLAR Tablo Sayfa Tablo 4.2-1: Deney ve kontrol gruplarında perforasyon kapanma süresi.....17 Tablo 4.2-2: Kontrol grubu alt grupları lamina propria iyileşme oranı .......18 Tablo 4.2-3: Deney grubu alt grupları lamina propria iyileşme oranı .........18 Tablo 4.2-4: Deney ve kontrol grubu iyileşme oranı ...................................19 Tablo. 4.2-5: Deney ve kontrol gruplarında işlem süresi ........................... 19 Tablo 4.3-1: Kontrol grubu alt grupları lamina propria iyileşme oranı ....... 20 Tablo 4.3-2: Deney grubu alt grupları lamina propria iyileşme oranı ......... 20 Tablo 4.3-3: Deney ve kontrol grubu lamina propria iyileşme oranı ........... 21 1 1. GİRİŞ Timpanik membran orta kulağı dış kulak yolundan ayıran, ses dalgalarının kemikçik sistemle beraber iç kulağa iletilmesini sağlayan, üç farklı bölümden oluşan bir yapıdır. Timpanik anulus, pars tensa ve pars flaksida bölümlerinden oluşan bu yapı dış kulak yolunda belli bir eğimle yerleşmiştir. Pars tensa bölümü medialde mukoza, ortada fibröz ve lateralde epidermal olmak üzere üç ayrı tabakadan oluşur. Etiyolojisinde farklı nedenler bulunan timpanik membran perforasyonu; kulak akıntısı, işitme kaybı, kronik otitis media ve kolesteatom gelişimi açısından risk taşıyarak hayat kalitesini azaltmaktadır. Kulak zarındaki perforasyonu ortadan kaldırmak amacıyla yapılan miringoplasti ameliyatı sonrası başarı oranlarının 30-90 % gibi geniş yelpazede olması uygulanan greft materyalleri ve teknik açısından daha fazla çalışma gereksinimi doğurmaktadır [1-3]. Platelet Rich Plasma (PRP) tıpta çeşitli alanlarda özelliklerinden dolayı başarıyla kullanılan trombosit konsantresidir [4]. Farklı çalışmalarda yara iyileşmesi ve doku rejenerasyonu üzerine olumlu etkileri gösterilmiştir [5]. Otolog olarak kandan santrifüjle kolay ve maliyeti düşük bir şekilde elde edilmesi, ayrıca Transforming growth factor-B ( TGF-B) , Platelet derived growth factor ( PDGF) , Insulin like growth factor ( IGF-1) , Vascular Endothelial growth factor (VEGF) , Epidermal growth factor ( EGF ) , Fibroblast growth factor ( FGF ) gibi birçok biyolojik aktif büyüme faktörü bulundurması nedeniyle çeşitli cerrahi branşlarca yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Çalışmamızda PRP’nin miringoplasti sonrası kulak zarı ve greft iyileşmesi üzerine etkisinin incelenmesi, anlamlı olumlu sonuç elde edilmesi durumunda klinikte cerrahinin başarı şansını artıran yeni bir yöntem kazandırılması amaçlanmıştır. Çalışmanın hipotezi olarak miringoplasti işlemi sırasında eş zamanlı topikal PRP tatbikinin histopatolojik ve morfolojik olarak ameliyat başarısını olumlu olarak etkilediği öne sürülmüştür. 2 2. GENEL BİLGİLER 2.1. ZAR HİSTOLOJİSİ Dış kulak yolu ve orta kulağı birbirinden ayıran kulak zarı iç bükey koni şekline sahip bir yapı olup apeksini umbo oluşturmaktadır. Ses dalgalarının havadan kemikçik sisteme iletiminde görevlidir. Kulak zarı anteroposterior, mediolateral ve superoinferior planlarda oblik yerleşimli olduğu için posterosuperior kısmı anteroinferior bölümüne oranla lateral yerleşimlidir. Bundan dolayı kulak zarı dış kulak yolu( DKY)’nun posterior ve superior duvarıyla 140 ̊ , inferior ve posterior duvarıyla 30̊ lik bir açı oluşturur [6]. Yetişkin insanlarda ortalama çapı 10 mm, kalınlığı 80 mikrometre olan bu yapı ses basınç dalgalarını optimal bir şekilde mekanik vibrasyonlara dönüştürmek için evrilmiştir [7]. Kulak zarı pars tensa ve pars flaksida olarak, anterior ve posterior malleolar ligamanlarla iki ana bölüme ayrılır [8]. Ayrıca DKY duvarındaki sulkusa yerleşmiş, fibro-kartilaj bir yapı olan timpanik anulus kulak zarı çevresinde yerleşmiştir. Kulak zarı faringeal oluk ve kesenin karşılıklı invajinasyonundan türediği için her üç germinal tabakayı barındırır [9]. Lateral epiteliyal tabaka ektodermal kökenli olup DKY’-nun oluşumunda iştirak eden ektodermal tıkacın kanalizasyonundan oluşur. Bu katman keratinle dolu cilt epitel hücrelerinden oluşmuştur ve bu tabaka umbodan laterale doğru migrasyon paterni göstermektedir [6]. Medial mukozal tabaka orta kulak mukozasının devamı olup faringeal kese ve endodermal kaynaklıdır. Skuamoz hücrelerden oluşan bu katman lamina proprianın nutrisyonu ve korunmasında önem arzeder. Su geçirgen olmamasıyla da lamina propriayı orta kulaktaki potansiyel sıvı ve bakterilerden korur. Orta lamina propria tabakası mezodermal kökenlidir ve özellikle pars tensa bölgesinde çok iyi gelişmiş fibrotik bir ağ bulunur. İçeriği kollajen ve elastin liflerinden oluşmuş gevşek bağ dokusu yapısındadır. Tip 2 kollajenden zengin bu yapı 10 – 300 nm boyutundaki daha küçük kollajen liflerinin üçlü heliks yapısı oluşturması sonucu gelişmiştir. Tip 2 Kollajen kulak zarına sertlik vererek fonksiyonel karakteristik özelliklerini belirler [10]. 3 2.2. TİMPANİK MEMBRAN İYİLEŞMESİ Timpanik Membran Perforasyon ( TMP ) prevalansının, Amerika Birleşik Devletleri (ABD) populasyonunda %1-3 olduğu düşünülmektedir [11]. Kronik TMP’ler işitme kaybı, kulak akıntısı , rekürren kulak enfeksiyonları ve kolesteatom gibi ciddi morbiditelere neden olabilir [12-14]. Kronik TMP hastalarının çoğunluğu, hedefleri kulak zarını onarmak, kulak akıntısını ve rekürren kulak enfeksiyonlarını önlemek, mümkünse işitmeyi restore etmek olan miringoplasti ameliyatına ihtiyaç duyarlar [15]. Kulak zarının benzersiz özelliği – üç katmanlı yapısının havada asılı durumda bulunması ve umbodaki progenitör hücrelerden devamlı keratinosit üretimi ve migrasyonudur. Zarın lamina propriasında dış sirküler ve iç radial olacak şekilde yerleşmiş kolajen lifleri mevcuttur [16]. Dış katmanda ağırlıklı olarak tip 2 kollajen, iç katmanda tip 3 kollajen bulunur [17]. Akut perforasyonların %80-85’i spontan olarak iyileşmekle beraber, üç ay sonunda kapanmamış perforasyonlar kronik olarak değerlendirilir [18]. Normal zar iyileşmesi yara kenarlarının retraksiyonu ve artmış mitotik aktiviteyle başlar. Daha sonra epitel katmanı perforasyon kenarlarından santrale ilerleyerek defekti küçültmeye başlar. Epitel katmanın ardından lamina propria ve mukozal katmanlar ilerler [19]. Burada yumuşak doku iyileşmesinden farklı olarak defekti kapatan bağ dokusu yerine epiteldir [20]. Vücudun başka kısımlarındaki yumuşak doku iyileşmesiyle zar iyileşmesi arasında bazı farklılıklar mevcuttur. Yumuşak doku yara iyileşmesinin hemostaz, inflamasyon, proliferasyon ve migrasyon fazının ilk ikisi zar iyileşmesinde aynı olsa da migrasyon fazı proliferasyondan önce gelerek farklılık gösterir [11]. Ayrıca normal doku iyileşmesinde gözlemlenen granülasyon dokusu formasyonu ve re-epitelizasyon için platform oluşumu burada yoktur. Bunun yerine epitel migrasyonu ve köprü oluşması, ardından fibröz tabakının gelişmesi sözkonusudur [21, 22]. Bazen epitel 4 katman ardından fibröz tabakanın migrasyonunun başarısız olması, yüksek frekans ses iletiminde yetersiz olan, lateralde epitel medialde mukozadan ibaret iki katmanlı zarın oluşmasıyla sonuçlanır [23]. Kulak zarındaki rejenerasyon merkezlerinin manubrium mallei ve anulus bölgesinde olduğu gösterilmiştir [24, 25]. Ayrıca yara kenarları havada asılı oluduğu için migrasyon yapan damar ve epiteli destekleyecek matriks dokusu yoktur. Bu nedenle bu yapılar komşuluktaki lamina propriaya ihtiyaç duyarlar [24]. 2.3. MİRİNGOPLASTİ Miringoplasti kemikçik sistem manipule edilmeden perfore kulak zarının onarımıdır. İlk defa 1878 yılında Berthold perforasyon kenarlarının deepitelizasyonu sonrası cilt grefti kullanarak zar onarımı yapmış ve bu operasyonu miringoplasti olarak isimlendirmiştir [26] .Yine de miringoplasti, Wullstein ve Zollner’in 1951’de operatif mikroskopla bu ameliyatı popularize etmesine kadar pek yaygın olmamıştır [27]. Wullstein’nın 1956 tarihli sınıflandırmasında kemikçik sistemin intakt olduğu, sadece kulak zarının greftlendiği ameliyat tip 1 timpanoplasti veya miringoplasti olarak adlandırılmıştır [28]. Genelde perfore zarlarda miringoplastinin üç temel endikasyonu; rekürren kulak akıntısının önlenmesi, iyileşmeyen perforasyondan kaynaklanan iletim tipi işitme kaybının giderilmesi ve kulak tıkacı kullanmadan yüzme isteği şeklinde sıralanabilir. Literatür incelendiğinde miringoplastinin başarı oranları yetişkinlerde 60-99 % , pediatrik grupta 35-94 % oranında görülmektedir [29]. Miringoplastinin nihai amacı perforasyonun kapanması ve buna bağlı mevcut ve olası morbiditelerin ortadan kaldırılmasıdır. Cerrahın tercihine göre kulak zarına yaklaşım; endaural, postaurikuler , endomeatal veya endoskopik olabilir. Klasik olarak posterior ve santral perforasyonlarda endaural, anterior ve superior yerleşimli