T.C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ALZHEİMER HASTALIĞI’NIN BEYİN ANJİYOTENSİN RESEPTÖRLERİ İLE İLİŞKİSİ VE ANJİYOTENSİN RESEPTÖR BLOKÖRLERİNİN BU İLİŞKİYE ETKİSİ Çağlar COŞARDERELİOĞLU SEÇER Tıbbi Biyoloji Programı YÜKSEK LİSANS TEZİ ANKARA 2023 T.C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ALZHEİMER HASTALIĞI’NIN BEYİN ANJİYOTENSİN RESEPTÖRLERİ İLE İLİŞKİSİ VE ANJİYOTENSİN RESEPTÖR BLOKÖRLERİNİN BU İLİŞKİYE ETKİSİ Çağlar COŞARDERELİOĞLU SEÇER Tıbbi Biyoloji Programı YÜKSEK LİSANS TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Pervin DİNÇER ANKARA 2023 iv YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI Enstitü tarafından onaylanan lisansüstü tezimin/raporumun tamamını veya herhangi bir kısmını, basılı (kağıt) ve elektronik formatta arşivleme ve aşağıda verilen koşullarla kullanıma açma iznini Hacettepe Üniversitesine verdiğimi bildiririm. Bu izinle Üniversiteye verilen kullanım hakları dışındaki tüm fikri mülkiyet haklarım bende kalacak, tezimin tamamının ya da bir bölümünün gelecekteki çalışmalarda (makale, kitap, lisans ve patent vb.) kullanım hakları bana ait olacaktır. Tezin kendi orijinal çalışmam olduğunu, başkalarının haklarını ihlal etmediğimi ve tezimin tek yetkili sahibi olduğumu beyan ve taahhüt ederim. Tezimde yer alan telif hakkı bulunan ve sahiplerinden yazılı izin alınarak kullanılması zorunlu metinlerin yazılı izin alınarak kullandığımı ve istenildiğinde suretlerini Üniversiteye teslim etmeyi taahhüt ederim. Yükseköğretim Kurulu tarafından yayınlanan “Lisansüstü Tezlerin Elektronik Ortamda Toplanması, Düzenlenmesi ve Erişime Açılmasına İlişkin Yönerge” kapsamında tezim aşağıda belirtilen koşullar haricince YÖK Ulusal Tez Merkezi / H.Ü. Kütüphaneleri Açık Erişim Sisteminde erişime açılır. o Enstitü / Fakülte yönetim kurulu kararı ile tezimin erişime açılması mezuniyet tarihimden itibaren 2 yıl ertelenmiştir. (1) • Enstitü / Fakülte yönetim kurulunun gerekçeli kararı ile tezimin erişime açılması mezuniyet tarihimden itibaren 6 ay ertelenmiştir.(2) o Tezimle ilgili gizlilik kararı verilmiştir. 18/04/2023 Çağlar COŞARDERELİOĞLU SEÇER 1“Lisansüstü Tezlerin Elektronik Ortamda Toplanması, Düzenlenmesi ve Erişime Açılmasına İlişkin Yönerge” (1) Madde 6. 1. Lisansüstü tezle ilgili patent başvurusu yapılması veya patent alma sürecinin devam etmesi durumunda, tez danışmanının önerisi ve enstitü anabilim dalının uygun görüşü üzerine enstitü veya fakülte yönetim kurulu iki yıl süre ile tezin erişime açılmasının ertelenmesine karar verebilir. (2) Madde 6. 2. Yeni teknik, materyal ve metotların kullanıldığı, henüz makaleye dönüşmemiş veya patent gibi yöntemlerle korunmamış ve internetten paylaşılması durumunda 3. şahıslara veya kurumlara haksız kazanç imkanı oluşturabilecek bilgi ve bulguları içeren tezler hakkında tez danışmanının önerisi ve enstitü anabilim dalının uygun görüşü üzerine enstitü veya fakülte yönetim kurulunun gerekçeli kararı ile altı ayı aşmamak üzere tezin erişime açılması engellenebilir. (3) Madde 7. 1. Ulusal çıkarları veya güvenliği ilgilendiren, emniyet, istihbarat, savunma ve güvenlik, sağlık vb. konulara ilişkin lisansüstü tezlerle ilgili gizlilik kararı, tezin yapıldığı kurum tarafından verilir *. Kurum ve kuruluşlarla yapılan işbirliği protokolü çerçevesinde hazırlanan lisansüstü tezlere ilişkin gizlilik kararı ise, ilgili kurum ve kuruluşun önerisi ile enstitü veya fakültenin uygun görüşü üzerine üniversite yönetim kurulu tarafından verilir. Gizlilik kararı verilen tezler Yükseköğretim Kuruluna bildirilir. Madde 7.2. Gizlilik kararı verilen tezler gizlilik süresince enstitü veya fakülte tarafından gizlilik kuralları çerçevesinde muhafaza edilir, gizlilik kararının kaldırılması halinde Tez Otomasyon Sistemine yüklenir * Tez danışmanının önerisi ve enstitü anabilim dalının uygun görüşü üzerine enstitü veya fakülte yönetim kurulu tarafından karar verilir. v ETİK BEYAN Bu çalışmadaki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, kullandığım verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı, yararlandığım kaynaklara bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu, tezimin kaynak gösterilen durumlar dışında özgün olduğunu, Prof. Dr. Pervin DİNÇER danışmanlığında tarafımdan üretildiğini ve Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tez Yazım Yönergesi’ne göre yazıldığını beyan ederim. The Memory and Aging Project için onay, The Institutional Review Board of Rush University Medical Center’dan L99032481-CR07 başvuru numarası ile alınmıştır. Bu araştırmanın izni ise The Institutional Review Board of The Johns Hopkins Medicine’dan IRB00229782 başvuru numarası ile alınmıştır. Çağlar COŞARDERELİOĞLU SEÇER vi TEŞEKKÜR Başta yüksek lisans eğitimim boyunca engin bilgi ve tecrübesini benimle paylaşan ve her zaman desteğini hissettiğim danışmanım Prof. Dr. Pervin Dinçer’e ve tez dönemim boyunca her konuda bana yol gösteren, bilimsel olarak gelişmeme büyük katkı sağlayan Prof. Dr. Peter Abadir’e teşekkürlerimi ve şükranlarımı sunuyorum. Örnek ve veri paylaşımı için Prof. Dr. David Bennett’a, Rush Üniversitesi’ne ve Johns Hopkins Üniversitesi’ne teşekkür ediyorum. Ayrıca, yandal uzmanlık eğitimim sırasında bana bu yüksek lisansa başlama fırsatı sunan Ankara Üniversitesi Geriatri Bilim Dalı Başkanı Prof. Dr. Murat Varlı’ya ve bu süreçte desteklerini esirgemeyen hocalarım Prof. Dr. Sevgi Aras’a, Doç. Dr. Ahmet Yalçın’a ve Doç. Dr. Volkan Atmış’a çok teşekkür ediyorum. Son olarak da tez dönemim boyunca her an desteğini hissettiğim, birlikte yeni şeyler öğrenip gelişmekten inanılmaz keyif aldığım eşim Görkem Seçer’e ve bugünlere gelmemde büyük emeği olan, bana inanan ve her zaman yanımda olan canım babam İsmet Coşarderelioğlu ve canım annem Cemile Coşarderelioğlu’na sonsuz teşekkürlerimi sunuyorum. Çağlar Coşarderelioğlu Seçer vii ÖZET Coşarderelioğlu Seçer, Ç., Alzheimer Hastalığı’nın beyin anjiyotensin reseptörleri ile ilişkisi ve anjiyotensin reseptör blokörlerinin bu ilişkiye etkisi. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tıbbi Biyoloji Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2023. Alzheimer Hastalığı sıklığı giderek artan ve bilişsel işlevlerde azalma ile seyreden etiyolojisi henüz netleşmemiş nörodejeneratif bir hastalıktır. Günümüzde henüz kür sağlayacak bir tedavisi yoktur. Alzheimer Hastalığı (AH) insidansının Anjiyotensin tip 1 reseptör blokör (ARB) kullananlarda daha düşük olduğu çeşitli çalışmalarda gösterildikten sonra, beyin renin-anjiyotensin sistemi (RAS) ve Alzheimer Hastalığı ilişkisi önem kazanmıştır. Beyin renin anjiyotensin sistemi esas olarak üç reseptör alt tipi aracılığıyla hareket eder: AT1R, AT2R ve AT4R. AT1R, inflamasyonu ve oksidatif stresi destekler. AT2R nitrik oksidi arttırır. AT4R, dopamin ve asetilkolin salınımı için önemlidir ve hafıza konsolidasyonuna aracılık ettiği gösterilmiştir. Bu tezde, kognitif olarak normal ve AH olan bireylerin postmortem frontal-korteks beyin örnekleri kullanılarak AH ile ilişkili beyin RAS farklılıklarının incelenmesi, bu farklılıkların beyin oksidatif stresi, inflamasyon, ayrıca amiloid-beta ve tangle patolojileri ile ilişkisi ve son olarak ARB’lerin bu ilişkiye etkisinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Beyin RAS reseptörlerinin gen ve protein ifadeleri, oksidatif stres belirteci olarak protein karbonil seviyeleri ve inflamasyon belirteci olarak IL-6, TNF-α, IFN-γ ve IL-1β seviyeleri ölçülmüştür. Sonuç olarak, Alzheimer hastalarının beyinlerinde AT1R protein seviyeleri daha yüksek bulunmuştur. Beyin AT1R seviyesinin, daha yüksek oksidatif stres ve amiloid-beta skorları ile korele olduğu saptanmıştır. Ayrıca, ARB kullanımı, kognitif olarak normal katılımcılarda daha yüksek AT4R protein seviyeleri ve daha düşük oksidatif stres ve amiloid-beta skorları ile ilişkilendirilmiştir. ARB'lerle tedavi edilen Alzheimer hastalarının beyinlerinde oksidatif stres, inflamasyon veya tangle ve amiloid-beta yükünde anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Bu çalışma, AH ile ilişkili beyin patolojilerinde beyin RAS'ın rolü hakkında literatüre katkı sağlarken, kognitif bozukluğu olmayan bireylerde ARB'lerin olası koruyucu etkilerine AT4R'ün aracılık ediyor olabileceğini göstermiştir. Anahtar kelimeler: Alzheimer Hastalığı, Beyin, Beyin renin-anjiyotensin sistemi, Anjiyotensin reseptör blokörleri. viii ABSTRACT Coşarderelioğlu Seçer, Ç., The relationship between Alzheimer’s disease and brain renin-angiotensin system and the effects of angiotensin receptor blockers on this relationship. Hacettepe University Graduate School of Health Sciences, Medical Biology Master Thesis, Ankara, 2023. Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease, that is characterized by a decline in cognitive function, and whose etiology is not yet fully understood. Recently, it has been shown that the incidence of AD is lower in individuals with a history of Angiotensin Receptor Blockers (ARBs) use. However the mechanistic relationship between the brain renin- angiotensin system (RAS) and AD remains unknown. The brain RAS mainly acts through three receptor subtypes: AT1R, AT2R, and AT4R. AT1R promotes inflammation and oxidative stress. AT2R increases nitric oxide. AT4R is essential for dopamine and acetylcholine release and mediates memory consolidation. The first part of this thesis aims to dissect the brain RAS differences associated with AD and assess how brain RAS levels correlate with brain oxidative stress, inflammation, as well as amyloid-beta and tangle pathologies. The second part of the thesis aims to analyze the effects of ARBs on brain RAS, oxidative stress, inflammation, as well as amyloid-beta and tangle pathologies in postmortem frontal-cortex brain samples of cognitively intact and AD individuals. To this end, gene and protein expressions of brain RAS receptors, protein carbonyl levels as a marker of oxidative stress, and levels of inflammatory markers such as IL-6, TNF-α, IFN-γ, and IL-1β were measured. Our results showed higher protein levels of the AT1R in the brains of AD participants. Brain AT1R levels was correlated with higher oxidative stress and amyloid-beta scores. ARB use was associated with higher protein levels of AT4R and lower oxidative stress and amyloid-beta scores in cognitively normal participants. No significant changes observed in oxidative