perforasyonlarda postaurikuler, geniş DKY olan santral perforasyonlu hastalardaysa endaural yaklaşım 5 tercih edilebilir [15]. İşlem yine cerrahın tercihi ve hastanın uyumuna göre lokal veya genel anestezi altında icra edilebilir. Perforasyon bölgesine göre incelendiğinde ise, anterior yerleşimli perforasyonlar için yapılan miringoplasti sonuçlarında başarı oranlarının daha düşük olduğunu gösteren çalışmalar mevcuttur. Buna neden olarak anterior perforasyonların cerrahi ulaşım açısından zor olması ve zarın bu bölümünün perfüzyonunun daha zayıf olması gösterilmektedir [30, 31]. Yine yapılan çalışmalarda daha küçük perforasyonlarda miringoplasti sonrası başarı oranlarının daha yüksek olduğu gösterilmiştir [32, 33]. Underlay ve overlay teknikler miringoplastide başarıyla kullanılan greft teknikleri olup benzer başarı oranları göstermektedirler[34]. Benzer başka çalışmalar posterior perforasyonlar için underlay, büyük anterior ve santral perforasyonlar içinse overlay tekniğin kullanılmasını önermektedir [35]. Miringoplastide greft malzemesi olarak kıkırdak [36], yağ [37], temporal adale fasyası, dura [38], cilt [39], kağıt [40], perikondrium, alloderm [41] gibi çeşitli malzemeler başarılı birşekilde kullanılmaktadır. Bunun dışında denatüre edilmiş domuz cildinden elde edilen gelfoam biyouyumlu ve non toksik bir malzeme olup timpanoplasti ameliyatlarında destek ve tamponlamanın dışında akut perforasyonlarda greft olarak tek başına kullanılmaktadır [42]. Yapılan meta-analizlerde miringoplasti sonrası en sık belirtilen komplikasyonlar reperforasyon (11.99 %), revizyon cerrahi (11.4%), greft atrofisi (6.7%) ve lateralizasyonu (4.2%) olmuştur [43]. Operasyon sonrası başarsız sonuçların nedeni olarak bakteriyel enfeksiyonun epitelial hücre migrasyonu ve proliferasyonunu baskılaması, greftin yapısal desteğinin yetersiz oluşu [24], anjiogenez, ekstraselüler matriks ve büyüme faktörlerinin eksik kalması [44], hücreler arası azalmış adhezyon gibi çeşitli nedenler gösterilmiştir [25]. 6 2.4. TROMBOSİTTEN ZENGİN PLAZMA Otolog kanın plazma fraksiyonunda platelet konsantrasyonu bazal düzeyin üzerinde olan bölümüne platelet rich plasma (PRP) denir. PRP yüksek platelet konsantrasyonu dışında koagülasyon faktörleri ve sekretuar proteinlerden de zengindir [45]. Plateletler kemik iliğindeki megakariyositlerin üründür. İçerdikleri alfa granüller hemostaz ve doku iyileşmesinde temel önemi olan otuza kadar biyoaktif protein içerir. Bunlardan önemli olanları arasında transforming growth faktörü-β (TGF-β), vasküler endotelyal büyüme faktörü(VEGF), platelet kökenli büyüme faktörü ( PDGF), platelet kökenli anjiogenez faktörü, platelet kökenli endoteliyal büyüme faktörü, platelet faktör 4, interlökin 1, epidermal büyüme faktörü, epiteliyal büyüme faktörü, insulin like growth faktör, osteokalsin, osteonektin, fibrinogen, vitronektin, fibronektin ve trombospondin gibi bioaktif ajanlar belirtilebilir [46]. PRP belirtilen faktörleri konsantre bir şekilde bulundurmasından dolayı fibroblast, endotel ve kök hücrelerinin aktivasyon ve proliferasyonunu arttırma potansiyeline sahiptir. PRP ameliyathanede minimal eforla kolaylıkla hazırlanabilir [47, 48]. İki aşamalı olarak önce hastanın tam kanı santrifüj edilerek plazma ve eritrositler ayrılır. Daha sonra tekrar santrijüjle PRP Platelet Poor Plasmadan ayrılır. Bu ürüne kalsiyum veya trombin eklenerek aktif hale getirilir ve platelet jel elde edilir [48]. Bazı yazarlar platelet konsantrasyonunun bazal düzeyin 3-5 katı olması gerektiğini belirtmiştir [49]. Büyüme faktörlerinin 95% bir saat içerisinde salgılandığından ürün kullanılacak dokuya fazla bekletilmeden uygulanmalıdır [50]. 7 2.4.1. ETKİ MEKANİZMASI PDGF yara iyileşmesini başlatan ilk büyüme faktörüdür [51]. Aktive edildiğinde osteoblast ve fibroblast gibi hedef hücrelerin transmembran reseptörlerine bağlanır ve hücre proliferasyonunu stimüle eder. Bu büyüme faktörleri iyileşen dokudaki mezenşimal kök hücreleri ve osteoprogenitör hücreler gibi önemli aktörlerin hücre populasyonunu artırır. Endotel hücrelerin de aktivasyonu sağlanarak iyileşen dokuda yeni kapillerlerin oluşumu yani angiogenez tetiklenmiş olur [52]. Ek olarak PDGF makrofaj aktivasyonu da sağlayarak travma veya cerrahi bölgesinin debridmanını başlatır. Bu da makrofajların etkisiyle konuk dokudan büyüme faktörleri salgılanmasının ikinci dalgasını başlatır. TGF-β bir çok dokuda salgılansa da esas kaynağını kemik ve plateletler oluşturur. TGF-β osteoblast öncüsü hücrelerin proliferasyonunu stimüle ettiği için kemik ve kollajen sentezinde direk etkileri mevcuttur. Ek olarak osteoblast apoptozunu aktive ederek kemik rezorpsiyonunu azalttığı gösterilmiştir [51]. Yine PDGF gibi kollajen formasyonu için fibroblast, anjiogenez için endotel, kartilaj için kondroprogenitör ve mezenşimal hücreleri aktive eder [53]. VEGF anjiogenezi destekler, kronik yaraların iyileşmesinde rol oynar. EGF fibroblast, endotel hücreleri ve keratinositler için mitojen olup kronik yaraların iyileşmesini kolaylaştırır [54]. IGF hücre apoptozunun önemli modülatörü olup PDGF ile kombinasyonda doku ve kemik rejenerasyonunu tetikler [55]. Fibronektin ve Vitronektin adhezyon molekülleri olup proliferasyon ve migrasyon fazlarında hücrelerin hareketine yardım eder. Sıralanan faktörler andiferansiye hücreleri yeni oluşmuş matrikse çekerek hücre bölünmesi ve yara iyileşmesini tetikler [48]. 2.4.2. GÜVENLİK Otojen hazırlanan bir ürün olmasından dolayı immün reaksiyon ve de HIV, hepatit, Creutzfeldt Jakob gibi bulaşıcı hastalıkların bulaş riski yoktur. 8 2.4.3. KLİNİK UYGULAMA PRP’nin klinik kullanımı ortopedi, maksillofasiyal cerrahi, çene cerrahisi, plastik cerrahi alanlarında ve kronik yaraların tedavisinde yaygın bir şekilde bildirilmiştir [56]. Genellikle güvenli ve etkin bir tedavi şekli olmasına karşın trompositopeni, platelet disfonksiyonu, kanser, enjeksiyon bölgesinde enfeksiyon gibi durumlarda dikkatli olunması önerilir [57]. Literatüre bakıldığında çalışmalardaki katılımcı sayının düşük ve tekniklerin standart olmamasından dolayı PRP kullanımıyla ilgili sonuçlar çelişkilidir. Bu tarz çalışmalara örnek olarak periodontal ve oral cerrahi pratiğindeki sinüs lift, maksilofasiyal cerrahi, mandibula kemik greftleri, plastik cerrahi pratiğindeki face lift ve kozmetik dermal yağ greftleri, ortopedi pratiğindeki kemik, kıkırdak ve tendon rekonstrüksiyonu, kalp ve damar cerrahisi pratiğindeki bypass ameliyatları, kronik cilt ve yumuşak doku ülserlerini kapsayan yayınlar gösterilebilir [56, 58-61]. 2.4.4. KULAK BURUN BOĞAZ ALANINDA KULLANIMI Literatürde Otorinolaringolojinin farklı disiplinlerinde PRP kullanımıyla iligili seyrek olmakla beraber çalışmalar mevcuttur. Örnek verecek olursak yapılan bir pilot çalışmada altı aydan uzun süredir anosmi ve hiposmi şikayeti olan, sinonazal inflamatuar hastalığı bulunmayan ve topikal steroid tedavisine yanıt vermeyen yedi hastanın olfaktör mukozasına tek doz PRP enjeksiyonu yapılması sonucu belirgin fayda sağlanmıştır [62]. 80 hastadan ibaret bir diğer çalışmada pediatrik tonsilektomi sonrası tonsil lojuna topikal PRP tatbikinin kısa dönem postoperatif ağrıyı azaltığı, iştah, analjezi ihtiyacı ve kanama oranlarına olumlu yönde etkisinin olduğu gösterilmiştir [63]. Benign parotis tümörü nedeniyle süperfisyel parotidektomi yapılan 59 hastalık bir diğer çalışmada parotidektomi lojuna PRP tatbikinin hastaların hospitalizasyonu, dren süresi, postoperatif fasial parezi oranlarına olumlu etkisi olabileceği gösterilmiştir [64]. 9 Literatürde de vurgulandığı üzere miringoplasti sonrası başarısızlık oranları erişkinlerde % 20-40, çocuklarda % 65- lere kadar çıkabilmektedir [65]. Bu nedenle miringoplasti sonrası zar iyileşmesini artıran yeni metodların arayışında fayda bulunmaktadır. PRP’nin kulak zarı iyileşmesine pozitif katkısını gösteren, ülkemizde ve yurtdışında yapılmış olan sınırlı sayıda hayvan deneyi ve klinik çalışmalar mevcuttur. Örnek olarak 44 denekten ibaret rat deney modelinde her iki kulak zarına yapılan standart perforasyon sonrası deney grubuna uygulanan PRP nin kulak zarının ortalama iyileşme zamanını hızlandırdığı gösterilmiş ve istatistiksel olarak anlamlı sonuç elde edilmiştir [66]. Benzer bir çalışmada 12 Yeni Zellanda cinsi tavşanların her iki kulağı perfore edildikten sonra deney grubuna uygulanan topikal PRP nin kulak zarının histopatolojik parametrelerine olumlu katkı sağladığı görülmüş fakat istatistiksel olarak anlamlı fark bulunamamıştır [67]. Başka bir klinik çalışmada 64 hastadan ibaret geniş santral perforasyonu olan hastalar iki gruba bölünmüş, her iki gruba postauriküler yaklaşımla underlay greft tekniği kullanarak miringoplasti yapılmıştır. Deney grubunda greft lateral yüzüne ve timpanik membran kalıntısına otolog olarak hazırlanmış PRP jel uygulanmıştır. Takiplerde altı ay sonrası deney grubunda miringoplasti başarı oranında anlamlı fark görülmüştür [68]. 