stress, inflammation or tangle and amyloid-beta load in AD brains treated with ARBs. This study offers insight into the role of brain RAS in AD- related brain pathology and suggests a possible role for AT4R in ARBs-mediated protective effects in cognitively intact individuals. Keywords: Alzheimer’s disease, Brain, Brain renin-angiotensin system, Angiotensin receptor blockers ix İÇİNDEKİLER ONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER VE KISALTMALAR xii ŞEKİLLER xiii TABLOLAR xiv 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 5 2.1. Alzheimer Hastalığı 5 2.1.1. Alzheimer Hastalığı Patofizyolojisi 6 2.2. Renin-Anjiyotensin Sistemi 9 2.2.1. Klasik ve Lokal Renin-Anjiyotensin Sistemine Giriş 9 2.2.2. Beyin Renin Anjiyotensin Sistemi 9 2.2.3. Anjiyotensin Reseptörlerinin Hücre Tipine Göre İşlevleri 11 2.2.4. Beyin Renin-Anjiyotensin Sistemi ile Oksidatif Stres ve Nöroinflamasyon İlişkisi 16 2.3. Alzheimer Hastalığı ve Beyin Renin-Anjiyotensin Sistemi İlişkisi 19 2.4. Renin Anjiyotensin Sistemi Üzerinden Etki Gösteren İlaçlar ve Alzheimer Hastalığı 21 2.4.1. Anjiyotensin Reseptör Blokörleri Hayvan Çalışmaları 21 2.4.2. Anjiyotensin Reseptör Blokörleri İnsan Çalışmalar 22 2.5. Hipotez ve Amaç 23 3. GEREÇLER VE YÖNTEMLER 25 3.1. Gereçler 25 3.1.1. Bireyler 26 3.1.2. Fiziksel İşlev 27 3.1.3. Çalışmada Kullanılan Beyin Örnekleri 27 3.1.4. Çalışmada Kullanılan Serum Örnekleri 27 x 3.2. Yöntemler 27 3.2.1. İnsan Beyin Örneklerinden Protein İzolasyonu ve Miktar Tayini 27 3.2.2. Western Blot 27 3.2.3. İnsan Beyin Örneklerinden cDNA Hazırlanması 28 3.2.4. Kantitatif Gerçek-Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (kGZ-PZR) 28 3.2.5. Oksidatif Stres 29 3.2.6. Sitokinler 29 3.2.7. Amiloid-Beta Yükü ve Tangle Yoğunluğu 30 3.3. İstatiksel Analiz 30 4. BULGULAR 31 4.1. Alzheimer Hastalığı Olan Bireylerde Kognitif Bozukluğu Olmayan Bireylere Göre Renin Anjiyotensin Sistemi Farklılıkları 31 4.1.1. Demografik Özellikler 31 4.1.2. Alzheimer Hastalığı’nda Beyin RAS Ana Ligandı Anjiyotensinojen ve Katalitik Enzimlerin (Renin ve ACE) Gen İfade Düzeylerindeki Farklılıklar 32 4.1.3. Alzheimer Hastalığı’nda Anjiyotensin Reseptörlerinin Gen İfade ve Protein Seviyeleri Farkları 32 4.1.4. Anjiyotensin Reseptörleri ve Oksidatif Stres İlişkisi 35 4.1.5. Anjiyotensin Reseptörleri ve İnflamasyon İlişkisi 35 4.1.6. Anjiyotensin Reseptör Seviyeleri ile Amiloid-Beta Yükü ve Tangle Yoğunluğu İlişkisi 35 4.1.7. AT1R Protein Seviyelerinin Oksidatif Stres Aracılığıyla Tangle Yoğunluğu Üzerine Etkisi 36 4.2. Anjiyotensin Reseptör Blokörü Kullanımının Normal Kognisyonu Bireylerin Beyinlerine Etkisi 37 4.2.1. Demografik Özellikler 37 4.2.2. Normal Kognisyonlu ARB Kullanan Bireylerde Kullanmayanlara Göre Beyin RAS Ana Ligandı Anjiyotensinojen ve Katalitik Enzimler (Renin ve ACE) Gen İfade Düzeylerindeki Farklılıklar 39 4.2.3. Normal Kognisyonlu Bireylerde ARB Kullanımının Anjiyotensin Reseptör Gen ve Protein İfade Düzeyleri Üzerine Etkisi 39 4.2.4. Normal Kognisyonlu Bireylerde ARB Kullanımının Oksidatif Stres ile İlişkisi 40 4.2.5. Normal Kognisyonlu Bireylerde ARB Kullanımının İnflamasyon ile İlişkisi 41 4.2.6. Normal Kognisyonlu Bireylerde ARB Kullanımının Amiloid-Βeta Yükü ve Tangle Yoğunluğu ile İlişkisi 41 4.3. Anjiyotensin Reseptör Blokörü Kullanımının Alzheimer Hastalığı Olan Katılımcıların Beyinlerine Etkisi 42 xi 4.3.1. Demografik Özellikler 42 4.3.2. ARB Kullanan Alzheimer Hastalarının Beyin RAS Ana Ligandı Anjiyotensinojen ve Katalitik Enzim (Renin ve ACE) Düzeylerindeki Farklılıklar 43 4.3.3. Alzheimer Hastalığı Olan Bireylerde ARB Kullanımının Anjiyotensin Reseptör Gen ve Protein İfade Düzeylerine Etkisi 44 4.3.4. Alzheimer Hastalığı Olan Bireylerde ARB Kullanımının Oksidatif Stres ile İlişkisi 45 4.3.5. Alzheimer Hastalığı Olan Bireylerde ARB Kullanımının İnflamasyon ile İlişkisi 45 4.3.6. Anjiyotensin Reseptör Seviyeleri ile Amiloid-Beta Yükü ve Tangle Yoğunluğu İlişkisi 46 4.4. Anjiyotensin Reseptör Blokörlerinin Normal Kognisyonlu ve Alzheimer Hastalarında Anjiyotensin Reseptörleri Üzerindeki Etki Farklılığı 46 5. TARTIŞMA 49 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 54 6.1. Sonuçlar 54 6.2. Öneriler 55 6.3. Tezden Türetilen Yayınlar 55 7. KAYNAKLAR 57 8. EKLER 83 EK-1. Örnek Western Blot Bandları 83 EK-2. Orjinallik Ekran Çıktısı 84 EK-3. Dijital Makbuz 87 9. ÖZGEÇMİŞ 89 xii SİMGELER VE KISALTMALAR ACE Anjiyotensin dönüştürücü enzim ACEİ Anjiyotensin dönüştürücü enzim inhibitörü AD Alzheimer Demansı AH Alzheimer Hastalığı AN-A Aminopeptidaz-A AN-N Aminopeptidaz-N Ang Anjiyotensin APP Amiloid prekürsör protein ARB Anjiyotensin II tip 1 reseptör blokörü AT1R Anjiyotensin II tip 1 reseptörü AT2R Anjiyotensin II tip 2 reseptörü ELİSA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay IFN-γ İnterferon-gamma IL-1β İnterlökin 1-beta IL-6 İnterlökin 6 ÇAG Çeyrekler arası aralık (interquartile range) KBB Kan beyin bariyeri mg Miligram ml Mililitre NFY Nörofibriller yumaklar NK Normal kognisyon NO Nitrik oksit PMI Ölüm sonrası geçen süre (post-mortem interval) RAS Renin-anjiyotensin sistemi RNA Ribonükleik asit ROS Reaktif oksijen türleri rpm Rounds per minute TNF- α Tümör nekrozis faktör-α μl Mikrolitre oC Derece santigrat xiii ŞEKİLLER Şekil Sayfa 1. Beyin renin-anjiyotensin sistemi ligand ve reseptörleri 11 2. Kognitif olarak normal olan ve Alzheimer Hastalığı olan katılımcılarda angiotensin II tip 1 reseptör gen ve protein ifade seviyeleri 34 3. Alzheimer hastalığı olan katılımcıların beyin renin anjiyotensin sistemlerindeki farklılıkların şekilsel gösterimi 35 4. Anyiyotensin II tip 1 reseptör seviyesi ile oksidatif stres ilişkisi 36 5. Anjiyotensin II tip 1 reseptör seviyesi ve amiloid-beta ilişkisi 37 6. Anjiyotensin II tip 1 reseptörünün oksidatif stres aracılı etkisi 38 7. Normal kognisyonlu ARB kullanan ve kullanmayan bireylerde anjiyotensin reseptör protein seviyeleri farkları 41 8. ARB kullanan ve kullanmayan normal kognisyonlu bireylerde protein karbonil seviyeleri farkı 42 9. Normal kognisyonlu bireylerde ARB kullanan ve kullanmayan grupta kalkarin korteks ve inferior temporal korteks amiloid-beta skorları 43 10. Alzheimer Hastalığı olan ARB kullanan ve kullanmayan bireylerde anjiyotensin reseptör protein seviyeleri farkları 46 11. Anjiyotensin tip 4 reseptörü ve sitokin seviyeleri arasındaki korelasyonu gösteren serpilme diyagramı 47 12. Anjiyotensin reseptör blokörü kullanan kognitif bozukluğu olmayan ve Alzheimer Hastalığı olan katılımcıların ARB kullanmayanlara göre farklılıklarının şekilsel gösterimi 48 xiv TABLOLAR Tablo Sayfa 1. Katılımcı karakteristikleri 31 2. Alzheimer Hastalığı Olan Katılımcılarda Kognitif Olarak Normal Olan Bireylere Göre AGT, REN ve ACE Gen İfadeleri 32 3. Alzheimer Hastalığı Olan Katılımcılarda Kognitif Olarak Normal Olan Bireylere Göre AGTR1, AGTR2 ve LNPEP Gen İfadeleri 34 4. Anjiyotensin reseptör blokör (ARB) kullanan ve kullanmayan normal kognisyonlu katılımcı karakteristik özellikleri 38 5. Anjiyotensin Reseptör Blokör Kullanan Normal Kognisyonlu Bireylerin Kullanmayanlara Göre AGT, REN ve ACE Gen İfadeleri 39 6. Anjiyotensin Reseptör Blokör Kullanan Normal Kognisyonlu Bireylerin Kullanmayanlara Göre AGTR1, AGTR2 ve LNPEP Gen İfadeleri 40 7. Anjiyotensin reseptörü kullanan ve kullanmayan Alzheimer Hastalığı olan katılımcıların karakteristik özellikleri 43 8. Anjiyotensin Reseptör Blokör Kullanan Alzheimer Hastalarının Kullanmayanlara Göre AGT, REN ve ACE Gen İfadeleri 45 9. Anjiyotensin Reseptör Blokör Kullanan Alzheimer Hastalarının Kullanmayanlara Göre AGTR1, AGTR2 ve LNPEP Gen İfadeleri 45 1 1. GİRİŞ Alzheimer Hastalığı, ilerleyici nöron kaybı ve kognisyonda bozulma ile seyreden karmaşık bir nörodejeneratif hastalıktır. Hastalığın patolojik karakteristikleri olarak nöron dejenerasyonu, ekstraselüler amiloid plaklar ve intranöronal nörofibriller yumaklar (NFY) tanımlanmıştır. Bu patolojik değişikliklerin hastalığın klinik semptomları başlamadan çok önce geliştiği birçok çalışmada gösterilmiştir (1,2). Hastalığın etiyolojisi tam olarak netleşmese de patogenezinde inflamasyon ve oksidatif stresin önemli bir rol oynadığına dair kanıtlar giderek artmaktadır (2–4). Epidemiyolojik çalışmalarda renin-anjiyotensin sistemi üzerinden etki gösteren ilaçlar ile Alzheimer Hastalığı arasındaki ilişkinin gösterilmesi ile henüz küratif bir tedavisi bulunmayan hastalık ile beyin renin-anjiyotensin sistemi ilişkisi önem kazanmıştır. Renin-anjiyotensin sistemi (RAS) ilk olarak su ve elektrolit dengesini, sistemik vasküler direnci, aldosteron salınımını ve kardiyovasküler homeostazı düzenleyen endokrin sistemin bir parçası olarak tanımlanmıştır (5–7). Klasik RAS, renal afferent arteriyollerin jukstaglomerüler hücrelerinden renin salgılanmasıyla aktifleşir. İlk ve hız sınırlayıcı adım olarak renin, öncü molekül anjiyotensinojeni anjiyotensin (Ang) I'e dönüştürür ve sentezlenen Ang I daha sonra çoğunlukla akciğer endotel hücrelerinde yerleşim gösteren anjiyotensin dönüştürücü enzim (ACE) tarafından anjiyotensin II'ye dönüştürülür. Bu sistem içinde Ang II, anjiyotensin II tip 1 reseptörüne (AT1R) ve anjiyotensin II tip 2 reseptörüne (AT2R) bağlanarak birbirine zıt etkilere yol açan biyoaktif bir üründür (8–10). Klasik endokrin RAS'ın ötesinde, ilave araştırmalar RAS'ın otokrin ve parakrin etkileri de olduğunu göstermiştir (11). RAS elemanlarının lokal olarak sentezlenebildiği ve endotel hücreleri, adrenal ve hipofiz bezleri, testis, yumurtalık, böbrek, kalp ve göz dahil olmak üzere birçok dokuda lokal olarak etki ettiği gösterilmiştir ve bu RAS formu lokal / doku RAS olarak adlandırılmıştır (10,12,13). Lokal RAS'lar arasında, Ganten ve ark. tarafından keşfedilen beyin RAS, sistemik RAS bileşenleri beyin bölgelerinin çoğuna kan-beyin bariyeri nedeni ile erişemediğinden özel bir öneme sahiptir (14,15). 2 Beyin RAS’ın, vasküler ve kan basıncı kontrolü gibi RAS’ın iyi bilinen rollerinin ötesinde santral sinir sisteminde oksidatif stres ve nöroinflamasyon dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar aracılığıyla öğrenme ve hafıza, nöronal farklılaşma, beyin homeostazı, nörotransmiter sekresyonundaki değişiklikler gibi karmaşık etkilere sahip olduğu gösterilmiştir (16–21). Nöronlarda ve astrositlerde, Ang II /AT1R yolağı, reaktif oksijen türleri (ROS) üretir ve oksidatif strese sebebiyet verebilir (15,22). Tersine, Ang II/AT2R yolağında nitrik oksit (NO) üretilir ve süperoksit artışı engellenir (23). Böylece, AT2R, AT1R’nin yıkıcı etkilerini antagonize eder (24,25). Ang II/AT1R yolağının aksine Ang II/AT2R yolağı nöroprotektif mekanizmaları, NO üretimini, nörit büyümesini ve beyin gelişimini indükler ve böylece bilişsel işlevi iyileştirir (26). Bu bağlamda, bozulmuş AT2R sinyali, AT1R aracılı oksidatif stres ve nöroinflamasyon ile sonuçlanır, bu da bilişsel bozulmaya yol açabilir. Ek olarak, beyin RAS mikroglialar üzerinde de etkilidir (23,27). Beyin RAS'ın aşırı aktif Ang II/AT1R yolağı mikroglial aktivasyonu ve M1 pro-inflamatuar polarizasyonu artırarak nöroinflamasyona önemli katkıda bulunur (20). Sonuç olarak, uzun süreli ve çözülmemiş inflamasyon, nöronlara ve sinapslara zarar verir, bu da glial hücrelerin kronik düzensizliğine ve ardından beyin yapısında ve işlevinde kronik bozulmaya neden olur (28). Alzheimer Hastalığı etiyolojisine katkıda bulunan mekanizmalardan bazıları oksidatif stres, mitokondri işlev kaybı ve antioksidan sistemdeki değişikliklerdir (29). Oksidatif stres, mitokondri membranının lipid peroksidasyonu ile yapısal ve enzimatik proteinlerin ve nükleik asitlerin oksidasyonu yoluyla hasara neden olur. Mitokondri DNA'sının artan oksidasyonu, mitokondrinin bütünlüğünü bozar ve ATP üretimini azaltır, böylece potansiyel olarak mitokondrinin işlev görmemesine neden olur (4). Mitokondrinin işlevi azaldıkça, amiloid-beta üretimi, tau fosforilasyonu, sinaptik dejenerasyon ve oksidatif stres gibi hücresel değişikliklere yol açar (30,31). Ayrıca, proteinlerin oksidatif stresle ilişkili modifikasyonları, amiloid-beta agregasyonuna ve tau proteininin fosforilasyonuna neden olabilir (32). Beyin RAS düzensizlikleri, yukarıda anlatılan mekanizmalarla oksidatif stres ve nöroinflamasyona yol açarak, Alzheimer Hastalığı gibi kronik nörodejeneratif hastalıkların gelişiminde rol oynayabilir (33,34). 3 Alzheimer Hastalığı’nın önleme yöntemleri ve tedavisine baktığımız da ise maalesef bugün itibariyle etkili bir risk azaltma, önleme veya tedavi stratejisi mevcut değildir. 20 yıldan fazla bir süredir, AH'nin tedavisi için iki kategoride ilaç kullanılmaktadır. Bunlardan biri asetilkolinin yarı ömrünü uzatan kolinesteraz inhibitörleri iken diğeri glutamat eksitotoksisitesini ve nöronal hasarı sınırlayan bir NMDA reseptör antagonisti olan memantindir (35). FDA tarafından yeni onay alan aducanumab kulanımı ise etki düzeyi ve yan etkileri dolayısıyla tartışmalıdır (36). Son zamanlarda, anjiyotensin II tip 1 reseptör blokörleri (ARB) veya ACE inhibitörleri (ACEİ) gibi RAS üzerinden etki gösteren ilaçların kullanımı ile Alzheimer Hastalığı prevelansı arasında bir ilişki gösterilmesi ile de beyin RAS ve Alzheimer Hastalığı ilişkisi önem kazanmıştır. İki tür RAS üzerinden etki gösteren, sık kullanılan ilaç vardır: ARB'ler ve ACEİ’ler. Bunlar arasında, AT1R blokajı yapan ARB'ler, Ang II seviyelerinin artmasına neden olur ve sonuç olarak AT2R'nin uyarılmasını artırır. Aksine, ACE inhibitörleri daha düşük Ang II seviyelerine neden olur ve sonuç olarak hem AT1R hem de AT2R'nin uyarılmasını azaltır (37). Bu nedenle ARB’ler ile, sistemin, anti- oksidan ve anti-inflamatuar AT2R yönüne kaymasından ve zararlı etkilerin daha spesifik olarak bloke edilmesinden dolayı bilişsel bozukluğun önlenmesinde diğer RAS etkili ilaçlara göre ARB’lerin potansiyel avantajları olduğu düşünülmüştür (38,39). ARB’lerin çeşitli çalışmalarda görülen AH’ye karşı koruyucu etkileri ilk olarak, kan basıncı düşürücü etkilerine bağlanmıştır (40). Yukarıda açıklanan sistemik RAS’tan bağımsız hareket eden beyin dokusuna spesifik RAS’ın gösterilmesi ve görevlerinin aydınlatılmaya başlanması ile bu koruyucu etki önem kazanmıştır. Fakat, yaşa bağlı RAS değişiklikleri ve bunun AH'nin gelişmesine ve ilerlemesine katkısı arasındaki ilişki hala net değildir (41–44). Birkaç epidemiyolojik çalışmada, ARB ile tedavi edilenlerde, diğer anti hipertansif ilaçlarla tedavi edilenlere kıyasla AH insidansında ve ilerlemesinde önemli bir azalma görülmüştür (45,46). Özetle, RAS şimdiye kadar bahsedilen birçok mekanizma aracılığıyla AH patogenezine etki eden kritik bir bileşen olma potansiyeline sahiptir. Bu etkinin kanıtlanması, RAS'ı düzenleyen ilaçların hali hazırda bulunması ve AH gelişim 4 riskinin azaltılması ve hastalığın ilerlemesinin yavaşlatılması için kullanılabilme potansiyellerinin yüksek olması nedeni ile oldukça önemlidir. Bu tezde, öncelikle beyin anjiyotensin reseptörlerinin Alzheimer Hastalığı patogenezindeki rolünü göstermek ve anjiyotensin reseptör blokörlerinin beyin RAS üzerindeki etkilerini ve Alzheimer Hastalığı üzerindeki rolünü ortaya koymak amaçlanmıştır. İlk amaç doğrultusunda, RAS sistemini etkileyen ACEİ ve ARB cinsi ilaç hiç kullanmamış kognitif bozukluğu olmayan (NK) (n=30) ve Alzheimer Hastalığı (AH) olan (n=30) katılımcıların beyin AGT (anjiyotensinojen geni), REN (renin geni), ACE (anjiyotensin dönüştürücü enzim geni) gen ifadeleri, beyin AGTR1, AGTR2 ve LNPEP (AT4R) gen ifadeleri ve AT1R, AT2R ve AT4R protein düzeyleri ile oksidatif stres belirteci olarak protein karbonil düzeyleri, inflamasyon belirteçleri olarak interlökin 6 (IL-6), interlökin 1β (IL-1β), interferon-gamma (IFN-γ) ve tümör nekrozis faktör-α (TNF- α) seviyeleri ölçülerek, gruplar arası farklılıklar tespit edilmiştir. İkinci aşamada ise ARB’lerin etkilerini kognitif olarak bozukluğu olmayan ve AH olan katılımcılarda ayrı ayrı gözlemleyebilmek için hiç ARB kullanmamış ve ARB kullanmış kognitif bozukluğu olmayan katılımcılar birbirleri ile karşılaştırılırken, ARB kullanmamış ve ARB kullanmış AH olan katılımcılar da kendi arasında karşılaştırılmıştır. Bu tez çalışması, The Johns Hopkins Üniversitesi Biology of Healthy Aging Laboratuvarları’nda gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma, BrightFocus Foundation Research Award ve the National Institute on Aging of the National Institutes of Health tarafından desteklenmiştir (P30AG021334, NIH R01AG046441 ve K23 AG035005). Bu çalışma NIH’nin resmi görüşünü yansıtmaz. The Memory and Aging Project için etik onay, The Institutional Review Board of Rush University Medical Center’dan L99032481-CR07 başvuru numarası ile alınmıştır. Bu araştırmanın izni ise The Institutional Review Board of The Johns Hopkins Medicine’dan IRB00229782 başvuru numarası ile alınmıştır. 5 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Alzheimer Hastalığı Alzheimer Hastalığı, ilerleyici nöronal kayıp ve bilişsel bozulma ile karakterize, sıklığı yaş ile artan karmaşık bir nörodejeneratif hastalıktır (47). Hastalık ilk kez 1906 yılında Alois Alzheimer tarafından tanımlanmıştır. İlerleyici bilinç kaybı ve kişilik değişikliği gibi klinik özellikleri olan kadın hastayı takip eden Alzheimer, hastanın ölümü sonrası beyinde gelişen makroskopik ve mikroskopik değişiklikleri detaylı olarak tarif etmiştir (48). Yaşlı nüfusta en sık demans nedenidir ve tüm demans vakalarının %50-80'ini oluşturmaktadır. Şu anda dünya çapında yaklaşık 50 milyon kişi demans hastasıdır ve yaşlı nüfusun artmasıyla birlikte bu sayının her 20 yılda bir neredeyse ikiye katlanarak toplam sayının 2050 yılında 152 milyona ulaşacağı öngörülmektedir (49). 2000 ve 2019 yılları arasında kalp hastalığına bağlı ölümler %7.3 azalırken, AH’ye bağlı ölümler %145 oranında artmıştır (50). Türkiye ise demans sıklığının en yüksek olduğu ülkeler arasındadır (51). Sağlık Bakanlığı verilerine göre Türkiye’de 2018 yılı itibariyle yaklaşık 500 bin Alzheimer Hastalığı tanısı almış hasta bulunmaktadır ve Türkiye İstatistik Kurumu tarafından 2050 yılında bu sayının 1.8 milyona ulaşacağı öngörülmektedir. 2019 Sağlık İstatistikleri Yıllığı verilerine göre 65 yaş ve üzeri bireylerin son 1 yıl içinde geçirdiği sağlık sorunlarının %6’sını Alzheimer Hastalığı oluştururken, ölümlerin %3’ü Alzheimer Hastalığı ve demans kaynaklı gerçekleşmiştir (52). Demansı olan ve olmayan 83 hastanın beyin otopsilerine dayanarak, Braak ve ark. hastalığın patolojik özelliklerini spesifik sinir hücrelerinin dejenerasyonu, nöritik plakların varlığı ve nörofibriler yumaklar olarak tanımlamıştır (53). En belirgin patolojik değişikliklerin, klinik semptomların ortaya çıkmasından yıllar önce oluşmaya başlayan ekstraselüler amiloid plakları ve intranöronal NFY birikimleri olduğu saptanmıştır (54,55). Bu birikimlerin AH patogenezinde nedensel olmaması mümkün olsa da, AH'yi demansa yol açabilen farklı hastalıklar arasında benzersiz bir nörodejeneratif hastalık olarak karakterize ederler. 2.1.1. Alzheimer Hastalığı Patofizyolojisi 6 Alzheimer Hastalığı, beta amiloid peptid içeren nöritik plaklar ve hiperfosforile tau protein içeren nörofibriler yumaklar ile karakterize ve nöron ve sinaps kaybı sonucunda beyin atrofisine yol açan karmaşık bir hastalıktır. İnsan beyninin karmaşıklığı, makul hayvan modellerinin ve araştırma araçlarının eksikliği nedeniyle, AH'nin ayrıntılı patogenezi şu ana kadar belirsizdir. Alzheimer Hastalığı hakkında amiloid-beta, tau, kolinerjik nöron hasarı, oksidatif stres ve nöroinflamasyon dahil olmak üzere çeşitli hipotezler geliştirilmiştir (56). a. Amiloid-Beta Hipotezi Amiloid-beta peptidi, bir transmembran protein olan amiloid prekürsör proteininin (APP) yıkım ürünlerindendir. Santral sinir sisteminde, APP bir dizi proteolitik enzimle kesilerek metabolize edilmektedir. APP, iki ayrı yolak üzerinden yıkıma uğrayabilir. Her iki yolakta da ikinci basamakta γ-sekretaz tarafından kesime uğrar. Amiloidojenik olmayan yolakta birinci basamakta α-sekretaz tarafından kesilen APP’den çözülebilir formda olan, çözülebilir amiloid prekürsör protein α (sAPPα) ve membrana bağlı 83 aminoasitlik C83 fragmanı oluşur. Daha sonra bu parça γ-sekretaz ile kesildiğinde ise yine çözülebilir bir form olan p3 ortaya çıkar ve membrana bağlı amiloid intraselüler domain (AICD) isimli fragman sitoplazmaya salınır. Amiloidojenik yolakta ise APP ilk olarak β-sekretaz (BACE-1; b-site APP cleavage enzyme 1) tarafından kesime uğrar. Bunun sonucunda çözülebilir amiloid prekürsör protein β (sAPPβ) ve membrana bağlı 99 aminoasitlik C-terminal parçası C99 ayrılır. C99’un γ-sekretaz ile işleme girmesi ise Amiloid-beta sekresyonu ve ACID oluşumu ile sonuçlanır. C99’un γ-sekretaz ile kesilmesinden ortaya çıkan amiloid-beta peptidinin uzunluğu 37 ve 42 aminoasit arasında değişkenlik gösterir. Fakat, uzun varyantlar (Amiloid-beta 40 ve özellikle 42) birikmeye daha yatkındır. Amilod-beta, fazla üretilmesi ya da azalmış temizlenmesi sonucunda, parçalanamayıp, yapısı nedeniyle oligomerize olmakta ve “beta-tabakası” tipinde bağlantılar kurarak çözünemez hale gelip plaklar şeklinde çökmektedir (56,57). Hem çözülebilir amiloid-beta hem de plaklar toksiktir ve bu hipotezde, bu toksik etkilerin tau hiperfosforilasyonu, inflamasyon, oksidatif stres gibi sekonder olaylara yol açtığı düşünülmektedir (58,59). 