10 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1.DENEK SEÇİMİ Çalışma için 10-12 haftalık, sağlıklı, ortalama 250-300 gram ağırlığında 24 erkek Albino Wistar sıçanı kullanılmıştır. 3.2.ETİK KURUL İZNİ Çalışma için Kobay Deney hayvanları laboratuvarı Yerel Etik Kurulu’nun 10.07.2019 tarihli, 382 Sayılı kararıyla onay alınmıştır. 3.3.DENEK SAYISI VE GRUPLAR Topikal PRP tatbikinin kulak zarı iyileşmesi üzerine etkisini incelemek için deneklerin sol kulakları deney grubu, sağ kulakları kontrol grubu olarak belirlenmiştir. Deney ve kontrol grupları da kulak zarı iyileşmesinin erken ve geç evresinin incelenmesi açısından alt gruplara bölünmüş olup bunlar oluşturuken literatür taranmıştır. İşlem sonrası 2. ve 4. haftalarda sakrifikasyon ve örnek alınacak şekilde iki alt grubun oluşturulmasının incelenmek istenen parametreleri karşılayacağı düşünülmüştür [22]. Toplam denek sayısı 24, kulak sayısı 48 olarak belirlenmiştir. 3.4.DENEY ORGANİZASYONU VE CERRAHİ İntraperitoneal 50 mg/kg Ketamin ve beş mg/kg xylazin hidroklorid enjeksiyonuyla anestezi hali oluşturulduktan sonra her bir denekten iki ml 11 intrakardiyak kan alınmıştır. Alınan kan sodium sitrat içeren tüplere yerleştirildikten sonra beş dakika 1200 g santrifügasyon uygulanmıştır. En altta eritrosit, ortada platelet ve lökosit, en üstte ise plateletten fakir plazmanın toplandığı üç katman oluşmuştur . Plateletten fakir plazma ekarte edildikten sonra malzeme on dakika 1200 g santirfüje edilmiştir ve eritrositler ekarte edildikten sonra yaklaşık 0.5 ml PRP elde edilmiştir (Şekil 3.4-1). Daha sonra deneklere uygun pozisyon verilmiştir. Kulak spekulumu kullanılarak her iki dış kulak yolu ve zar Leica marka operasyonel mikroskopla inspekte edilip deneklerde otitis media ve eksterna ekarte edilmiştir (Şekil 3.4-2 ; 3.4- 3). Parasentez bıçağı kullanılarak her iki kulak zarı posterior kadranında subtotal perforasyon oluşturulmuştur (Şekil 3.4.-4). Oluşturulan perforasyon kenarlarına 10% Gümüş Nitrat çözeltisi pik yardımıyla uygulanmıştır. Deney grubu olan sol kulaklar için PRP emdirilmiş gelfoam kullanılarak miringoplasti yapılmıştır (Şekil 3.4-5). Kontrol grubundaki sağ kulaklar içinse serum fizyolojik emdirilmiş gelfoam kullanılmıştır. Deneklerde işlem süresi, kulak zarı kapanma zamanı ve oranı, iyileşmiş kulak zarında lamina propriya, matür damar sayısı, vaskülarize ve nekrotik alan değerlendirmesi planlanmıştır. 3.4.1. BAKIM VE SAKRİFİKASYON İşlem sonrası deneklere herhangi bir kısıtlama uygulanmamış, su ve gıda ad libitum olarak bulundurulmuştur. Denekler 2 ve 4 haftalık iyileşme süresince takip edilmiştir. Sakrifikasyon yüksek doz eter anestezisi sonrası servikal dislokasyonla yapılmıştır. Ardından direk bakı altında manüel olarak yapılan dekapitasyon sonrası temporal kemik ekstrakte edilmiş ve etrafında kemik anulusu bulunan kulak zarına kadar indirgenmiştir (3.4.1-1). Kulak zarı makroskopik olarak incelenmiştir. 3.5. HİSTOPATOLOJİK İNCELEME Histopatolojik değerlendirme için formalin ile fikse örnekler bir gün dekalsifiye edildikten sonra takibe alınmıştır. Spesimenlerin işlem bölgesi çini mürekkebi ile işaretlenmiş ve özellikle çini mürekkebi ile işaretlenmiş alanlar değerlendirilmiştir. (Şekil 3.5-1). Örnekler kulak zarına dik olacak şekilde parafine 12 gömülmüştür. dört mikrometre kalınlığında hazırlanan kesitler hematoksilen ve eozin (HE) boyası ile boyanmıştır. Şekil 3.4-1: Santrifügasyon ve PRP elde edilmesi Şekil 3.4-2 : Deney düzeneği Şekil 3.4-3 : Mikroskop altında zarın görüntüsü Şekil 3.3-4 : Perforasyon oluşturduktan sonra görünüm 14 Şekil 3.4-5 : Miringoplasti sonrası görünüm. 15 Şekil 3.4.1-1: Temporal kemikten diseke edilmiş kulak zarı spesimeni 16 Şekil 3.5-1: Mikroskop altında işlem alanının çini mürekkeple işaretlenmesi 17 4. BULGULAR Cerrahi işlem sonrasında deneylerin hiç birinde kulak enfeksiyonu tablosu görülmemiştir. 24 hayvan, 48 kulaktan ibaret deney grubunda herhangi bir nedenden dolayı denek kaybı yaşanmamıştır. 4.1.İSTATİSTİKSEL ANALİZ İstatistiksel analiz IBM SPSS V23 uygulaması kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Çalışmamız sonucu ulaşılan nitel verilerde iki bağımlı grup için McNemar, iki bağımsız grup için Ki Kare testi kullanılmıştır. Sayısal değişkenlerde iki bağımlı grup için Wilcoxon testi kullanılmıştır. 4.2.MAKROSKOPİK BULGULAR Tablo 4.2-1.Deney ve kontrol gruplarında perforasyon kapanma süresi. İşlem yapıldıktan sonra günlük mikroskopik incelemeler sonucu kulak zarındaki perforasyonun kapanma zamanları belirlenmiş olup deney grubunda en erken 7. gün , en geç on günde olmak üzere ortalama sekiz gündür. Kontrol grubunda bu süre en erken 7.gün, en geç 12 gün olmak suretiyle ortalama dokuz gündür (Tablo4.2-1). Bu fark istatistiksel olarak karşılaştırıldığında anlamlıdır (p=0.01). Taraf Sayı En erken En geç Ortalama süre Sol 21 7.gün 10.gün 8.gün Sağ 15 7.gün 12.gün 9.gün 18 Tablo 4.2-2.Kontrol grubu alt grupları iyileşme oranı Leica M320 F12 cerrahi mikroskopuyla kontrol grubu olan sağ kulak zarı iyileşme oranları 2. ve 4. haftalarda 12 şer denekden ibaret 1. ve 2. alt grupta incelenip McNemar tesi kullanılarak karşılaştırılmıştır. 1.alt grupta yedi kulakta (% 58.3) , 2. alt grupda sekiz kulakta (% 66.7) iyileşme saptanmış olup (Tablo 4.2-2) istatistiksel olarak karşılaştırıldığında anlamlı fark yoktur (p=1). Taraf Grup Sayı İyileşen Perfore Yüzde Sol 1 12 11 1 %91.7 Sol 2 12 10 2 %88.3 Tablo 4.2-3.Deney grubu alt grupları iyileşme oranı Deney grubu olan sol kulakların kulak zarı iyileşme oranları karşılaştırıldığında 1. alt grupta % 91.7 , 2. alt grupta % 88.3 lik iyileşme oranı saptanmış olup (Tablo 4.2-3) istatistiksel olarak karşılaştırıldığında anlamlı fark yoktur (p=1). Taraf Grup Sayı İyileşen Perfore Yüzde Sağ 1 12 7 5 % 58.3 Sağ 2 12 8 4 % 66.7 19 Taraf Sayı İyileşen Perfore Yüzde Sol 24 21 3 %87.5 Sağ 24 15 9 %62.5 Tablo. 4.2-4.Deney ve kontrol grubu iyileşme oranı Alt gruplardan bağımsız olarak kontrol tarafı olan sağ ve deney tarafı olan sol kulakda kulak zarı iyileşme oranları karşılaştırıldığında sağ kulakta % 62.5, sol kulakta % 87.5 lik iyileşme oranı saptanmış olup ( tablo 4.2-4) istatistiksel olarak karşılaştırıldığında anlamlı fark yoktur (p=0.07) Taraf Sayı Minimum süre Maksimum süre Ortalama süre Sol 24 24 dk 29 dk 24 dk Sağ 24 9 dk 14 dk 11 dk Tablo 4.2-5.Deney ve kontrol gruplarında işlem süresi İşlem süreleri karşılaştırıldığı zaman deney tarafı olan sol tarafta minimum 24 dakika, maksimum 29 dakika olmak suretiyle ortalama 24 dakika olarak bulunmuştur. Bu intrakardiyak kan alımı ve PRP hazırlanmasından dolayı beklenen durumdur. Kontrol tarafı olan sağ kulakta işlem süresi minimum dokuz dakika, maksimum 14 dakika olmak suretiyle ortalama 11 dakikadır (Tablo 4.2-5). Deney grubu olan sol kulaklarda PRP hazırlama işlemi nedeniyle süre daha uzundur ve bu fark istatistiksel olarak karşılaştırıldığında anlamlıdır (p=0.001). 20 4.3.HİSTOPATOLOJİK BULGULAR Hazırlanan kesitlerde kulak zarı ve özellikle çini mürekkebi ile işaretlenmiş alanlar değerlendirilmiştir. Perfore olup miringoplasti uygulanan kulak zarına ait doku parçalarının temsil edildiği alanlarda kulak zarının epitel ile döşeli olup olmadığı, epitel kalınlığı ve lamina propriya varlığı değerlendirilmiştir. İyileşmenin olduğu alanlarda kulak zarının inceldiği ve tek katlı epidermal tabaka ile döşeli olduğu görülmüştür. Lamina propriyanın varlığı ve kalınlığı da epidermal ve mukozal tabaka hücrelerinin arasındaki kollajenize dokunun ve fibroblastların varlığı ile değerlendirilmiştir. Kulak zarının iki taraflı epitel tabakasının bitişik olduğu örnekler ‘lamina propriya yok’, kollajenize dokunun görüldüğü örnekler ise ‘lamina propriya var’ olarak kabul edilmiştir. Denekler sakrifiye edilip spesimenler histopatolojik açıdan incelendiğinde iyileşmiş kulak zarı segmentinin lamina propria (LP) katmanının dokuz spesimende rejenere olmadığı (Şekil 4.2-1), 19 spesimende rejenere olduğu (Şekil 4.2-2) gözlemlenmiştir. Taraf Grup Sayı LP+ LP- Yüzde Sağ 1 7 5 2 % 71.4 Sağ 2 8 4 4 % 50 Tablo 4.3-1.Kontrol grubu alt grupları lamina propria iyileşme oranı Kontrol grubunun 2. ve 4. haftalarda incelenen 1. ve 2. alt grupların kulakları karşılaştırıldığında lamina propriyanın 1. grupta % 71.4 oranında , 2. grupta % 50 oranında mevcut olup (tablo 4.3-1) gruplar arasında istatistiksel olarak karşılaştırma yapıldığında anlamlı fark yoktur (p=0.608). Taraf Grup Sayı LP+ LP- Yüzde Sol 1 11 11 %100 Sol 2 10 8 2 %80 Tablo 4.3-2.Deney grubu altgrupları lamina propria iyileşme oranı 21 Deney grubunun 1. ve 2. alt grupların kulakları karşılaştırıldığında lamina propriya 1. grupta % 100 oranında , 2. grupta % 80 oranında mevcut olup (tablo 4.3- 2) istatistiksel olarak karşılaştırma yapıldığında gruplar arasında anlamlı fark yoktur (p=0.214). Tablo 4.3-3.Deney ve kontrol grubu lamina propria iyileşme oranı Alt gruplardan bağımsız deney ve kontrol grubu kulaklarda lamina propriya iyileşme oranları karşılaştırıldığında sağ kulakta % 57.1 , sol kulakta % 92.9 luk iyileşme oranı saptanmış olup (tablo 4.3-3) istatistiksel olarak karşılaştırdığımızda anlamlı fark yoktur (p=0.063). Kontrol grubundan dokuz, deney grubundan 19 spesimen incelendiğinde kontrol grubuna oranla deney grubunda matür damar sayısı ve vaskularize alan yüzdesi daha fazla, nekrotik alan daha az olduğu izlenimi edinilmiştir. Bu parametreler teknik kıstlılıklar nedeniyle az sayıda spesimende bakılabilmiş, bu nedenle istatistiksel kıyaslama yapılamamıştır. Spesimenlerin boyut olarak küçük olmasından dolayı kesit almada teknik açıdan zorluk yaşanmış, bu yüzden de bazı spesimenlerde histopatolojik olarak lamina propria katmanının değerlendirilmesi yapılamamıştır. Bu durum 12 ( % 25 ) spesimene tekabül etmektedir. Taraf Sayı LP+ LP- Yüzde Sol 21 19 2 %92.9 Sağ 15 9 6 %57.1 22 Şekil 4.2-1: Mürekkeple işaretli bölgede lamina propria olmaksızın iyileşen atrofik kulak zarı. Mavi ok başı ile işaretli bölge: kübik epitel. Sarı ok başı ile işaretli bölge: skuamoz epitel. 23 Şekil 4.2-2: Mürekkeple işaretli bölgede lamina propria rejenerasyonu ile iyileşen kulak zarı segmenti. Kırmızı çift okla işaretli bölge: lamina propria . Mavi ok başı ile işaretli bölge: kübik epitel. Sarı ok başı ile işaretli bölge: skuamoz epitel. 24 5. TARTIŞMA Miringoplasti ve timpanoplasti sıkça uygulanan, yaş yelpazesi geniş ve olumlu veya olumsuz sonucunun hayat kalitesine etkisinin önemli olduğu girişimlerdir. Operasyonunun fonksiyonel amaçlarını gerçekleştirmek adına akut veya kronik kulak zarı perforasyonunun iyileşmesi ve kapanması hayati önem arzetmektedir. Bundan dolayı potansiyel olarak bu yönde iyileşmeyi artıran ve başarı oranlarını yükselten ajanların kullanımı hem hasta hem cerrah açısından son derece önemlidir. Çalışmamızın amacı timpanoplasti ve miringoplasti işlemleri sırasında görece kolay hazırlanan, güvenli, uygun maliyetli bir ürün olan Platelet Rich Plasma (PRP)’-nın zar perforasyonu iyileşmesi üzerinde olası olumlu etkilerinin incelenmesi ve de doğrulanmasıdır. Bu durumda cerrahi pratiğimize yeni bir ürün kazandırılması söz konusu olabilir. Yine PRP’nin bu bağlamda maliyetinin düşük olması ve kullanım kolaylığı nedeniyle bahsi geçen ameliyatlarda başarı oranına etkisi incelenmiştir. Kulak zarı perforasyonlarının lamina propriya katmanı rejenere olmadan iyileştiği zaman yüksek frekanslı ses iletiminin azaldığı ve retraksiyonlara direncinin azaldığı yapılan çalışmalarda gösterilmiştir [69]. Çalışmamızın temel amacı PRP’nin zar perforasyonu iyileşmesi ve yeni oluşan zarda lamina propriya katmanının oluşması üzerinde olumlu etkisi olup olmadığının hayvan deney modelinede incelenmesidir. Son iki dekatta PRP’nin farklı akut ve kronik süreçler için rejeneratif tıpta kullanımında artış izlenmektedir. PRP tedavisinin bu kadar çabuk kabul görmesindeki esas etkenler olarak da göreceli güvenli kullanım ve elde etmesinin kolay olması gösterilebilir. PRP konsepti ve tanımlanması 1970’lerin sonunda hematoloji alanında başlamıştır [70]. Önceleri, trombositopenili hastaların tedavisinde kullanılmak üzere periferik kandan daha yüksek oranda trombosit içeriği olan transfüzyon ürünü olarak tarif edilmiştir [71]. Yaklaşık 10 yıl sonrasında PRP’nin maksillofasiyal cerrahide kullanılmaya başladığı görülmektedir. Günümüzde PRP’nin ortopedide popülerliğinin artmasıyla beraber Amerika Birleşik Devletleri’nde (ABD) yıllık yaklaşık 86.000 sporcunun bu yöntemle tedavi edildiğini izlemekteyiz [72]. Profesyonel sporcuların 25 tedavisinde kullanımı geniş bir şekilde medyada yansıtılmasına ve dolayısıyla popülerliğine katkıda bulunmuştur. PRP kullanımının artmasına rağmen etkinliği hala tartışma konusu olmaya devam etmektedir. Yararlı olduğunu gösteren çalışmaların yanında her hangi bir pozitif etkisinin olmadığı sonucuna varan çalışmalar da mevcuttur. Otolog kanda bulunan plateletler yara alanına bir çok büyüme faktörü salgıladıklarından dolayı iyleşmeye katkı sağlarlar [45]. Bunun dışında iyileşen dokudaki hücrelerin mitogenezi ve doku anjiogenezini de uyararak etkisini gösterir. Bundan dolayı da göreceli yeni ortaya çıkmış bu tedavi yönteminde artmış trombosit sayısıyla beraber artmış büyüme faktörünün teorik olarak iyileşme sürecini artırdığı söylenebilir [56]. Osteoartrit gibi dejeneratif hastalıklar için yapılan in vitro çalışmalarda PRP kullanımının kartilaj matriksi üretimi için kondrosit ve sinovisitleri uyardığı, IL-1 gibi inflamasyon mediyatörlerini ise azalttığı gösterilmiştir [73]. Benzer başka çalışmalarda PRP nin artmış mRNA gen ekspresyonu yoluyla kartilaj altyapısının organizasyonundaki iki önemli molekül olan Proteoglikan ve tip 2 kollajen sentezini de artırdığı gösterilmiştir [74]. 2013 yılında PRP nin osteoartrit tedavisine etkisinin incelendiği sistematik bir araştırmada 12 in vitro, sekiz in vivo, bir in vitro ve in vivo toplam 21 çalışmanın 15 inde artmış kondrosit ve mezemşimal hücre proliferasyonu, artmış proteoglikan ve tip 2 kollajen birikimi saptanmıştır. Ayrıca PRP’nin kondrosit viabilite ve migrasyonunu, mezenşimal kök hücrelerinin kondrojenik diferansasyonunu arttırdığı gözlenmiştir. İn vivo çalışmalarda PRP implant ve greftleme ameliyatlarında topikal olarak kullanılmıştır. Ancak kartilaj iyileşmesinde PRP nin pozitif katkısını tüm çalışmalar gösterememiştir [74]. Düşük metabolik hızlarından dolayı tendonların genel olarak yavaş iyileşmesi gerçeği ışığında PRP’nin iyileşme hızını arttırdığını gösteren çalışmalar mevcuttur. Kesilmiş koyun tendonlarında PRP nin VEGF ve hepatosit büyüme faktörünü artırarak anjiogenezi stimüle edip inflamatuar fibrozu azaltdığı gösterilmiştir [75]. 26 Benzer rat modeli çalışmalarındada PRP nin kemik tendon iyileşmesi ve remodelingini artırdığı gösterilmiştir [76]. 2012 tarihli insanların rotator kılıf tendonlarını inceleyen çalışmada kalsiyumla aktive edilmiş PRP nin tendonların proteoglikan ve glikoproteinden sorumlu decorin ve Tenascin-C genlerini önemli ölçüde artırdığı gözlemlenmiştir. Ayrıca PRP kullanımının kollajen ve proteoglikan sentezini de arttırdığı görülmüştür [77]. Mevcut çalışmalar incelendiğinde çelişen sonuçlara da ulaşmak mümkündür. Örnek olarak 2015 tarihli bir çalışmada cerrahi sırasında elde edilmiş 11 insan ön çapraz bağlarına farklı konsantrasyonlardaki PRP’nin etkisi incelenmiştir. Çalışmanın sonucunda eklenen farklı konsantrasyonlardaki PRP’nin hücre viabilitesini artırmadığı, aksine kontrol grubuna oranla apoptozu arttırdığı görülmüştür [78]. Literatürdeki çalışmaların büyük çoğunluğu PRP’nın yara iyileşmesine olumlu katkı sağlayabileceğini göstermiştir. Bizde bu bulguların ışığında PRP’nın kulak zarı iyileşmesi üzerine olası olumlu etkilerinden faydalanmak istedik. Literatürde Otorinolaringolojinin farklı disiplinlerinde PRP kullanımıyla iligili seyrek olmakla beraber çalışmalar mevcuttur. PRP’nın rejeneratif özelliklerinden faydalanılmak istenen bu çalışmalara örnek olarak Yan CH ve ark. pilot çalışmada 6 aydan uzun süredir anosmi ve hiposmi şikayeti olan, sinonazal inflamatuar hastalığı bulunmayan ve topikal steroid tedavisine yanıt vermeyen yedi hastanın olfaktör mukozasına tek doz PRP enjeksiyonu yapmıştır [62]. Enjeksiyon sonrası tüm hastalar koku duyularında subjektif iyileşme bildirsede daha sonra bulgular stabilize olmuştur. 3. ay takibinde fonksiyonel anosmisi olan hastanın semptomlarında değişiklik olmamış, hiposmisi olan 5 hasta koku testlerinde %60 düzelme göstererek normosmi düzeyine ulaşmıştır. Çalışmanın tek kollu olması ve hasta sayısının azlığı, kontrol grubunun olmaması kısıtlamaları olarak gösterilebilir. Öncelikli amacın PRP kullanımının güvenirliği ve tolere edilebilirliğinin gösterilmesi olarak görüldüğünden daha detaylı çalışmalar için zemin hazırlamaktadır. 27 Kütük ve ark. ın 80 hastadan ibaret çalışmasında pediatrik tonsilektomi sonrası tonsil lojuna topikal PRP tatbikinin kısa dönem postoperatif ağrı, iştah, analjezi ihtiyacı ve kanama oranlarına etkisini incelemiştir [63]. Hastalar her birisi 40 hastadan ibaret sadece tonsilektomi ve tonsilektomiyle berabaer PRP terapisi grubu olarak ikiye ayrılmıştır. Postoperatif ağrı ve iştah skorları, analjezik ihtiyacı ve kanama kaydedilmiştir. Sadece tonsilektomi grubuyla kıyaslanıldığı zaman tonsilektomiyle beraber PRP grubunun 1-10 günlerde ağrı, 1-6 günlerde iştah, 1-10 günlerde analjezik ihtiyacı skorları belirgin daha iyi olmuştur. Kontrol grubundaki dört kanamaya kıyasla deney grubundaki bir kanama durumu kaydedilmiştir. Parametreler istatistiksel olarak kıyaslanıldığı zaman anlamlı bulunmuştur (p < 0.001). Ricci ve ark. ın benign parotis tümörü nedeniyle süperfisyel parotidektomi yapılan 59 hastalık çalışmasında parotidektomi lojuna PRP tatbikinin hastaların hospitalizasyonu, dren süresi, postoperatif fasial parezi oranlarına etkisini incelemiştir [64]. Kontrol grubunda olan 38 hastaya sadece süperfisyal parotidektomi, 21 hastadan ibaret deney grubuna süperfisyal parotidektomi ve operasyon lojuna PRP tatbiki yapılmıştır. Kontrol grubunda ortalama dren süresi üç gün, deney grubunda iki gün olmuştur (p<0.05). Ortalama hospitalizasyon süresi kontrol grubunda dört, deney grubunda beş gün olmuştur (p<0.05). Postop fasiyal parezi kontrol grubunda dört (%10.5) , deney grubunda iki (%9.5) hastada izlenmiştir. 24 saat sonunda kontrol grubunda 2 hastada daha fasiyal parezi gelişmiş ve total hasta sayısı altıya (%15.7) yükselmiştir. Hiçbir hastada parezi kalıcı olmamış ve iki ay içerisinde rezolüsyona uğramıştır. Kontrol grubunda yedi (18.4%) hastada, deney grubunda iki (%9.5) hastada sialosel görülmüştür (p<0.05). Frey sendromu ve keloid formasyonu hiç bir hastada görülmemiştir. Sonuç olarak operasyon lojuna PRP tatbikinden hastalara klinik olarak fayda sağlandığı düşünülmektedir. Hayvan deney çalışmamızdaki hedeflerimiz PRP’nın rejeneratif özelliklerinden faydalanarak kontrol grubuna oranla deney grupu kulak zarlarında perforasyon kapanma süresi, yüzdesi, lamina propriya oluşumu, matür damar sayısı ve vaskülarize alan yüzdesini daha fazla bulmaktı. Kontrol ve deney grupları kıyaslanıldığı zaman perforasyon kapanma süresinde kontrol grubu lehine olumlu ve anlamlı fark bulundu (p=0.0145). İstatistiksel açıdan anlamlı olmasa bile deney 28 grubunda perforasyon kapanma yüzdesi, lamina propriya oluşumu, matür damar ve vaskularize alan yüzdesinin daha iyi olduğunu gördük. PRP’nin kulak zarı iyileşmesi üzerine etkisini araştıran çalışma sayısı kısıtlıdır. 2018 yılında ülkemizde 20 rat üzerinde yapılan bir çalışmada iki gruba ayrılan denekler üzerinde yağ miringoplasti sonuçlarına topikal PRP’nin etkisi incelenmiştir. Random olarak her birinde 10 denek olmak üzere iki gruba ayrılan deneklerin sol kulaklarina miringotomi yapılmıştır. Kontrol grubunda miringotomi sonrası inguinal bölgeden alınan yağ grefti kum saati şekline getirilip miringotomi bölgesine yerleştirilmiştir. Deney grubuna aynı işlem yapılmakla beraber yağ grefti uygulanmadan önce beş dakika boyunca denekten elde edilmiş PRP içinde bekletilmiştir. 21 günlük takipten sonra sakrifiye edilen deneklerin kulak zarları ekstrakte edilip incelenmiş ve gruplar karşılaştırılmıştır. Kontrol grubuna kıyasla deney grubunda adiposit alanı ve matür damar miktarı daha fazla bulunmuştur. Bu bulgular histopatolojik incelememizde edindiğimiz izlenimlerle uyumludur. Kontrol grubunda granulasyon dokusu ve vaskularizasyon alanı daha fazla görülmüş, deney grubundaysa istatistiksel olarak anlamlı olmamakla beraber (p>0.05) nekrotik alan daha küçük gözlemlenmiştir. Bu çalışmada bizim çalışmamızdan farklı olarak akut perforasyon oluşturulduktan sonra yara kenarlarına gümüş nitrat veya benzeri yara iyileşmesini geciktiren kimyasal tatbikinin olmaması bu çalışmadan çıkan sonuçların kronik perforasyonlar için geçerliliğini tartışmaya açık hale getirmektedir. Ancak miringoplasti sırasında yara kenarlarının avive edilerek işlemin yapılması karşı argümanı kullanılabilir. Çalışmamızla gözlemlediğimiz diğer farklı taraf, greftleme sonrası mikroskopik incelemenin günlük değil 3. 5. 7. ve 10. günlerde yapılmış olmasdır ve sonuç olarak perforasyonun tam kapandığı günün belli olmamasıyla sonuçlanmıştır. Düzenli aralıklarla yapılan mikroskopik incelemeler sayesinde bu sorunu aştığımıza inanıyoruz. Çalışmamızda perforasyon kapanma zamanları deney grubunda ortalama 8 gün, kontrol grubunda ortalama 9 gündür. Bu fark istatistiksel olarak karşılaştırıldığında anlamlıdır (p=0.01). Kontrol grubunda 1 kulakta greft rejeksiyonunun olması, deney grubunda tüm greftlerin intakt olması çalışmamızda deney grubu perforasyon kapanma oranının daha iyi olduğu bulgusuya uyumludur [79]. 29 Yine 2017 yılında PRP’nin akut timpanik membran perforasyonu iyileşmesi üzerine etkisinin incelendiği bir çalışmada 12 Yeni Zellanda tavşanı kullanılmıştır. 2 grupta incelenen deneklerin bilateral kulak zarlarının pars tensa kısmına iğne yardımıyla perforasyon oluşturulmuştur. Daha sonra deneğin kendisinden elde edilen PRP sağ kulağına uygulanmış, sol kulak ise kontrol grubu olarak bırakılmıştır. Deneklere 1, 4, 7, 10, 13, 16, 21, ve 35. günlerde kulak muayenesi yapılarak perforasyonun kapanma süresi not edilmiştir. Denekler işlem sonrası 2. ayda sakrifiye edilerek kulak zarlar ekstrakte edilmiş ve histopatolojik incelemeye tabii tutulmuştur. Deney grubunda perforasyonun kapanma süresi 12 gün, kontrol grubundaysa 17.7 gün olarak belirlenmiş ve bu fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p=0.0145). Çalışmamızda da deney grubu perforasyon kapanma süresi daha erken olup fark istatistiksel olarak anlamlıdır (0.01). Ancak gruplar arasında akut inflamasyon, kronik inflamasyon ve lamina propria konjesyonu arasında istatistiksel olaral anlamlı fark görülmemiştir. Buna sebep olarak hem kontrol hem deney grubunun 2. ayda sakrifikasyonu vede bu kadar uzun süre zarfında doğal iyileşme sürecinin iki grup arasındaki farkları minimize ettiği gösterilebilir. Lamina Propriya iyileşme oranları arasındaki fark çalışmamızda da istatistiksel açıdan anlamlı farklı (p=0.063) bulunmamıştır ancak gözlemimiz deney grubunda bu katmanın daha fazla iyileştiği yönündedir. Deney yapılırken tavşanlarda spontan kulak zarı kapanma süresiyle ilgili ön değerlendirmenin yapılıp sakrifikasyon zamanının uygun olarak belirlenmemesi çalışmanın kısıtlı yanı olarak gösterilebilir. Çalışmamız Araujo ve ark.’nın ratlarda akut perforasyon sonrası kulak zarı spontan kapanma süresinin 8.5 gün olarak bulunduğu çalışması[80] referans alınarak yapılmıştır. Ayrıca sakrifikasyon ve dekapitasyon sonrası elde edilen kulak zarı spesimeninin miringoplasti işlemi görmüş segmentinin histopatolojik inceleme sırasında nasıl işaretlenmiş olduğuyla ilgili bilginin bulunmaması çalışmanın kısıtlı yanı olarak gösterilebilir. Tavşan modeli değil rat modeli kullanmış olmamız dolayısıyla daha küçük spesimenle çalışıyor olmamıza rağmen bu sorunu işlem bölgesinin çini mürekkep kullanarak işaretlenmesi yoluyla aştığımıza inanıyoruz. Bu detay daha sonra yapılacak olan benzer çalışmalara yol gösterme açısından önemli olabilir [67]. İnsanlar üzerinde yapılan 2018 tarihli bir çalışmada yağ miringoplasti sonuçlarına PRP ve Hyaluronik asit (HA) etkisi incelenmiştir [79]. 69 hastanın 30 incelendiği çalışmada 3 grup belirlenmiştir. 1. gruptaki hastalara standart miringoplasti işlemi sonrası hastaların kanından elde edilen PRP ve yağ grefti kulak zarına lateralden tatbik edilmiştir. Daha sonra dış kulak yolu gelfoamla doldurulmuştur. 2. gruptaki hastalara yine standart miringoplasti işlemi uygulanmış, sonrasında sıvı haldeki HA greft ve zar üzerine lateralden tatbik edilmiştir. Üzerine tekrar HA emdirilmiş gelfoam uygulanarak dış kulak yolu doldurulmuştur. 3. Kontrol grubundaysa sadece yağ miringoplasti işlemi yapılmış, herhangi adjuvan ürün kullanılmamıştır. Kulak zarı kapanma oranları 1. PRP grubunda % 85.7 2. HA grubunda % 87 ve 3. Kontrol grubunda % 60 olarak görülmüştür. PRP ve HA grupları arasındaki farkın istatisitiksel olarak anlamlı olmadığı (p=0.90581285) belirlenmiştir. 