7 b. Tau Hipotezi Nörofibriler yumakların temel bileşeni hiperfosforile tau proteinleridir. Tau 17. kromozom tarafından kodlanan mikrotübül-ilişkili protein (microtubule-associated protein; MAP) ailesinden bir protein olup mikrotübüllerin stabilizasyonu, hücre iskeleti bütünlüğü ve kargo veziküllerinin aksonal taşınmasında rol almaktadır. Bu hipoteze göre, tau proteinlerinin işlevini ve izoform ekspresyonunu değiştiren mutasyonlar, onun hiperfosforilasyonuna yol açar. Stabilitelerini kaybeden tau proteinleri mikrotübüllere çok düşük bir afinite ile bağlanarak mikrotübül stabilitesinin bozulmasına neden olurlar. Ayrıca, hiper fosforlanmış tau ipliklerinin toplanmasıyla oluşan nörofibriller yumaklar, sinir hücrelerinin mikrotübül ağını parçalar. Bu, hücre içinde ve hücreden herhangi bir biyokimyasal iletişimin inhibisyonuna ve hücre iskeletinin tahrip olmasına yol açar (60). c. Oksidatif Stres ve Alzheimer Hastalığı Oksidatif stres, AH patogenezinde yer aldığı düşünülen mekanizmalardan bir diğeridir. Oksidatif stres, reaktif oksijen türleri (ROS) üretiminin hücrenin antioksidan savunma mekanizmasını aştığı durumda gerçekleşir. Beyin, yüksek enerji ihtiyacı, yüksek oksijen tüketimi, kolayca peroksitlenebilir çoklu doymamış yağ asitleri, güçlü bir ROS katalizörü olan demirin fazlalığı ve antioksidan enzimlerin görece azlığı nedeniyle oksidatif dengesizliğe oldukça duyarlıdır, bu durum Alzheimer Hastalığı’na sahip beyinlerde daha da belirgindir (61). Serbest radikallerin birikimi ve oksidatif stres, plazma ve mitokondri membranları gibi membranların lipit peroksidasyonu veya protein tersiyer yapı ve işlevinin ve nükleik asitlerin geri dönüşü olmayan modifikasyonu ile yapısal ve enzimatik proteinlerin oksidasyonuna sebep olarak hasara ve nöronal dejenerasyona neden olur. Ayrıca, amiloid-beta oligomerleri membran çift katmanları arasına girerek, ROS üretimine ve ardından hücre içi protein ve nükleik asit oksidasyonuna yol açabilir (60). Abartılı bir ROS üretimine karşı koymak için, mitokondri çok etkili bir antioksidan sisteme sahiptir, glutatyon peroksidaz, katalaz ve peroksiredoksin gibi. 8 Mitokondri DNA’sı (mtDNA), elektron transfer zincirinin yakınında yerleştiği ve histonlarla çevrili olmadığı için oksidatif hasara özellikle duyarlıdır. Mitokondri DNA’sının eşzamanlı artan oksidasyonu ve DNA onarımının eksikliği, mitokondri genomunda hasarı arttırabilir ve nöronal hasara neden olabilir. Oksidatif stres belirteçlerinin yüksekliği Alzheimer hastalarının beyinlerinde raporlanırken, ayrıca oksidatif stresten korunma mekanizmalarında da bozukluk saptanmıştır (3,62–66). Bu temelde, biyomoleküllerde oksidatif aracılı hasarın yaygın olarak AH'de rapor edilmesi oksidatif stresin hastalık patogenezinde kritik bir rol oynadığını düşündürmüştür (67). ROS oluşumunun ana kaynağı ve oksidatif hasarın ana hedefi olarak, mitokondrinin ilerleyici bozulması yaşlanma ve AH ile ilişkilendirilmiştir (68). Oksidatif stres ve mitokondri işlevsizliği arasındaki etkileşim, muhtemelen AH'de gözlenen değişiklikleri artıran kısır bir döngü oluşturur. d. İnflamasyon ve Alzheimer Hastalığı Reaktif gliozis ve nöroinflamasyon, AH'nin karakteristik özelliklerindendir. Transkriptomik çalışmalarla da desteklendiği gibi, mikroglia ile ilgili yolakların AH riski ve patogenezinde önemli bir yere sahip olduğu düşünülmektedir (56). Mikroglia, bir yandan kompleman bileşenleri, kemokinler, serbest radikaller ve inflamatuar sitokinler gibi inflamatuar mediatörleri serbest bırakarak, amiloid-beta oluşumuna ve oligomerlerin toplanmasına yol açarak AH patogenezini başlatır (69). Öte yandan, mikroglia, amiloid plaklarının temizlenmesini uyarır. Böylece, mikroglia aktivasyonunun neden olduğu nöroinflamasyon bir kısır döngüye girer ve amiloid-beta plakları mikrogliayı aktive ederken, mikroglia inflamatuar mediatörler üretir, inflamasyona ve amiloid-beta birikimine neden olur (70). Bu nedenle, mikroglia aşırı aktivasyonunun önlenerek bu döngünün inhibe edilmesi, AH'ye karşı potansiyel bir hedef olabilir. Mikroglianın erken uyarımı, amiloid-beta plağının temizlenmesinde oldukça yararlı olsa da, sonraki aşamalarda nöroinflamasyon ve apoptozu indükler (71). 2.2. Renin-Anjiyotensin Sistemi 2.2.1. Klasik ve Lokal Renin-Anjiyotensin Sistemine Giriş 9 Renin-anjiyotensin sistemi ilk olarak sıvı-elektrolit dengesini sağlayan, sistemik vasküler rezistansı ve kan basıncını düzenleyen endokrin sistemin parçası olarak tanımlanmıştır. İlk olarak reninin keşfinden (7) 40 sene sonra diğer bir RAS bileşeni olan anjiyotensin eş zamanlı olarak iki ayrı grup tarafından tanımlanmıştır (5,6). Klasik renin-anjiyotensin sistemi renal jukstaglomerular hücrelerden renin salınımı ile başlar. İlk ve hız kısıtlayıcı basamak olarak renin, anjiyotensinojeni anjiyotensin I’e çevirir. Anjiyotensin I daha sonra ACE enzimi ile Ang II’ye çevrilir. Bu sistem içinde, Ang II primer biyoaktif ürün olarak Anjiyotensin II tip 1 ve tip 2 reseptörleri üzerinden antagonistik etki gösterir (72–74). Klasik (sistemik) renin-anjiyotensin sisteminin yanında yakın zamanda lokal olarak sentezlenerek etki gösteren bir lokal RAS sisteminin de olduğu ve akciğer, böbrek, kalp ve göz gibi bir çok dokuda etkin olduğu gösterilmiştir (73,75,76). Bu yeni sistem lokal (doku) RAS olarak adlandırılmıştır. Bu lokal RAS sistemleri içinde, Ganten ve ark. tarafından keşfedilen beyine spesifik RAS, sistemik RAS birçok beyin bölgesinde kan beyin bariyerini geçerek etki gösteremediği için ayrı bir öneme sahiptir (77,78). 2.2.2. Beyin Renin-Anjiyotensin Sistemi Sistemik ve lokal olmak üzere beyinde iki ana renin-anjiyotensin sistemi mevcuttur (79,80). Sistemik RAS etkilerini kan beyin bariyeri (KBB) olmayan sirkümventriküler organlar aracılığıyla hipotalamus ve medullaya uzanarak gösterir (81,82). Beyin RAS’ta ise sistemik RAS’ın tüm komponentleri bağımsız olarak sentezlenerek etki gösterebilir (78,83). Beyinde aktif RAS genleri yanı sıra RAS bileşenlerinin de novo üretimi de genel olarak kabul edilmektedir (83–86). Anjiyotensinojen, beyinde çeşitli nöroaktif anjiyotensin peptitlerine dönüşmek üzere astrositlerden üretilir ve salınır (87,88). Anjiyotensinojenin dekapeptit Ang I'e dönüşümü, renin tarafından katalizlenir. Daha sonra, bir çinko metalloproteaz olan ACE, oktapeptit Ang II'yi oluşturmak için Ang I'in karboksi-terminal dipeptidini hidrolizler (78). Glutamil aminopeptidaz A (AP-A), Ang II'nin N-terminalindeki aspartat kalıntısını/rezidüsünü keserek heptapeptid anjiyotensin III'ü oluşturur ve Ang III daha sonra alanil aminopeptidaz N (AP-N) tarafından heksapeptit anjiyotensin IV'e 10 (Ang IV) dönüştürülür (89,90). Alternatif olarak Ang II, ACE'nin bir izoformu olan karboksipeptidaz P ve ACE2 tarafından Ang (1-7)’ye dönüştürülebilir (78). ACE2 ayrıca Ang I'i Ang (1-9)'a dönüştürebilir. Ang (1-7), ACE ile Ang (1-9)’dan veya nötr endopeptidaz ile Ang I'den dönüştürülebilir (91). Ang II, Ang (1-7) ve Ang IV beyinde etkileri gösterilen ana nöroaktif anjiyotensin peptidleridir (Şekil 1). Şekil 2. Beyin renin-anjiyotensin sistemi ligand ve reseptörleri Ang II, her ikisi de G-proteine bağlı reseptör (GPCR) ailesinin üyeleri olan iki reseptör alt tipi aracılığıyla etki eder: Anjiyotensin II tip 1 reseptörü (AT1R) ve Anjiyotensin II tip 2 reseptörü (AT2R) (92). İnsan anjiyotensin II tip 1 reseptörü 359 amino asit içerir ve 41 kDa'dır. Anjiyotensin II tip 2 reseptörü ise AT1R’e %34 özdeştir, 363 amino asitten oluşur ve 41kDa'lık bir kütleye sahiptir (93,94). AT1R'ler ve AT2R'ler çoğunlukla korteks, hipokampus ve bazal gangliyonlarda tanımlanmıştır (20,34,95). AT1R ve AT2R nöronlar, astrositler, mikroglia ve oligodendrositlerde gösterilse de, normal ve hipertansif koşullar altında AT1R ve AT2R'nin hücresel 11 konumları göstermeyi hedefleyen bir çalışma nöronlarda daha yoğun bulunduklarını göstermiştir (96). Sistemin en yeni keşfedilen bir başka reseptörü ise anjiyotensin tip 4 reseptörüdür (AT4R). Ang IV bu reseptör zerinden etki gösterir. Diğer anjiyotensin reseptörlerinden farklı olarak AT4R, insülinle düzenlenen aminopeptidaz (IRAP)’dır. AT4R'ler beynin bilişsel ve duyusal alanlarında bol miktarda bulunmuştur (90). AT1R ve AT2R uyarımı genellikle zıt etkilere yol açar. AT1R vazokonstriksiyon, hücresel proliferasyon, hücre büyümesi ve süperoksit üretimine aracılık ederken, AT2R vazodilatasyona aracılık eder ve antioksidan ve antiinflamatuar özellikleri gösterilmiştir (97,98). AT1R'nin Ang II ile uyarılmasından sonra, inositol trisfosfat, diaçilgliserol ve araşidonik asitten oluşan ikincil haberci sinyali, fosfolipaz C, A ve D gibi yolak efektörlerinin aktivasyonunu başlatır. Protein kinaz C, Akt, hücre içi protein kinazlar (reseptör ve reseptör olmayan tirozin kinazlar gibi) ve serin / treonin kinazlar (mitojenle aktive edilmiş protein kinaz [MAPK] ailesi kinazlar gibi), AT1R sinyal kaskadıyla etkinleştirilir (21). AT2R, protein fosfataz ve NO / siklik GMP sistemini aktive eder ve fosfolipaz A2'yi uyarır (97). AT2R ayrıca insülin ve epidermal büyüme faktörü reseptörlerinin otofosforilasyonunu engelleyerek hücre büyümesini ve proliferasyonunu bloke eder (99). Ayrıca, AT1R blokajı, negatif geri beslemeyi inhibe ederek anjiyotensinojen ve AT2R uyarımını artırır (100). 