3. Kontrol grubuyla 1. ve 2. gruplar arasındaki fark sırasıyla (P=0.05) ve (P=0.03577076) olarak belirlenip anlamlı bulunmuştur. Çalışmanın kısıtlı yanı olarak kulak zarı perforasyonlarının boyutunda standartın olmaması gösterilebilir. Pick yardımıyla olabildiğince standart perforasyon oluşturmaya çalışılsada deneklerin boyut olarak küçük ve kulak zarlarının hassas olmasından kaynaklı her zaman başarılı olunamamıştır. Dolayısıyla aynı kısıtlama çalışmamız için de geçerlidir. Ayrıca klinik çalışma olmasından dolayı kulak zarının histopatolojik incelemesi bulunmamaktadır. Bu şekilde iyileşen kulak zarı segmentinin lamina propriyadan yoksun dolayısıyla atrofik olarak iyileşme ihtimalinin değerlendirilmesi yapılamamıştır. Lamina propriadan yoksun atrofik kulak zarının yüksek frekans işitme kaybıyla ilişkisi yapılan çalışmalarda gösterilmiştir [69]. Çalışmamızın hayvan deneyi olmasından dolayı böyle bir sorun bulunmamaktadır. Ekstrakte edilen spesimenler histopatolojik incelemeye tabii tutulmuştur. 2014 yılında 64 hastalık bir çalışmada miringoplasti sonuçlarına PRP etkisi incelenmiştir. Çalışmaya geniş santral perforasyonlu hastalar dahil edilmiştir. Miringoplasti postauriküler olarak icra edilip greft olarak konkal perikondrium kullanılmıştır. Hastaların kendi kanından santrifugasyon yoluyla PRP elde edilmiştir. Miringoplasti underlay teknikle yapıldıktan sonra çalışma grubundaki 32 hastanın greft lateraline tıpa şeklinde PRP uygulanmış, kontrol grubundaysa aynı şekilde gelfoam kullanılmıştır. 6-16 aylık takipten sonra bulgular incelendiğinde çalışma grubundaki perforasyon kapanma oranının (% 100) kontrol grubuna kıyasla (% 81.25) istatistiksel açıdan anlamı olarak yüksek olduğu görülmüştür. Çalışmamızda kulak zarında kontrol grubunda % 62.5, deney grubunda % 87.5 lik iyileşme oranı 31 saptanmıştır. İstatistiksel olarak karşılaştırdığımızda anlamlı fark olmasada (p=0.07) PRP grubu sonuçlarının daha iyi olması çalışmamızla uyumludur. 10 dB ve üzeri işitme kazancı bulunan hastalar kıyaslandığında çalışma grubunda 21 hasta (% 65.6) , kontrol grubundaysa 11 hasta (% 34.4) olduğu saptanmış ancak bu fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır(p=0.079). Yine klinik çalışma olmasından dolayı ve de atrofik kulak zarı araştırması açısından histopatolojik incelemenin bulunmaması kısıtlı yanı olarak gösterilebilir. Çalışmamızda iyileşmiş kulak zarlarında lamina propriya iyileşme oranları kıyaslanıldığında istatistiksel olarak anlamlı olmasada deney grubunun sonuçlarının daha iyi olduğu görülmektedir (p=0.063). Ancak postoperatif olarak hastalara işitme testinin yapılması, istatistiksel olarak anlamlı fark olmamasına rağmen çalışma grubunda 10 dB ve üzeri işitme kayıplı hastaların sayısının daha fazla olması çalışmanın kuvvetli yönü olarak gösterilebilir [68]. Ortalama işlem süresinin çalışma grubunda 24 dakika, kontrol grubunda 11 dakika olması deneklerden intrakardiyak kan alımı ve santrifügasyon yoluyla PRP elde edilmesine bağlıdır. Düşüncemiz bu zaman kaybının PRP’nin olası yararları göz önüne alındığında revizyon cerrahi oranlarını düşürerek bu kaybı haklı çıkaracağı yönündedir. Çalışmamızda akut perforasyon oluşturma ve gümüş nitratla yara kenarlarının işlenmesini takiben yapılan miringoplasti sonrası kulak zarının kapanma süresi deney grubunda ortalama sekiz gün, kontrol grubunda dokuz gün olarak bulunmuştur. Bu sonuçlar 2013 tarihli Araujo ve ark.’ın ratlarde akut perforasyon sonrası spontan iyileşmenin kaçıncı günde oluştuğunun incelediği ve ortalama 8.5 gün sonucunun çıktığı çalışmayla kıyaslandığında anlamlıdır [80]. Ayrıca 2017 tarihli Karataylı ve ark.’ın tavşanlarda akut perforasyon sonrası PRP tatbiki sonuçlarının incelendiği çalışmasında deney grubunda perforasyonun ortalama kapanma süresinin 12 gün, kontrol grubundaysa 17.7 gün olduğu görülmüş olup istatistiksel olarak değerlendirildiğinde anlamlı bulunmuştur (p=0.0145) ve de çalışmamızdaki bulgularla uyumludur [67]. Çalışmamızda kulak zarı perforasyonu iyileşme oranlarını karşılaştırdığımız zaman deney grubunda 21 (%87.5) kulakta , kontrol grubunda ise 15 (%62.5) kulakta kapandığını ve bu farkın istatistiksel açıdan anlamlı olmadığı görülmektedir. 32 Oluşturulan akut perforasyonların çalışma sonucu % 100 kapandığı Karataylı ve ark’ın tavşanlar üzerindeki çalışmasıyla [67] kıyasladığımızda ortaya çıkan fark deneklere 1, 4, 7, 10, 13, 16, 21, ve 35. günlerde kulak zarı kapanana kadar her gün PRP uygulamasıyla açıklanabilir. Çalışmamızda PRP tatbiki perforason oluşumu sonrası yapılan miringoplasti işlemi sırasında sadece tek sefer uygulanmıştır. Bunun nedeni çalışmamızın rat modeli olması ve bahsi geçen deneklerde multiple intrakardiyak kan alımının artmış mortalite ile ilişkili olmasıdır. Ayrıca ameliyat esnasında tatbik edilen PRP’nin devamında hastalara mükerrer tatbikinin mümkün olmayacağı düşünülürse bu yaklaşımın klinik çalışmaya uzak olduğu görülecektir. Çalışmamızda PRP tatbikinin sadece işlem zamanı tek sefer yapılmış olması klinik çalışma modeline daha uygundur. El-Anwar ve ark.’ ın miringoplasti sırasında topikal PRP etkisinin incelendiği 64 hastalık klinik çalışmasında [68] PRP uygulanan grubun miringoplasti başarısının 100 %, kontrol grubunun ise %81.25 olduğu vede farkın istatistiksel açıdan anlamlı olduğu (p=0.02) görülmektedir. Çalışmalar arasındaki istatistiksel farkın hasta ve denek sayıları arasındaki farkla açıklanabileceği düşünülmüştür. Kontrol grubunun 2. ve 4. haftalarda sakrifiye edilen 1. ve 2. alt grubunun deneklerinin kulakları karşılaştırıldığında 1. grupta 7 kulakta (% 58.3) , 2. grupta 8 kulakta (% 66.7) iyileşme saptanmış olup istatistiksel olarak karşılaştırıldığında anlamlı fark yoktur (p=1). Deney grubunun 2. ve 4. haftalarda sakrifiye edilen 1. ve 2. alt grubun deneklerinin kulakları kıyaslandığında 1. grupta % 91.7 , 2. grupta % 88.3 lik iyileşme oranı saptanmış olup istatistiksel olarak karşılaştırıldığında anlamlı fark yoktur (p=1). İstatistiksel olarak anlamlı sonuç elde edilmemiş olsada gözlemimiz PRP grubu sonuçlarının daha iyi olduğu yönündedir. 2. ve 4 haftada incelenmek üzere oluşturulan bu alt grupların esas amacı kulak zarı lamina propriyasında uzun dönem iyileşme sonuçlarının incelenmesidir ve bu süreler Araujo ve ark’ın ratlarda akut perforasyon sonrası kulak zarı spontan kapanma süresinin 8.5 gün olarak bulunduğu çalışması [80] referans alınarak seçilmiştir. Kulak zarı perforasyonlarında epitel katmanının ardından fibröz tabakanın migrasyonunun başarısız olması, ses iletiminde yüksek frekanslarda yetersiz olan, lateralde epitel medialde mukozadan ibaret iki katmanlı zarın oluşmasıyla sonuçlandığı yapılan çalışmalarda gösterilmiştir [23]. Timpanik membranın lamina propria katmanının yüksek frekanslı ses iteliminde öneminin incelenmiş olduğu 33 kadavra çalışmasında O’Conner et al. kadavradan elde edilen 12 spesimende akustik stimulasyonla stapes tabanının hareketini lazer doppler vibrometri kullanarak incelenmiştir [69]. Kulak zarının farklı bölgelerine sirkumferansiyal ve radial kesiler yaparak lamina propriadaki farklı kollajen katmanlarının ekartasyonunu sonucu stapes tabanının hareket hızındaki kayıplar kaydedilmiştir. Sirkumferensiyal insizyonların dört kHz üzerinde stapes tabanında belirgin hız kaybına yol açtığı görülmüştür. Bu kayıp dört kHz-12.5 kHz aralığında 11-14 dB e tekabül etmektedir. Sonuç olarak bu çalışmalar lamina propria katmanı olmadan iyileşen atrofik membran gelişimini engellemenin önemini vurgulamaktadır. Çalışmamızda kontrol tarafı olan sağ ve deney tarafı olan sol kulakta lamina propriya iyileşme oranları karşılaştırıldığında sağda dokuz ( % 57.1) kulakta , solda 19 (% 92.9) kulakta iyileşme saptanmış olup istatistiksel olarak karşılaştırıldığında anlamlı fark olmasa da (p=0.063) histopatoljik inceleme deney grubu sonuçlarının daha iyi olduğu izlenimini vermektedir. Teknik sorunlardan dolayı histopatolojik olarak lamina propriya katmanının değerlendirilemediği solda üç, sağda dokuz toplam 12 (25%) spesimenin varlığının sonuçlarımızı etkilediği de açıktır. 2. ve 4. haftalarda sakrifiye edilen alt gruplara göre bakıldığı zaman kontrol tarafı olan sağ kulaklar karşılaştırıldığında lamina propriyanın 1. alt grupta % 71.4 oranında , 2. alt grupta % 50 oranında mevcut olup gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark olmadığı görülmektedir (p=0.608). Yine deney tarafı olan sol kulaklar karşılaştırıldığında lamina propriya 1. alt grupta % 100 oranında , 2. alt grupta % 80 oranında mevcut olup istatistiksel olarak karşılaştırıldığında anlamlı fark olmadığı görülmektedir (p=0.214). Seçilmiş olan bu takip sürelerinde literatürdeki ratlarda akut perforasyon sonrası kapanma ve iyileşme süreci göze alınmıştır [80]. Bu gözlemlere göre akut perforasyonların kapanması 7-10 günü bulabilmekte, iyileşme sürecinin tamamlanması ise 14. günde olmaktadır. Çalışmamızla aradaki bu farklılıkların kaynağı akut perforasyon sonrası yara kenarlarına tatbik ettiğimiz Gümüş Nitrat solüsyonu varlığına, yukarıda belirtilen 12 (%25) spesimenin data eksikliğine ve de kullandığımız greft materyalı olan gelfoama bağlı olabilir. Tüm yüzeylere eşit dağılım açısından kullandığımız PRP’nin grefti bir kılıf şeklinde sarması gereklidir. Bu işlemde diğer greftlerin kullanımı mümkündür. Deneklerimizin boyutu itibariyle greft 34 alınmasının güçlüğü yanında gelfoam seçmekteki amacımız deneklerden doku greft alımında ekstra prosedür uygulamaktan kaçınarak işlem süre ve maliyetini düşürmek, gelfoamın PRP’yi diffüz bir şekilde absorbe ederek greftin her yerine eşit dağılmasını sağlayan fiziksel özelliklerinden yararlanmak ve manipulasyonunun kolaylığıdır. Ancak burada doku greftinin perforasyon kenarlarıyla daha iyi entegrasyon ihtimali bulunduğundan gelfoam seçimi tartışılabilir. Bundan dolayı farklı klinik ve hayvan deney çalışmalarında geniş seriler şeklinde diğer greft materyalleri de denenmelidir. Deneyimizdeki hipotezinin literatürdeki bir çok çalışmayla desteklenmesi, kulak zarında akut perforasyon oluşturulduktan sonra perforasyon kenarlarına Gümüş Nitrat uygulayarak sonuçların kronik perforasyonlar için de geçerli kılınabilirliği, literatürdeki çalışmalardan farklı olarak iyileşmiş kulak zarı segmentinin önceden mürekkeple işaretlenerek lamina propriya katmanının yeni oluşan zar alanında değerlendirilmesi, ve de olumlu sonuç durumunda teoriden pratiğe uygulanmasının kolaylığı gösterilebilir. Çalışmanın kısıtlı yönleri olarak hayvan deneyi olması sebebiyle denek sayısının etik ve lojistik nedenlerden kısıtlandırılması, miringoplasti işlemi sırasında kulak zarı perforasyonu onarılırken otolog greft yerine gelfoam kullanılması ve spesimenlerin küçük boyutlu olmasından kaynaklanan teknik sorunlar sebebiyle histopatolojik değerlendirmenin örneklerin % 25 inde yapılamaması gösterilebilir. 35 6. SONUÇ 1. Topikal PRP nin yan etkileri olmaksınız deney grubunda timpanik membran perforasyonu kapanma hızını arttırdığı gösterilmiştir ve fark istatistiksel olarak anlamlıdır. 2. Gruplar arasında perforasyon kapanma oranlarında istatistiksel olarak anlamlı fark olmadığı görülse de daha geniş serilerde istatistiksel olarak anlamlı sonuç alınacağı düşünülmektedir. 3. Deney ve kontrol gruplarında iyileşmiş kulak zarları lamina propriya açısından incelendiğinde istatistiksel olarak anlamlı olmasa da deney grubu sonuçlarının daha iyi olduğu görülmüştür. Daha geniş serilerde istatistiksel olarak anlamlı sonuç alınacağı düşünülmektedir. 4. İstatistiksel araştırma için veriler yetersiz olsada gözlemimiz topikal PRP’nin matür damar sayısı ve vaskülarizasyon alanını arttırdığı, nekrotik alan yüzdesini azalttığı yönündedir. 5. Literatürdeki bilgiler ve çalışmamızdaki bulguların ışığında topikal PRP’nin yara iyileşmesindeki etkinliği, belirgin yan etkilerinin olmaması ve maliyetinin düşük olmasından dolayı hem sağlıklı hem de çeşitli nedenlerden ve ek hastalıklardan dolayı yara iyileşmesinin bozuk olduğu hasta populasyonunda kullanımı önerilebilir. 6. Literatürde benzer çalışmaların sayısı ve deney gruplarının büyüklüğünün kısıtlı olması nedeniyle perforasyon kapanma oranları, süresi ve lamina propriya varlığı açısından sonuçlarımız katkı sağlamaktadır. 7. Özellikle histopatolojik inceleme fazında yaşadığımız zorluklar ve bunları aşmak için kullandığımız teknikler gelecek çalışmalara yol gösterme açısından önem arzetmektedir. 36 7. KAYNAKLAR 1. Becker, J. and D. Lubbe, Success rate of myringoplasty at Groote Schuur Hospital. S Afr Med J, 2011. 101(10): p. 740. 2. Das, A., Sen, B., Ghosh, D., & Sengupta, A. Myringoplasty: impact of size and site of perforation on the success rate. Indian Journal of Otolaryngology and Head & Neck Surgery, 67(2), 185-189.. 2015. 3. Lou, X.D. and Z.H. Lou, Assessment of multiple factors is necessary when evaluating the success rate of myringoplasty. J Laryngol Otol, 2017. 131(1): p. 90-91. 4. Alves, R. and R. Grimalt, A Review of Platelet-Rich Plasma: History, Biology, Mechanism of Action, and Classification. Skin Appendage Disord, 2018. 4(1): p. 18-24. 5. Hussain, N., H. Johal, and M. Bhandari, An evidence-based evaluation on the use of platelet rich plasma in orthopedics - a review of the literature. SICOT J, 2017. 3: p. 57. 6. Lim, D.J., Structure and function of the tympanic membrane: a review. Acta Otorhinolaryngol Belg, 1995. 49(2): p. 101-15. 7. Cheng, T., C. Dai, and R.Z. Gan, Viscoelastic properties of human tympanic membrane. Ann Biomed Eng, 2007. 35(2): p. 305-14. 8. Gulya, A.J., Anatomy of the Temporal Bone with Surgical Implications 3rd Edition. 3 edition ed.: CRC Press; 3 edition (September 7, 2007). 9. Geiger., A.S.J.T.Z., Anatomy, Head and Neck, Ear Tympanic Membrane. © 2019, StatPearls Publishing LLC. 10. Heine, P.A., Anatomy of the ear. Vet Clin North Am Small Anim Pract, 2004. 34(2): p. 379-95. 11. Gladstone, H.B., R.K. Jackler, and K. Varav, Tympanic membrane wound healing. An overview. Otolaryngol Clin North Am, 1995. 28(5): p. 913-32. 12. Mehta, R. P., Rosowski, J. J., Voss, S. E., O’Neil, E., & Merchant, S. N. (2006). Determinants of hearing loss in perforations of the tympanic membrane. Otology & neurotology: official publication of the American Otological Society, American Neurotology Society [and] European Academy of Otology and Neurotology, 27(2): p. 136-43. 13. Louw, L., Acquired cholesteatoma pathogenesis: stepwise explanations. J Laryngol Otol, 2010. 124(6): p. 587-93. 14. Bluestone, C.D., Epidemiology and pathogenesis of chronic suppurative otitis media: implications for prevention and treatment. Int J Pediatr Otorhinolaryngol, 1998. 42(3): p. 207-23. 37 15. Aggarwal, R., S.R. Saeed, and K.J. Green, Myringoplasty. J Laryngol Otol, 2006. 120(6): p. 429-32. 16. Lim, D.J., Human tympanic membrane. An ultrastructural observation. Acta Otolaryngol, 1970. 70(3): p. 176-86. 17. Knutsson, J., D. Bagger-Sjoback, and M. von Unge, Collagen type distribution in the healthy human tympanic membrane. Otol Neurotol, 2009. 30(8): p. 1225- 9. 18. Bluestone, C.D., Gates, G. A., Klein, J. O., Lim, D. J., Mogi, G., Ogra,, 1. Definitions, Terminology, and Classification of Otitis Media. . Annals of Otology, Rhinology & Laryngology, , 2002. 19. Hom, D.B., Growth factors and wound healing in otolaryngology. Otolaryngol Head Neck Surg, 1994. 110(6): p. 560-4. 20. Johnson, A. and M. Hawke, The function of migratory epidermis in the healing of tympanic membrane perforations in guinea-pig. A photographic study. Acta Otolaryngol, 1987. 103(1-2): p. 81-6. 21. Govaerts, P.J., W.A. Jacob, and J. Marquet, Histological study of the thin replacement membrane of human tympanic membrane perforations. Acta Otolaryngol, 1988. 105(3-4): p. 297-302. 22. S Santa Maria, P. L., Redmond, S. L., Atlas, M. D., & Ghassemifar, R. (2010). Histology of the healing tympanic membrane following perforation in rats. The Laryngoscope,120(10): p. 2061-70. 23. Yamashita, T., Histology of the tympanic perforation and the replacement membrane. Acta Otolaryngol, 1985. 100(1-2): p. 66-71. 24. Amoils, C.P., R.K. Jackler, and L.R. Lustig, Repair of chronic tympanic membrane perforations using epidermal growth factor. Otolaryngol Head Neck Surg, 1992. 107(5): p. 669-83. 25. Taylor, M. and R.M. McMinn, Cytology of repair in experimental perforation of the tympanic membrane and its relationship to chronic perforations in man. Trans Am Acad Ophthalmol Otolaryngol, 1967. 71(5): p. 802-12. 26. Emil Berthold, [About myringoplasty]. 1878: Wien Med Blätter 27. Storrs, L., Myringoplasty. Laryngoscope, 1966. 76(2): p. 185-95. 28. Wullstein, H., Theory and practice of tympanoplasty. Laryngoscope, 1956. 66(8): p. 1076-93. 29. Inwood, J.L., H.C. Wallace, and S.E. Clarke, Endaural or postaural incision for myringoplasty: does it make a difference to the patient? Clin Otolaryngol Allied Sci, 2003. 28(5): p. 396-8. 30. Kotecha, B., S. Fowler, and J. Topham, Myringoplasty: a prospective audit study. Clin Otolaryngol Allied Sci, 1999. 24(2): p. 126-9. 31. Gersdorff M, G.P., Decat M, Juantegui M. , Myringoplasty: longterm results in adults and children. . Am J Otol 1995;16:532–5, 1995. 38 32. Vartiainen, E. and J. Nuutinen, Success and pitfalls in myringoplasty: follow- up study of 404 cases. Am J Otol, 1993. 14(3): p. 301-5. 33. Lee, P., G. Kelly, and R.P. Mills, Myringoplasty: does the size of the perforation matter? Clin Otolaryngol Allied Sci, 2002. 27(5): p. 331-4. 34. Singh, M., Rai, A., Bandyopadhyay, S., & Gupta, S. C. (2003). Comparative study of the underlay and overlay techniques of myringoplasty in large and subtotal perforations of the tympanic membrane. The Journal of Laryngology & Otology, 117(6): p. 444-8. 