2.2.3. Anjiyotensin Reseptörlerinin Hücre Tipine Göre İşlevleri Nöronlarda, Ang II/AT1R yolağı, diğer dokularda olduğu gibi NADPH oksidaz aracılığıyla reaktif oksijen türleri üreterek, oksidatif stres oluşturur. Tersine, Ang II/ AT2R yolağı NO üretir ve süperoksit artışını engeller (23). Nöronlarda, Ang II/AT1R yolağı prooksidatif ve proinflamatuar özelliklere sahipken, Ang II/AT2R yolağı koruyucu olarak işlev görür (23). Ayrıca AT2R agonisti CGP421140'ın NO üretimini doza bağlı bir şekilde aktive ettiği ve AT2R blokörü PD-123319'un bunu azalttığı gösterilmiştir (17). Mitokondriye özgü RAS'ta olduğu gibi, nükleer RAS, oksidatif stresin düzenlenmesi için esastır. Ek reseptör türlerinin transkripsiyonu ve trafiği yoluyla 12 RAS'ın zararlı ve koruyucu yolakları arasındaki dengeyi korur (23,101,102). Nükleer AT1R'ler aktive edildiğinde, hem oksidatif hem de anti-oksidatif mekanizmalar başlatılır. Anjiyotensinojen ve renin mRNA seviyelerinde bir artış görülür, bu da daha fazla hücre içi Ang II sentezine yol açar. Eşzamanlı olarak, koruyucu AT2R seviyeleri artar ve AT2R'ler mitokondri ve hücre zarları gibi farklı organellere iletilir. Bu telafi edici mekanizmalar, yaşlanma ve bilişsel bozukluklarda işlevsiz olabilir (20). Ang II/AT1R ekseninin aşırı aktivasyonunun beyin üzerinde hipertansiyon, nöroinflamasyon, artan oksidatif stres, kan beyin bariyerinin bozulması ve nörotoksisite gibi birçok zararlı etkisi vardır (103,104). Ang II/AT1R yolağı, merkezi sinir sisteminde sempatik nörotransmitter salınımını artırır. Özellikle vazopressin, dopamin ve norepinefrin salınımını kolaylaştırmaktadır (105–107). Ayrıca çalışmalar, beyin RAS'ın inhibitör GABA ve uyarıcı glutamat vericileri üzerindeki etkilerini araştırmıştır. Ang II/AT1R ekseninin GABA'yı azalttığı ve glutamat salınımını arttırdığı gösterilmiştir (108–110). AT2R aktivasyonunun AT1R'nin nörosekretuar etkisine karşı işlev gördüğüne dair kanıtlar vardır (107,111). Ang II/AT1R sinyalinin etkilerinin aksine, Ang II, AT2R aktivasyonu yoluyla nöroprotektif mekanizmaları, NO üretimini, nörit büyümesini ve beyin gelişimini indükler, böylece bilişsel işlevi geliştirir (26). Bu bağlamda, bozulmuş AT2R sinyali, AT1R aracılı oksidatif stres ve nöroinflamasyon ile sonuçlanır, bu da bilişsel bozulmaya neden olabilir. Örneğin, hipokampus içinde AT2R aktivasyonunun azalmasının dendritik iskelet anormalliklerine ve uzaysal bellek eksikliklerine neden olduğu gösterilmiştir (112). Başka bir nöroprotektif mekanizma olarak, AT2R aktivasyonu, kemirgenlerde iskemik yaralanmadan sonra artan VEGF üretimi yoluyla nöronal sağkalımı ve nörolojik eksiklikleri iyileştirmiştir (113). AT2R aktivasyonu ayrıca, ubikuitin-konjuge edici bir enzim varyantı olan metil metansülfonata duyarlı 2'nin indüklenmesi yoluyla sinir sistemindeki hasarlı DNA'nın onarımını ve farklılaşmayı da arttırır (25). AT4R'ler çoğunlukla nöronlarda, özellikle duyusal ve bilişsel bölgelerde bulunur. AT4R'lerin bilişsel etkileri için davranışsal kanıtlar sunan ilk çalışmalardan birinde, intraserebroventriküler olarak bir Ang IV analogu kullanarak dairesel su labirenti görevinde skopolaminle indüklenmiş eksiklikleri olan sıçanların öğrenme ve 13 hafıza işlevlerinde iyileşme gösterilmiştir (114). Önceki çalışmalarda, Ang IV'ün etkisini, kısmen insülinle düzenlenen glikoz taşıyıcısı (GLUT 4) ile birlikte dağılan IRAP aracılığıyla gösterdiği öne sürülmüştür (115,116). Bu bağlamda, AT4R'lerin bazı etkilerini IRAP'ın katalitik aktivitesini inhibe ederek gösterdikleri düşünülmüştür (117–119). Bu inhibisyonla birlikte, Ang IV, vazopressin, oksitosin, somatostatin ve endotelyal NOS gibi bellek konsolidasyonunu ve geri çağrımını arttırdığı gösterilen çeşitli pro-bilişsel endojen peptitlerin yarı ömrünü uzatır. Belleği geliştiren bir diğer AT4R/IRAP aracılı yol da, GLUT4 veziküler trafiğinin düzenlenmesi yoluyla nöronal glikoz alımıdır (26,120–122), Ayrıca, AT4R aktivasyonu, hücre içi kalsiyum akışındaki artışlar yoluyla N-metil-d-aspartat bağımlı olmayan (NMDA olmayan) bir LTP (uzun süreli potansiyasyon) formunu indükler (123). Ang IV'ün bilişsel etkileriyle ilintili olarak, IRAP inhibitörlerinin hafızayı iyileştirdiği gösterilmiştir (124–126). Ang IV/AT4R'nin önerilen diğer bir nöroprotektif yolu, hepatik büyüme faktörü ve tip 1 tirozin kinaz reseptörü (c-Met) sinyallemesidir. HGF/c-Met yolunun bir aracısı olarak Ang IV, c-Met'i uyarır (121,127), bu da daha sonra NMDA'ya bağımlı olmayan LTP yolunu indükler (128–130). Ek olarak, HGF/c-Met sistemi, serebral kan akımını düzenleyerek serebroprotektif etkiler gösterir. HGF/c-Met sisteminin tüm bu işlevleri, AngIV/AT4R sistemininkilerle örtüşmektedir (131). Ang IV'ün öğrenme ve hafıza etkilerinin bir başka sebebi ise, nörotransmiter salgılanmasının düzenlenmesidir. Bu bağlamda, Ang IV'ün serotonin, dopamin ve asetilkolin salınımını modüle ettiği hipoteze edilmiştir (120,132,133). Bu hipotez, AT4R'ler ve D2 reseptörlerinin yakın lokalizasyonunu ve D2 ve D4 dopamin reseptörlerinin blokajı yoluyla AngIV ile indüklenen bilişsel iyileşmenin sınırlandırıldığını gösteren çalışmalarla desteklenmiştir (134–137). Astrositler beynin ana anjiyotensinojen kaynağıdır. Astrositlerin de hücre zarlarında, mitokondrilerinde ve çekirdeklerinde AT1R ve AT2R bulunur (23,138,139). Tamamen net olmasa da, az sayıda çalışma astrositlerde AT4R'lerin varlığını göstermektedir (140,141). Nöronlarda olduğu gibi, AT1R'lerin astrositlerde aşırı aktivasyonu oksidatif strese, inflamasyona ve bilişsel bozulmaya katkıda bulunur. 14 Bununla birlikte, astrositik AT1R aktivasyonu KBB'nin geçirgenliğini de etkiler (142,143). Mikroglial hücreler, beynin immün ve inflamatuar yanıtlarına aracılık eden makrofajlardır (144). İki durumda olabilirler: dinlenir veya aktif. Normal koşullarda, nöronlar tarafından salgılanan immünosupresif proteinler nedeniyle mikroglia dinlenme durumunda kalır. Adlarının aksine, dinlenme durumundaki mikroglia hücreleri, beyin homeostazındaki herhangi bir anormalliği tespit etmek için çevrelerini aktif olarak taramaktadırlar. Aktifleştiklerinde, iki farklı alt duruma kutuplaşabilirler: proinflamatuar/klasik olarak aktive edilmiş (M1) ve anti-inflamatuar/alternatif olarak aktive edilmiş (M2) alt durumları. M1 alt durumu, proinflamatuar mediyatörleri ve serbest radikalleri salgılayarak nöronal ölümü şiddetlendirir. Buna karşılık, bağışıklık düzenleyici mikroglia olan M2 substratı, beyin onarımını/rejenerasyonunu destekler, nöronları koruyan büyüme faktörleri ve anti-inflamatuar sitokinler üretir ve iltihabı azaltır (20). Herhangi bir beyin lezyonunun varlığında proinflamatuar M1'den immüno-düzenleyici M2 substratına yetersiz geçiş, inflamatuar sitokinlerin ve ROS'un uzun süreli salınımına neden olabilir, bunu artan nöroinflamasyon ve nörodejenerasyon izler (145–147). RAS'ın periferik bağışıklık sisteminde olduğu gibi bu bağışıklık düzenleyici yanıtta da rolü olduğu bilinmektedir (20). Özellikle RAS, mitokondri, çekirdek ve hücre zarları üzerindeki AT1R'ler ve AT2R'ler aracılığıyla mikrogliayı etkiler (23,27,139). M1 mikroglia proinflamatuar yanıtı uyarması ile AT1R'ler ve AT2R'ler upregüle olur. Bu şekilde, nükleer AT1R'nin aktivasyonu kendini upregüle eder ve M1 fenotipine doğru kaymaya yol açar. M1 pro-inflamatuar yanıtın AT1R aracılı aktivasyonunun, hücre ölümünü ve inflamasyonu şiddetlendiren ve sonuçta bozulmuş bilişe yol açan mekanizma olduğu öne sürülmüştür (148). AT1R ile gözlemlenene benzer şekilde, nükleer AT2R'nin aktivasyonu kendini upregüle eder ve M2 fenotipine doğru bir kaymaya yol açar (20). Bu değişim ayrıca, IL-10 ve IL-4 gibi anti-inflamatuar sitokinlerin üretimine ve sinaptik klirense yardımcı olan fagositik reseptörlerin ifadelerinin artışına yol açar (16,27,149,150). Bu mekanizma ile beyin RAS'ın Ang II/AT1R yolağı mikroglial aktivasyonu ve polarizasyonu artırarak nöroinflamasyona önemli katkıda bulunur (20). Sonuç olarak, uzun süreli ve çözülmemiş inflamasyon, nöronlara ve sinapslara zarar verir, bu da glial hücrelerin kronik düzensizliğine ve ardından beyin yapısında ve işlevinde kronik bozulmaya 15 neden olur (28). Antioksidan ve antiinflamatuar özelliklere sahip olan AT2R, hücrenin hayatta kalmasını ve sinaptik plastisiteyi desteklediği bilinen beyin kaynaklı nörotrofik faktörün (BDNF) üretimini de arttırır (148) ve bilişi geliştirir (151). AT2R ifadesi genellikle AT1R ile birlikte telafi edici bir mekanizma olarak artarken, bu ilişkinin yaşlanma ile bozulduğu gösterilmiştir (20). Oligodendrositler akson miyelinleştirici hücrelerdir ve hücre zarlarında AT1R ve AT2R'lerin mevcut olduğu düşünülmektedir. Özellikle oligodendrositlerde, AT1R'ler demiyelinizasyona yol açarken, AT2R'ler yeniden miyelinizasyonu teşvik ederek sinaptik iletimi artırır ve nöronal iletişimi geliştirir (90,152). 2.2.4. Beyin Renin-Anjiyotensin Sistemi ile Oksidatif Stres ve Nöroinflamasyon İlişkisi Önceki bölümde gözden geçirildiği gibi, RAS'ın beyindeki işlevleri hipertansiyonla sınırlı değildir. Bu işlevlerin düzensizliği beyin üzerinde zararlı etkilere neden olabilir. Bu bağlamda, beyindeki anksiyete, depresif bozukluk ve alkolizm dahil olmak üzere birçok farklı nöropsikiyatrik bozuklukta beyin RAS'ın rolü tanımlanmıştır (20). Beyin RAS, oksidatif stres ve nöroinflamasyonda önemli bir rol oynayarak kronik nörodejeneratif hastalıklara da yol açabilir (153). a. Oksidatif Stres Reaktif oksijen türlerinin, fizyolojik koşullar altında metabolizma, hücresel sinyalizasyon ve öğrenme ve bellek süreçlerinin uygun şekilde oluşumunda temel rolleri olsa da (154–156), aşırı miktarda üretilmeleri oksidatif strese yol açabilir (157). ROS, NADPH-oksidazın (NOX) birincil ürünü ve ksantin oksidaz, siklooksijenazlar, uncoupled NOS ve mitokondriyal elektron taşıma zinciri gibi diğer birçok enzimatik işlemin ikincil ürünleri olarak üretilirler (18). Bunlar arasında, membran NOX kompleksleri ve mitokondri, ROS'un iki ana kaynağıdır (158). Ayrıca, biriken ROS miktarları mitokondriyal bütünlüğü bozabilir, ATP üretimini azaltabilir ve daha fazla mitokondri kaynaklı ROS'a yol açabilir (159). Mitokondri kaynaklı ROS'un sitoplazmaya ulaşarak hücresel işlev bozukluğuna katkıda bulunduğu bilinmektedir. 16 ROS ile ilişkili oksidatif stres, oksidasyon yoluyla proteinlerin yapısal ve işlevsel modifikasyonlarına yol açar. Bu modifikasyonlar, bazı proteinlerin hidrofobikliğini arttırarak protein agregasyonuna yol açabilir. Protein agregasyonunun bir sonucu olarak hücresel toksisiteyi sınırlamak için okside olmuş ve hasar görmüş proteinlerin etkin bir şekilde uzaklaştırılması esastır. Bu uzaklaştırma, protein yıkılması ya da otofajik yol ile gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, ROS, proteazom sistemini de bozabilir ve protein yıkımının azalmasına ve sinüklein veya tau gibi anormal proteinlerin birikmesine nörodejeneratif hastalıklarda yol açabilir (160,161). Proteazom bazlı protein yıkımının ROS ile ilişkili inhibisyonu, otofajiyi arttırır. Hafif oksidatif strese yanıt olarak otofaji nöroprotektif olmasına rağmen, aşırı veya kronik upregülasyonu hücresel ölümü teşvik eder (162). Bu yollar ile ROS üretimi ve oksidatif stresin yıkıcı etkileri daha da şiddetlenebilir (163). Özellikle, hem proteazom aracılı yıkım hem de otofaji, yaşa bağlı işlev bozukluğu gösterir ve ROS'un bu süreçler üzerindeki etkileri, yaşa bağlı nörodejeneratif hastalıkların gelişimine katkıda bulunur (162,164). NOX'un yedi izoformu vardır. Bunlar arasında beyinde NOX1, NOX2 ve NOX4 tespit edilmiştir (165). Ang II/AT1R yolağının aşırı uyarılması, bu beyin NOX komplekslerini aktive edebilir ve aşırı miktarda ROS üretilebilir (166). Ang II'nin akut ve kronik uygulanması ile NOX2 aktivasyonu yoluyla beyinde ROS'un yükseldiği gösterilmiştir (167,168). Hücre dışı Ang II’nin, membrandaki AT1R'ye bağlanması ile NOX2'yi aktive eder, hücre içi Ca+2 seviyelerini arttırır ve hücre içi oksidatif stres oluşturur (169). Ek olarak, Ang II'nin serebral dolaşımdaki endotel bağımlı vazodilatasyonu yok edebildiği bilinmektedir. Bununla birlikte, ilginç bir şekilde Ang II'nin bu zararlı etkilerinin, Ang II ile tedavi edilen NOX2 eksikliği olan farelerde meydana gelmediğini gösterilmiştir (168). Nükleer ve mitokondriye ait AT1R'lerin aktivasyonu, nöronlarda fosfoinositol-3 kinaza ve protein kinaz C aktivasyonuna bağlanarak NOX4'ten türetilen ROS üretir (170–174). Önemli olarak, nükleer AT1R'lerin aktivasyonu, gen ifadelerini düzenler ve hücreleri oksidatif strese karşı koruyan çeşitli mekanizmaları tetikler (174). Özellikle nükleer RAS, AT2R mRNA ve anjiyotensinojenin ifadesini arttırır ve nöronlardaki AT1R etkilerine karşı koymak için Ang II /AT2R eksenini aktive eder (174–176). 17 Reaktif oksijen türleri oluşumunu artırmanın yanı sıra, RAS, süpürücü enzimlerin aktivitesini azaltarak mitokondrinin redoks dengesini değiştirebilir. Süperoksit dismutaz (SOD), katalaz ve glutatyon dahil olmak üzere birçok temizleyici, beyindeki oksidatif stresin azaltılmasında önemli bir role sahiptir. Üç SOD formu vardır: sitozolik bakır-çinko SOD (CuZnSOD; SOD1), mitokondriye ait manganez SOD (MnSOD; SOD2) ve hücre dışı CuZnSOD (SOD3). SOD1 ve SOD2 özellikle yaşa bağlı beyin bozuklukları için çok önemlidir (163). Alzheimer hastalığı patolojisinin transgenik fare modellerinde, bir SOD2 allelinin silinmesi amiloid plak oluşumunu arttırırken, SOD1'in silinmesi amiloid-beta oligomerizasyonunu, bilişsel bozukluğu ve nöronal işlev kaybını arttırmıştır (177,178). Ayrıca, SOD'un aşırı ifadesinin, amiloid-beta kaynaklı nörotoksisiteye ve iskemik beyin hasarına karşı duyarlılığın azalması ile ilişkili olduğu gösterilmiştir (179,180), ancak RAS aktivasyonu ile antioksidan moleküller olan glutatyon, SOD ve katalaz aktivitesinin azaldığı gösterilmiştir (181–183). Beyindeki ROS üretimi, yüksek oksijen tüketimi ve nörotransmiterlerin oksidatif metabolizması nedeniyle yüksektir ve beyni ek serbest radikal saldırılarına karşı son derece savunmasız hale getirir (184,185). Bazal ganglionlarda, dopaminerjik nöronlarda AT1R ifadesinin artşı ile hücre ölümü ve işlev kaybının arttığı gösterilirken (186–188), aynı tip hücrelerde, Ang II/AT2R yolağı aktivasyonunun ROS üretimini azalttığı gösterilmiştir (175). Oksidatif stresin bu RAS aracılı artışı, hücre ölümünü şiddetlendiren proinflamatuar yanıta yol açar (186,188). b. İnflamasyon Beyinde, mikroglial hücreler NOX kaynaklı ROS'a en önemli katkıyı yapanlardır (189). NOX izoformları arasında, NOX2, mikrogliadaki hücre dışı ROS'un birincil kaynağıdır (163). NOX'ten türetilen ROS ayrıca mikroglial aktivasyon, proliferasyon ve proinflamatuar sinyallerin salınımı ile ilgili hücre içi sinyal yollarını da etkiler (163,190–192). Ölü hücrelerin ve kalıntıların uzaklaştırılması için mikroglial hücrelerin aktivasyonu gerekli olsa da, bu inflamatuar kaskadın alevlenmesi çevredeki nöronlara zarar verebilir ve nörodejenerasyonun ilerlemesine neden olabilir (193). 18 AT1R/NOX yolağının upregülasyonu ile pro-inflamatuar yolak aktive olurken bu sinyal kaskadı ile mikroglia ROS üretimini daha da şiddetlendirir (194). Bu mekanizma, AT1R antagonistlerinin M1 mikroglia aktivasyonunu azalttığını ve M2 mikroglia polarizasyonunu arttırdığını gösteren bir çalışma ile de desteklenmiştir (195). Ayrıca, Ang II’nin proinflamatuar sitokinlerin (örn., IL-1b ve IL-6) üretimini teşvik ederken, anti-inflamatuar IL-10 seviyelerini düşürdüğü gösterilmiştir (196). Örnek olarak, yakın tarihli bir çalışma, Ang II uygulamasının hipokampal CD68- pozitif hücrelerde artışla birlikte hipokampusta bir pro-inflamatuar yanıta yol açtığını göstermiştir (197). Astrositlerde de, Ang II/AT1R yolağı, NF-kβ/ROS yoluyla IL-6 ve ROS üretimine aracılık eder (198). RAS reseptörleri aracılığıyla indüklenen inflamasyon düzenleyici mekanizmalar da vardır. AT4R'nin bir fare AH modelinde anti-inflamatuar etkilere aracılık ettiği gösterilmiştir (199). Beyinde, Ang II/AT1R/NOX prooksidatif ve proinflamatuar yolaklar ile Ang II/AT2R antioksidan ve antiinflamatuar yolaklar arasında hassas bir denge vardır. 2.3. Alzheimer Hastalığı ve Beyin Renin-Anjiyotensin Sistemi İlişkisi Çeşitli RAS ilişkili mekanizmaların Alzheimer Hastalığı patogenezine katkıda bulunduğu düşünülmüştür. Beyin RAS önceki bölümlerde tartışıldığı gibi, oksidatif stres ve nöroinflamasyon dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar yoluyla öğrenme ve hafıza, nöronal farklılaşma ve sinir rejenerasyonu süreçleri ile ilgilidir. Genetik, yaş ve muhtemelen çevresel toksinler gibi çeşitli yatkınlık faktörleri, senil plaklar ve NFY'ler gibi başlangıç lezyonlarının gelişimine katkıda bulunur. Bu ürünler inflamatuar yanıta, mikroglial aktivasyona ve sitokin salınımına yol açar, bu da nöron işlevsizliğini ve bilişsel düşüşü hızlandırır (55). Bu bağlamda inflamasyonun AH'nin ilerleyici nöropatolojisine katkıda bulunduğu düşünülmüştür (200). Önceki bölümde tartışıldığı gibi, beyin RAS'ın Ang II/AT1R yolağı, mikroglial aktivasyonu ve polarizasyonu artırarak nöroinflamasyona önemli bir katkıda bulunur. Bu uzun süreli ve çözülmemiş inflamasyon, nöronlara ve sinapslara zarar verir, bu da glial hücrelerin kronik düzensizliğine ve ardından beyin yapısı ve işlevinde kronik bozulmaya neden olur (201). Bununla uyumlu şekilde, daha yüksek Ang II seviyelerinin, daha düşük 19 toplam gri madde, hipokampal, rostral orta frontal ve supramarjinal parietal lob hacimleriyle ilişkili olduğu gösterilmiştir (202). Artan oksidatif stresin, mitokondriyal bozulmanın ve antioksidan sistemdeki değişikliklerin AH'ye katkıda bulunduğu öne sürülmektedir (29). Bölüm 2.2.3.1.'de açıklandığı gibi, Ang II/AT1R ekseninin aşırı aktivitesi, artan ROS ve oksidatif strese neden olur. Birincisi, oksidatif stres, mitokondri membranının lipid peroksidasyonu ile yapısal ve enzimatik proteinlerin ve nükleik asitlerin oksidasyonu ile hasara neden olur. Mitokondri DNA'sının artan oksidasyonu mitokondrinin bütünlüğünü bozar ve ATP üretimini azaltır, böylece potansiyel olarak mitokondrinin işlev kaybına neden olur (4). Mitokondri işlevinin azalması, AH'de gözlenen amiloid-beta üretimi, tau fosforilasyonu, sinaptik dejenerasyon ve oksidatif stres gibi hücresel değişikliklere yol açar (30,31). İkinci olarak, proteinlerin oksidatif stresle ilişkili modifikasyonları, amiloid-beta’nın toplanması ve tau proteininin fosforilasyonu ile sonuçlanarak AH'de yıkıcı döngüyü indükleyebilir (32). Amiloid-beta birikimi, AH patogenezinin bir başka önemli parçasıdır. İntraserebroventriküler Ang II uygulamasının sıçanlarda, γ-sekretaz aktivitesini ve amiloid-beta üretimini arttırdığı gösterilmiştir ve losartan uygulaması ile bu etkilerin azalması bu etkilerin AngII/AT1R yolağı ile ortaya çıktığını ortaya koymuştur (203). Ayrıca, RAS aşırı aktivitesinin, perisit hasarını gösteren yüksek BOS çözünür trombosit türevli büyüme faktörü reseptörü β ve KBB yıkımını gösteren yüksek BOS albümini dahil olmak üzere, AH'deki kılcal damar hasarının BOS belirteçleri ile korele olduğunu gösterilmiştir. Vasküler hastalık da AH'nin patogenezine katkıda bulunabilir. Kalınlaşmış bazal membran, azalmış damar elastikiyeti gibi beyin kılcal damarlarının ilerleyici dejenerasyonu beyne giden kan akışını bozar (204). AH'deki amiloid-beta kümelenmelerinin ve nöronal hasarın merkezi nedeni olarak nöroinflamasyon ile birlikte bozulmuş kan akışı da önerilmiştir (205). RAS, bu temel faktörlerin her ikisini de modüle edebilir. Bu bağlamda, Ang II/AT1R yolağı, serebral damarlarda vazokonstriksiyona, vasküler yeniden şekillenmeye, bozulmuş serebrovasküler otoregülasyona ve endotel işlevsizliğine neden olur (206,207). Ang II/AT1R yolağının KBB'ye zarar verebilecek, geçirgenliğini artırabilecek ve serebral kan akımını 20 azaltabilecek, böylece AH'nin patogenezine katkıda bulunabilecek proinflamatuar ve prooksidan etkileri vardır (208). Son olarak, beyin RAS'ın öğrenme ve hafıza ile ilgili önemli etkileri vardır (209). Bu etkilerden biri olarak, Ang II/AT1R yolağının aşırı aktivasyonunun asetilkolin salınımını azalttığı bilinmektedir (210,211). Ayrıca, Ang II enjeksiyonunun hipokampusta LTP’yi inhibe ettiği gösterilmiştir. Öte yandan, RAS'ın koruyucu kolu hafıza geliştirici etkilere sahiptir. Ang II/III yoluyla AT2R aktivasyonu, rejeneratif süreçlerin eşlik ettiği hücresel çoğalma ve farklılaşmayı başlatır. Ang IV, striatumda dopamin salınımını ve hipokampusta asetilkolin salınımını arttırır, böylece LTP'yi ve nöroproteksiyonu kolaylaştırır (212–215). Ang IV, AT4R'nin aminopeptidaz aktivitesini inhibe ederek vazopressin ve oksitosin gibi bilişi güçlendiren peptitlerin konsantrasyonlarını arttırır (216,217). RAS, şimdiye kadar bahsedilen birçok mekanizma aracılığıyla AH patolojilerinin kesişim noktasında yer alır ve bu nedenle AH patogenezinin potansiyel olarak kritik bir bileşenidir. Bunun ışığında ileri araştırmalar için anjiyotensin hipotezi önerilmiştir (218). Son olarak, RAS'ı modifiye eden ilaçların hali hazırda mevcudiyeti ve bu ilaçların AH'nin önlenmesi ve tedavisi için yeniden konumlandırılma potansiyeli beyin RAS ve AH ilişkisinin önemini arttırmaktadır. 2.4. Renin Anjiyotensin Sistemi Üzerinden Etki Gösteren İlaçlar ve Alzheimer Hastalığı Bugün itibariyle, AH için etkili bir risk azaltma, önleme veya tedavi stratejisi mevcut değildir. 