35. Kartush, J. M., Michaelides, E. M., Becvarovski, Z., & LaRouere, M. J. (2002). Over‐under tympanoplasty. The Laryngoscope, 112(5), 802-807. 36. Ahmed EA, Z.H., Cartilage tympanoplasty: audiological and otological outcome., in International Congress Series 2003;1240:73–9. . 2003. 37. Ayache, S., Braccini, F., Facon, F., & Thomassin, J. M. (2003). Adipose graft: an original option in myringoplasty. Otology & neurotology, 24(2). 24(2): p. 158-64. 38. Yetiser, S., F. Tosun, and B. Satar, Revision myringoplasty with solvent- dehydrated human dura mater (Tutoplast). Otolaryngol Head Neck Surg, 2001. 124(5): p. 518-21. 39. Chanvimalueng, W., A clinical comparison of outpatient and standard myringoplasty. Ear Nose Throat J, 2000. 79(2): p. 113-4, 117. 40. Golz, A., Goldenberg, D., Netzer, A., Fradis, M., Westerman, S. T., Westerman, L. M., & Joachims, H. Z. (2003). Paper patching for chronic tympanic membrane perforations. Otolaryngology—Head and Neck Surgery, 128(4), 128(4): p. 565-70. 41. Saadat, D., Ng, M., Vadapalli, S., & Sinha, U. K.. Office myringoplasty with alloderm. The Laryngoscope, 111(1), 181-184. 2001. 111(1): p. 181-4. 42. Lou, Z.C. and J.G. He, A randomised controlled trial comparing spontaneous healing, gelfoam patching and edge-approximation plus gelfoam patching in traumatic tympanic membrane perforation with inverted or everted edges. Clin Otolaryngol, 2011. 36(3): p. 221-6. 43. Tan, H. E., Santa Maria, P. L., Eikelboom, R. H., Anandacoomaraswamy, K. S., & Atlas, M. D.Type I tympanoplasty meta-analysis: a single variable analysis. Otology & Neurotology, 37(7), 838-846. 2016. 37(7): p. 838-46. 44. Spandow, O., S. Hellstrom, and M. Dahlstrom, Structural characterization of persistent tympanic membrane perforations in man. Laryngoscope, 1996. 106(3 Pt 1): p. 346-52. 45. Marx, R.E., Platelet-rich plasma (PRP): what is PRP and what is not PRP? Implant Dent, 2001. 10(4): p. 225-8. 46. Harrison, P. and E.M. Cramer, Platelet alpha-granules. Blood Rev, 1993. 7(1): p. 52-62. 39 47. Shashikiran, N., Subba Reddy, V., Yavagal, C., & Zakirulla, M. Applications of platelet-rich plasma (PRP) in contemporary pediatric dentistry. J Clin Pediatr Dent, 2006. 30(4): p. 283-6. 48. Bhanot, S. and J.C. Alex, Current applications of platelet gels in facial plastic surgery. Facial Plast Surg, 2002. 18(1): p. 27-33. 49. Kevy SV, J.M., Comparison of methods for point of care preparation of autologous platelet gel. . J Extra Corpor Technol., 2004. 36: 28–35. . 50. Kevy S, J.M., Preparation of growth factors enriched autologous platelet gel., in Proceedings of the 27th Annual Meeting of Service Biomaterials. 2001. 51. Grageda, E., Platelet-rich plasma and bone graft materials: a review and a standardized research protocol. Implant Dent, 2004. 13(4): p. 301-9. 52. Heldin, C.H. and B. Westermark, PDGF-like growth factors in autocrine stimulation of growth. J Cell Physiol Suppl, 1987. Suppl 5: p. 31-4. 53. Mehta, S. and J.T. Watson, Platelet rich concentrate: basic science and current clinical applications. J Orthop Trauma, 2008. 22(6): p. 432-8. 54. Bennett, S. P., Griffiths, G. D., Schor, A. M., Leese, G. P., & Schor, S. L., Growth factors in the treatment of diabetic foot ulcers. Br J Surg, 2003. 90(2): p. 133-46. 55. Mueller, R. V., Hunt, T. K., Tokunaga, A., & Spencer, E. M. The effect of insulinlike growth factor I on wound healing variables and macrophages in rats. Arch Surg, 1994. 129(3): p. 262-5. 56. Eppley, B.L., W.S. Pietrzak, and M. Blanton, Platelet-rich plasma: a review of biology and applications in plastic surgery. Plast Reconstr Surg, 2006. 118(6): p. 147e-159e. 57. Everts, P. A., Knape, J. T., Weibrich, G., Schönberger, J. P., Hoffmann, J., Overdevest, E. P., ... & van Zundert, A., Platelet-rich plasma and platelet gel: a review. J Extra Corpor Technol, 2006. 38(2): p. 174-87. 58. Tayapongsak, P., O'Brien, D. A., Monteiro, C. B., & Arceo-Diaz, L. Y., Autologous fibrin adhesive in mandibular reconstruction with particulate cancellous bone and marrow. J Oral Maxillofac Surg, 1994. 52(2): p. 161-5; discussion 166. 59. Knighton, D.R., G.D. Phillips, and V.D. Fiegel, Wound healing angiogenesis: indirect stimulation by basic fibroblast growth factor. J Trauma, 1990. 30(12 Suppl): p. S134-44. 60. DelRossi, A. J., Cemaianu, A. C., Vertrees, R. A., Wacker, C. J., Fuller, S. J., Cilley Jr, J. H., & Baldino, W. A. , Platelet-rich plasma reduces postoperative blood loss after cardiopulmonary bypass. J Thorac Cardiovasc Surg, 1990. 100(2): p. 281-6. 61. Soffer, E., J.P. Ouhayoun, and F. Anagnostou, Fibrin sealants and platelet preparations in bone and periodontal healing. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 2003. 95(5): p. 521-8. 40 62. Carol H. Yan MD1, D.C.M.B.Z.M.P.M., The use of platelet-rich plasma in treatment of olfactory dysfunction: A pilot study. Laryngoscope, 2019. 63. Gokce Kutuk, S. and T. Ozdas, The impact of platelet-rich plasma therapy on short-term postoperative outcomes of pediatric tonsillectomy patients. Eur Arch Otorhinolaryngol, 2019. 276(2): p. 489-495. 64. E. RICCI, G.R., F. DAGNA, A.L. CAVALOT, The use of platelet-rich plasma gel in superficial parotidectomy ACTA OTORHINOLARYNGOLOGICA ITALICA 2019;39:363-366; , 2019. 65. Nardone, M., Sommerville, R., Bowman, J., & Danesi, G. , Myringoplasty in simple chronic otitis media: critical analysis of long-term results in a 1,000- adult patient series. Otol Neurotol, 2012. 33(1): p. 48-53. 66. Erkilet, E., Koyuncu, M., Atmaca, S., & Yarim, M., Platelet-rich plasma improves healing of tympanic membrane perforations: experimental study. J Laryngol Otol, 2009. 123(5): p. 482-7. 67. Özgürsoy, S. K., Tunçkaşık, M. E., Tunçkaşık, F., Akıncıoğlu, E., Doğan, H., & Kocatürk, S. ., Platelet-Rich Plasma Application for Acute Tympanic Membrane Perforations. J Int Adv Otol, 2017. 13(2): p. 195-199. 68. El-Anwar, M. W., El-Ahl, M. A. S., Zidan, A. A., & Yacoup, M. A. R. A. S. , Topical use of autologous platelet rich plasma in myringoplasty. Auris Nasus Larynx, 2015. 42(5): p. 365-8. 69. O'Connor, K. N., Tam, M., Blevins, N. H., & Puria, S.., Tympanic membrane collagen fibers: a key to high-frequency sound conduction. Laryngoscope, 2008. 118(3): p. 483-90. 70. Andia, I. and M. Abate, Platelet-rich plasma: underlying biology and clinical correlates. Regen Med, 2013. 8(5): p. 645-58. 71. I:, A., Platelet-rich plasma biology; in Alves R, Grimalt R (eds): Clinical Indications and Treatment Protocols with Platelet-Rich Plasma in Dermatology. . Ediciones Mayo, 2016: p. pp 3–15. 72. Wasterlain, A. S., Braun, H. J., Harris, A. H., Kim, H. J., & Dragoo, J. L., The systemic effects of platelet-rich plasma injection. Am J Sports Med, 2013. 41(1): p. 186-93. 73. Zhu, Y., Yuan, M., Meng, H. Y., Wang, A. Y., Guo, Q. Y., Wang, Y., & Peng, J., Basic science and clinical application of platelet-rich plasma for cartilage defects and osteoarthritis: a review. Osteoarthritis Cartilage, 2013. 21(11): p. 1627-37. 74. Smyth, N. A., Murawski, C. D., Fortier, L. A., Cole, B. J., & Kennedy, J. G., Platelet-rich plasma in the pathologic processes of cartilage: review of basic science evidence. Arthroscopy, 2013. 29(8): p. 1399-409. 75. Anitua, E., Sanchez, M., Orive, G., & Andia, I. ., The potential impact of the preparation rich in growth factors (PRGF) in different medical fields. Biomaterials, 2007. 28(31): p. 4551-60. 41 76. Hapa, O., Cakıcı, H., Kükner, A., Aygün, H., Sarkalan, N., & Baysal, G. , Effect of platelet-rich plasma on tendon-to-bone healing after rotator cuff repair in rats: an in vivo experimental study. Acta Orthop Traumatol Turc, 2012. 46(4): p. 301-7. 77. Jo, C. H., Kim, J. E., Yoon, K. S., & Shin, S.., Platelet-rich plasma stimulates cell proliferation and enhances matrix gene expression and synthesis in tenocytes from human rotator cuff tendons with degenerative tears. Am J Sports Med, 2012. 40(5): p. 1035-45. 78. Dhillon MS, K.S., Dhatt SS, Behera P, Bhatia A Can platelet rich plasma stimulate human ACL growth in culture? A preliminary experience. Muscles Ligaments Tendons J 5(3), , 2015: p. 156–161 79. Aksoy, M. A., Açıkalın, M. F., Gürbüz, M. K., Özüdoğru, E. N., Canaz, F., Kaya, E., ... & Cingi, C., Efficacy of Platelet-Rich Plasma on Fat Grafts in the Repair of Tympanic Membrane Perforations: An Experimental Study. J Int Adv Otol, 2018. 14(1): p. 58-62. 80. de Araújo, M. M., Murashima, A. A. B., Alves, V. M., Jamur, M. C., & Hyppolito, M. A. , Spontaneous healing of the tympanic membrane after traumatic perforation in rats. Braz J Otorhinolaryngol, 2014. 80(4): p. 330-8.