20 yılı aşkın bir süredir, AH tedavisi için iki ilaç kategorisi kullanılmıştır. Bunlardan biri asetilkolinin yarı ömrünü uzatan kolinesteraz inhibitörleri, diğeri ise glutamat eksitotoksisitesini ve nöronal hasarı sınırlayan bir NMDA reseptör antagonisti olan memantindir (219). Son olarak da 2021 yılında Aducanumab, amiloid-beta agregatlarını hedefleyen bir anti-amiloid-beta antikor, yüksek dozlarda bilişsel gerilemede azalma etkisinin gösterilmesi ile FDA tarafından hızlandırılmış onay almıştır (36). Beyin RAS'ın keşfi ve iyi bilinen hipertansif etkisinin ötesinde sinir sistemi üzerindeki çok boyutlu etkileri ile RAS etkili ilaçlar, nörodejeneratif hastalıklar için potansiyel bir koruyucu ve tedavi edici müdahale 21 olarak düşünülmüştür. Üç tip RAS etkili ilaç vardır: ARB'ler, ACEİ'ler ve doğrudan renin inhibitörleri (DRİ), bunların her biri RAS sürecinin farklı adımlarında etkilidir. ARB'ler (örn. losartan, valsartan, telmisartan ve kandesartan) Ang II'nin AT1R'ye bağlanmasını bloke ederken, ACEİ'ler (örn. kaptopril, enalapril, lisinopril ve perindopril) Ang I'in Ang II'ye hidrolizini bloke eder. AT1R'nin blokajı, artan Ang II seviyeleri ile sonuçlanır ve sonuç olarak AT2R'nin uyarılmasını arttırır. Buna karşılık, ACEİ daha düşük Ang II seviyelerine neden olur ve sonuç olarak hem AT1R hem de AT2R'nin uyarılmasını azaltır (220). ARB'lerin, RAS’ın zararlı etkilerini daha spesifik bir şekilde bloke etmesi nedeniyle bilişsel bozulmanın önlenmesinde ACEİ'lere göre potansiyel avantajlara sahip olduğu varsayılmıştır (221,222). DRİ'ler, hem ARB'lerin hem de ACEİ'lerin yukarı akışında hareket ederek anjiyotensinojenden Ang I oluşumunu doğrudan inhibe eder (223). Tüm beyin anjiyotensin sistemi düşünüldüğünde Ang II/AT1R yolağının bloklanması amiloid-beta birikimini ve bunun sonuçlarını azaltabilir ve ayrıca inflamasyonu, oksidatif stresi, vasküler hasarı/iskemiyi baskılayabilir ve asetilkolin salınımını ve glutamat alımını artırabilir (224,225). ARB'ler KBB'nin bozulmasını önleyebilir ve AH gibi birçok nörodejeneratif hastalıkta gözlenen inflamatuar mediatörlerin infiltrasyonunu azaltabilir (224). 2.4.1. Anjiyotensin Reseptör Blokörleri Hayvan Çalışmaları Losartan ile ön tedavinin, hayvanlarda kronik etanol kaynaklı bilişsel eksiklikleri azalttığı (226) ve hem uzaysal hem de kısa süreli çalışma belleğini geliştirdiği gösterilmiştir (227,228). Telmisartanın in vitro ve in vivo olarak mikrogliayı modüle ederek uzun süreli antiinflamatuar etkiye sahip olduğu gösterilmiştir (229). Losartanın kronik intranazal uygulaması, bir AH fare modelinde amiloid plak sayısını azaltmıştır (230) ve ayrıca Ang II'nin neden olduğu bilişsel bozulmayı ve tau fosforilasyonunu azaltmıştır (231). Anti-amiloid-beta özelliklerine göre yaygın olarak reçete edilen 55 antihipertansif ilacı tarayan bir çalışmada, yalnızca valsartan ve losartanın primer nöron kültürlerinde hem amiloid-beta'yı düşürme hem de amiloid-beta peptitlerinin oligomerizasyonunu azaltma yeteneğine sahip olduğu, buna karşın kandesartanın yalnızca oligomerizasyon üzerinde etkili olduğunu bulunmuştur (232,233). Valsartan ile önleyici tedavi, AH fare modelinde kan 22 basıncının düşmesinden bağımsız olarak beyin amiloid-beta birikintilerini ve amiloid- beta aracılı bilişsel bozulmayı önemli ölçüde azaltmıştır (233). Başka bir çalışmada ise, olmesartan ve losartanın, amiloid-beta düzeylerini düşürmeden beyin mikrodamarlarında oksidatif stresi azaltarak kan basıncı değişikliklerinden bağımsız olarak bilişsel işlevi ve serebrovasküler aktiviteyi koruduğu gösterilmiştir (234,235). Bazı ARB'lerin, özellikle telmisartanın, anti-inflamatuar, anti-amiloidojenik ve insülin duyarlılaştırıcı etkileri ile AH'de bir hedef olan peroksizom proliferatörü ile aktive olan reseptör-g'nın (PPAR-g) kısmi agonistleri olduğu bulunmuştur. Bu bağlamda, telmisartanın faydalı etkilerinin sadece AT1R antagonist özelliklerine değil, aynı zamanda PPAR-g aktivasyonuna da atfedilmiştir (225,229,236). 2.4.2. Anjiyotensin Reseptör Blokörleri İnsan Çalışmaları Losartan ve hidroklorotiyazidi 69 yaşlı hastada karşılaştıran çift kör, randomize kontrollü bir çalışmada losartanın sadece kan basıncı üzerinde değil, aynı zamanda bozulmuş bilişsel işlev üzerinde de olumlu bir etkiye sahip olduğu gösterilmiştir (237). The Study on COgnition and Prognosis in the Elderly (SCOPE) çalışmasında yaşları 70 ile 89 arasında olan 4937 hafif-orta hipertansif hasta ortalama 3.7 yıl takip edilmiştir. Bu çalışmada kandesartan grubunda mini-mental durum testinde zamanla düşüşün daha az olduğu bulunmuştur (238). Ayrıca SCOPE çalışmasının sonuçlarıyla uyumlu olarak, katılımcıları periyodik mini-mental durum muayenesi ile değerlendirilen başka bir çalışmada anti-hipertansif tedavi ile düşüş daha yavaşken, ARB alan hastaların bilişsel puanlarının iyileştiği görülmüştür (239). Öte yandan, kardiyovasküler hastalığı olan 65 yaş ve üstü 819.491 erkek katılımcıda ARB'ler ACEİ'ler ve diğer kardiyovasküler ilaçlarla karşılaştırıldığında AH ve demans insidansını ve ilerlemesini azalttığı bulunmuştur (240). The Ginkgo Evaluation of Memory Çalışmasının (n =1.928) ikincil veri analizinde, diüretik, ARB ve ACEİ kullanımlarının, ortalama sistolik kan basıncından bağımsız olarak, normal bilişi olan yaşlı erişkinlerde AH riskinin azalmasıyla ilişkili olduğu gösterilmiştir (241). Ayrıca, bir başka meta-analizde de ARB'lerin Alzheimer'ın bilişsel bozulma riskinde koruyucu bir rolü olduğu gösterilmiştir (242). Daha yakın tarihli bir retrospektif kohort çalışması, statinlerle birleştirilen ARB'lerin AH'yi, RAS etkili 23 olmayan antihipertansiflerle kombine edilen statinlerden daha fazla azalttığını bulunmuştur (243). Benzer şekilde, 2 vaka kontrol çalışmasının ve 7 kohort çalışmasının meta-analizi, ARB kullanımının AH olay riskinin azalmasıyla ilişkili olduğunu göstermiştir (244). ARB'lerin AH üzerindeki rolünü daha fazla aydınlatmayı amaçlayan çalışmalar devam etmektedir (245,246). ARB'lerin umut verici birçok çalışmasının yanında, RAS etkili ilaçların herhangi bir yararlı etkisini göstermeyen çeşitli hayvan ve insan çalışmaları da mevcuttur. Örneğin, bir hayvan çalışmasında losartanın tek başına öğrenme ve hafızada herhangi bir değişikliğe neden olmadığını gösterilmiştir (247). İnsan çalışmalarında da benzer çelişkili sonuçlar mevcuttur. Örneğin, önceki bölümde bahsedilen SCOPE çalışmasında, demans insidansı açısından kandesartan ve plasebo grupları arasında herhangi bir fark gösterilmemiştir (248). 2.5. Hipotez ve Amaç Bu tez, beyin renin anjiyotensin sistemi ve Alzheimer Hastalığı patogenezi ilişkisini aydınlatmak üzere aşağıdaki hipotez kapsamında çalışılmıştır. Hipotez: Beyin renin-anjiyotensin sistemindeki düzensizlikler, oksidatif strese ve nöroinflamasyona yol açarak Alzheimer Hastalığı gelişimine katkıda bulunur, bu nedenle anjiyotensin reseptör blokörleri Alzheimer Hastalığı’nda gözlenen oksidatif stresi ve nöroinflamasyonu azaltmada kullanılabilir. Yukarıdaki hipotez doğrultusunda; Tezin amaçları, - Alzheimer Hastalığı’nda anjiyotensin reseptörleri farklılıklarını ve bu farklılıkların hastalığın patogenezinde önemli role sahip oksidatif stres, nöroinflamasyon, tangle ve amiloid-beta patolojileri ile ilişkisini göstermektir. - Anjiyotensin reseptör blokörlerinin kognitif bozukluğu olmayan bireylerde beyin RAS üzerindeki etkilerini ve oksidatif stres, nöroinflamasyon, tangle ve amiloid- beta patolojileri üzerindeki rolünü ortaya koymaktır. 24 - Anjiyotensin reseptör blokörlerinin Alzheimer Hastalığı’na sahip bireylerde beyin RAS üzerindeki etkilerini ve oksidatif stres, nöroinflamasyon, tangle ve amiloid- beta patolojileri üzerindeki rolünü ortaya koymaktır. 25 3. GEREÇLER VE YÖNTEMLER 3.1. Gereçler Bu tezde, beyin renin-anjiyotensin sistemi ve AH ile ilişkisi oksidatif stres ve nöroinflamasyon gibi olası patogenez mekanizmaları üzerinden tanımlanmıştır. Ardından da ARB’lerin bu ilişkiye olan etkisi araştırılmıştır. Çalışma Amerika Birleşik Devletleri’nde bulunan Johns Hopkins Üniversitesi Geriatri ve Gerontoloji Bilim Dalı dahilindeki Biology of Healthy Aging departmanında Doç. Dr. Peter Abadir’in laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. The Rush Memory and Aging Projesi kapsamında yıllık olarak takip edilmiş 70 yaş ve üzerinde 120 hastanın serum örnekleri ve ölüm sonrası elde edilen beyin kesitleri çalışma için kullanılmıştır. Bu çalışma kapsamında, cinsiyet ve yaş eşleştirilerek ölüm öncesi AH tanısı alan ve herhangi bir kognitif bozukluk saptanmadan ölen katılımcılar iki gruba ayrılmıştır. Daha sonra, kendi aralarında da ARB kullanan ve hiç kullanmamış olanlar olarak toplam dört grupta sınıflandırılarak (her bir grupta 30 katılımcı olmak üzere) çalışmaya toplam 120 katılımcı dahil edilmiştir. Bu 4 grup; 1. Kognisyon bozukluğu olmayan ve ARB/ACEİ kullanmayan (30 katılımcı) 2. Alzheimer Hastalığı olan ve ARB/ACEİ kullanmayan (30 katılımcı) 3. Kognisyon bozukluğu olmayan ve ARB kullanan (30 katılımcı) 4. Alzheimer Hastalığı olan ve ARB kullananlardır (30 katılımcı). Bu dört grubun otopsiden elde edilen beyin dokularından; 1. AGT (anjiyotensinojen geni), REN (renin geni), ACE (anjiyotensin dönüştürücü enzim geni) ifadeleri, 2. Anjiyotensin II tip 1, tip 2 ve tip 4 reseptörlerinin gen ve protein düzeyinde ifadeleri (AGTR1/AT1R, AGTR2/AT2R ve LNPEP/AT4R), 3. Beyin oksidatif stres belirteci olarak protein karbonil düzeyleri, 26 4. İnflamasyon belirteçleri olan interlökin 6 (IL-6), interlökin 1β (IL-1β), interferon-gamma (IFN-γ) ve tümör nekrozis faktör-α (TNF- α) düzeyleri ölçülmüştür. 5. Katılımcıların The Rush Memory and Aging Projesi kapsamında hesaplanmış PHF-tau tangle ve amiloid-beta skorları analiz için kullanılmıştır. Ayrıca, inflamasyon göstergelerinin düzeyleri (IL-6, TNF-α, IFN-γ ve IL-1β) hastaların serum örneklerinde de çalışılmıştır. Beyin RAS bileşenleri ile AH mekanizmaları (oksidatif stres ve inflamasyon) ve patolojileri (ortalama PHF-tau tangle ve amiloid-beta skorları) arasındaki ilişki araştırılmıştır. Çalışmanın ilk kısmında kognitif bozukluğu olmayan / normal kognisyonlu (NK) bireyler ve AH olan bireyler birbiri ile karşılaştırılırken, ikinci kısımda ise ARB kullanan ve kullanmayan kognitif bozukluğu olmayan bireyler kendi içinde ve ARB kullanan ve kullanmayan AH olan bireyler kendi içinde karşılaştırılmıştır. 3.1.1. Bireyler Bu çalışmada, The Rush Memory and Aging Projesi kapsamında gönüllü katılımcılardan toplanan beyin ve serum örnekleri kullanılmıştır. The Rush Memory and Aging Projesi, AH ve diğer patolojilerin beyinde birikmesine rağmen kişinin kognisyonunun korunması ile ilgili faktörlerin belirlenmesi ana amacı ile 1997 yılında oluşturulmuş bir projedir (249). Bu proje kapsamında hali hazırda demansı olmayan ve yıllık klinik değerlendirme ile organ bağışına izin veren katılımcılar çalışmaya dahil edilmiştir. Çalışma kapsamında katılımcılar beyin dokularına ek olarak, motor işlevlerdeki azalmayı araştıran diğer çalışmaları desteklemek amacı ile spinal kord, kas ve sinir bağışı yapmışlardır (250). The Memory and Aging Project için etik kurul onayı, The Institutional Review Board of Rush University Medical Center’dan L99032481-CR07 başvuru numarası ile alınmıştır. Bu araştırmanın etik kurul onayı ise The Institutional Review Board of The Johns Hopkins Medicine’dan IRB00229782 başvuru numarası ile alınmıştır. Tüm katılımcılar bilgilendirilmiş onam formu, Anatomic Gift Act’ı ve kaynak paylaşımı için onam formunu imzalamıştır. 27 Katılımcılar çalışmaya dahil olduktan sonra kullandıkları ilaçlar ve hastalıkları kaydedilmiştir. Katılımcıların yılda bir kontrolleri yapılmıştır. Katılımcıların hastalıkları ve ilaçları bu kontrollerde kaydedilmiştir. Kan basıncı ölçümleri bu kontrollerde yapılmıştır. Ayrıca her kontrolde katılımcıların kognitif işlevleri ölçülmüştür. 3.1.2. Fiziksel İşlev Yürüme hızı ve el sıkma gücü Rush MAP projesi kapsamında yıllık kontrollerde hesaplanmıştır. Bu çalışmada kullanılan yürüyüş hızı ve kavrama gücü Rush MAP verilerinden elde edilmiştir. 3.1.3. Çalışmada Kullanılan Beyin Örnekleri Ölüm sonrası dokuların temini için görevli ekip otopsileri gerçekleştirmiştir (251). Kafatası açıldıktan sonra, beyin çıkarılmış ve tartılmıştır. Beyin sapı ve beyincik hemisferlerden ayrılmış, steril koşullar altında frontal korteksten 50 mg gri madde çıkarılmış ve analiz edilene kadar -80°C'de saklanmıştır. 3.1.4. Çalışmada Kullanılan Serum Örnekleri Katılımcıların yıllık kontrollerde kan örnekleri alınmış ve serum alikotları - 80°C'de saklanmıştır. 3.2. Yöntemler 3.2.1. İnsan Beyin Örneklerinden Protein İzolasyonu ve Miktar Tayini Protein ekstraksiyonu için 25 mg beyin dokusu liziz tamponunda (T-PER, Pierce Biotechnology, Waltham, MA), Bullet Blender homogenizer (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ) kullanılarak homojenize edilmiştir. Elde edilen protein miktarı, BCA (Bikinkoninik asit) (Pierce) testi kullanılarak ölçülmüştür. 3.2.2. Western Blot Anjiyotensin II tip 1, tip 2 ve tip 4 reseptör protein ifadeleri için Western blot yöntemi kullanılmıştır. On beş mikrogram protein, %4- %12 akrilamid gradyan 28 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezine tabi tutularak analiz edilmiştir. Numuneler daha sonra standart koşullar kullanılarak bir nitroselüloz membrana aktarılmıştır. Membran, oda sıcaklığında 1 saat süreyle TBS-T içinde %5 yağsız süt ile bloke edildikten sonra aşağıda listesi verilen primer antikorlarla ayrı ayrı 4°C'de gece boyunca inkübe edilmiştir. Kullanılan antikorlar: -AT1R (sc-515884- Santa Cruz, CA), -AT2R (sc-9040- Santa Cruz, CA), -AT4R (HPA043642; Sigma-Aldrich, MO), -Anti-Aktin (A2066, Sigma-Aldrich, MO). Primer antikor uygulamasından sonra membranlar yıkanarak horseradish peroxidase (HRP)- konjuge sekonder antikor ile inkübe edilmiştir. Kemilüminesan sinyal, West Femto kiti ile elde edilmiştir ve Kodak Gel Logic 2200 yazılımı kullanılarak değerlendirilmiştir. Beta-aktin proteini normalizasyon için kullanılmıştır. Örnek Western blot bandları Ek-1’de gösterilmiştir. 3.2.3. İnsan Beyin Örneklerinden cDNA Hazırlanması Yirmi beş miligram beyin örneği RNA izolasyonu ve cDNA hazırlanması için kullanılmıştır. TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) ve DNase (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) RNA izolasyonu ve genomik DNA’nın uzaklaştırılması için kullanılmıştır. RNA konsantrasyonu ve saflığı UV-Vis spectrophotometre (NanoDrop, Wilmington, DE) kullanılarak ölçülmüştür. RNA absorbans oranı A260/280 ≥ 1.8 olması yeterli kabul edilmiştir. Elde edilen RNA −80°C ve altında saklanmıştır. Daha sonra elde edilen RNA’dan cDNA sentezlenmiştir. cDNA 37°C 60 dakikada sentezlenmiştir ve reaksiyon karışımı 94 °C’ ye ısıtılarak durdurulmuştur. 3.2.4. Kantitatif Gerçek-Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (kGZ- PZR) 29 cDNA sentezlendikten sonra PCR döngü parametreleri ve tüm primerler, Mx3000P Real-Time PCR System cihazı (Stratagene, La Jolla, CA) kullanılarak optimize edilmiştir. Reaksiyon koşulları: 95 °C 10 dakika, 40 döngü (15 saniye 95 °C ve 60 °C 60 saniye) olarak belirlenmiştir. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (kGZ-PZR) için TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) kiti üretici tarafından sağlanan talimatlara göre kullanılmıştır. AGT (Hs01586213_m1), renin (Hs00982555_m1), ACE (Hs00174179_m1), AT4R (Hs00893646_m1) gen ekspresyonu için TaqMan tahlil primerleri kullanılmıştır. AT1R gen primer sekansları F-5'-CACAGTGTGCGCGTTTCATT-3', R-5'- TGGTAAGGCCCAGCCCTAT-3' ve AT2R gen primer sekansları F-5'- CCCTAAAGGTGTCCAGCATT-3', R-5'-AGAGAGGAAGGGTTGCCAAAA-3' dır. Housekeeping genler olarak, Cytochrome c-1 (CYC1) (Hs00357718_g1) ve eukaryotic translation initiation factor 4A isoform 2’nin (EIF4A2) (Hs00756996_g1) kullanılmıştır (252). Bu tez kapsamında, katılımcıların beyin dokularından elde edilen housekeeping genlerin ve AGT, REN, ACE, AT1R, AT2R ve AT4R genlerinin Ct değerleri kullanılmıştır. Housekeeping Ct değeri CYC1 ve EIF4A2 genlerinin Ct verilerinin ortalaması kullanılarak hesaplanmıştır. Gen ifadesindeki kat değişimleri 2- ΔΔCt yöntemi ile hesaplanmıştır ve kontrol grupları hipoteze göre belirlenmiştir. Kat değişim tabloları Tablo 2, Tablo 3, Tablo 4, Tablo 5, Tablo 6, Tablo 8 ve Tablo 9’da verilmiştir. Ayrıca gruplar arasındaki farklılıkların anlamlılığı ΔCt verileri kullanılarak analiz edilmiştir (Şekil 2, Şekil 3). 3.2.5. Oksidatif Stres Beyin oksidatif stres belirteci olarak protein karbonil düzeyleri OxiSelect ELISA (Cell Biolabs, San Diego, CA) ile ölçülmüştür. Bu tez kapsamında, katılımcıların beyin örneklerinden elde edilen protein karbonil düzeyleri korelasyon ve farklılıkların anlamlılığı analizleri için kullanılmıştır (Şekil 4 ve Şekil 8). 3.2.6. Sitokinler 30 Beyin ve serum IL-6, TNF-α, IFN-γ ve IL-1β sitokin düzeyleri, mesoscale 4- Plex sitokin test kiti kullanılarak ölçülmüştür. Pro-inflamatuar sitokinler, hastaların beyin dokusunda ve serumunda test edilmiştir. Bu kitten elde edilen veriler Meso Sector S 600 (Meso Scale Discovery) ile ölçülmüştür. Bu tez kapsamında, katılımcıların serumlarından ve beyin örneklerinden elde edilen sitokin seviyeleri korelasyon ve farklılıkların anlamlılığı analizleri için kullanılmıştır (Şekil 11). 3.2.7. Amiloid-beta Yükü ve Tangle Yoğunluğu Amiloid-beta yükü ve tangle yoğunluk skorları Rush MAP çalışmasından temin edilmiştir. Bu çalışma kapsamında daha önce tarif edildiği gibi beyin otopsileri yapıldıktan sonra immünohistokimyasal boyama ve görüntüleme ile, entorhinal korteks, kalkarin korteks, singulat korteks, parietal girus, temporal girus, hipokampus, orta frontal girus, üst frontal korteks olmak üzere sekiz beyin bölgesinden ortalama yüzde yoğunluk kullanılarak hesaplanmıştır. Son olarak, tüm beyin bölgelerinin ortalaması kullanılarak tüm beyin için genel amiloid-beta yükü ve tangle yoğunluğu skorları elde edilmiştir. Bu tez kapsamında, yukarıda sıralanan beyin bölgelerine ve tüm beyinin ortalamasına ait amiloid-beta skorları ve tangle skorları analiz için kullanılmıştır. 3.3. İstatiksel Analiz İstatistiksel analiz için SPSS 23 ve GraphPad Prism 9 kullanılmıştır. Normal dağılım gösteren değişkenler ortalama±standart sapma (SD) olarak ifade edilirken, normal dağılım göstermeyen değişkenler ortanca (çeyrekler arası aralık (ÇAG)) olarak ifade edilmiştir. Normal dağılımı test etmek için Shapiro Wilk-W testi kullanılmıştır. Farklılıkların anlamlılığını test etmek için normal dağılan değişkenler için bağımsız gruplarda t testi ve normal dağılmayan değişkenler için Mann-Whitney U testleri kullanılmıştır. İkili değişkenleri karşılaştırmak için ki-kare testi kullanılmıştır. Korelasyon analizi Spearman korelasyon testi ile yapılmıştır. İki yönlü varyans analizi (ANOVA) (hastalık durumu (NK’ye karşı AH) ve faktör olarak ARB kullanımı ile) ile dört grup analizi yapılmıştır. Aracılık analizi, SPSS için PROCESS makro programı kullanılarak önyükleme yöntemiyle yapılmıştır (253). İstatistiksel anlamlılık eşiği olarak ≤ 0.05'lik bir p değeri kullanılmıştır. 31 4. BULGULAR 4.1. Alzheimer Hastalığı Olan Bireylerde Kognitif Bozukluğu Olmayan Bireylere Göre Beyin Renin Anjiyotensin Sistemi Farklılıkları İlk olarak birinci hipotezimiz çerçevesinde, Alzheimer Hastalığı olan bireylerdeki beyin renin-anjiyotensin sistemindeki farklılıkları anlayabilmek ve fark saptanırsa bu farkın Alzheimer Hastalığı patogenezinde önemli rolü olan oksidatif stres ve inflamasyon ile ilişkisini ortaya koyabilmek ve son olarak saptanan farkların Alzheimer Hastalığı’nın temel patolojik göstergeleri olan amiloid-beta yükü ve tangle yoğunluğu ile ilişkisini ortaya koyabilmek üzere kognitif (bilişsel) işlev bozukluğu olmayan (AH ve hafif bilişsel bozukluğu olmayan) yani normal kognisyonlu bireyler ile Alzheimer Hastalığı olan bireylerin AGT, ACE ve REN gen ifadeleri ve beyin ana anjiyotensin reseptörlerinin (AT1R, AT2R ve AT4R) gen ve protein ifadeleri ölçülmüştür ve birbirleri ile karşılaştırılmıştır. Daha sonra bu düzeylerin oksidatif stres, inflamasyon, amiloid-beta yükü ve tangle yoğunluğu ile ilişkisi incelenmiştir. 4.1.1. Demografik Özellikler Kognitif bozukluğu olmayan ve AH olan katılımcıların karakteristikleri Tablo 1. de gösterilmiştir. Yaş, cinsiyet, vücut kitle indeksi, eğitim seviyesi ve fiziksel parametreler açısından iki grup arasında fark saptanmazken hipertansiyon tanısı alan kişi sayısı AH grubunda NK’ye göre yüksek bulunmuştur (p = 0,01), fakat sistolik ve diyastolik kan basıncı ölçümleri açısından iki grup arasında anlamlı bir farklılık gözlenmemiştir (sırası ile, p = 0,06, p = 0,19). Tablo 1. Katılımcı karakteristikleri NK (n = 30) AH (n = 30) p- değeri Yaş, ortalama± SD 90.2±5.1 90.1±5.7 1 Cinsiyet, erkek, n (%) 5 (17) 5 (17) 1 Eğitim, yıl, ortanca (ÇAG) 18 (16-21) 18 (18-21) 0,73 32 VKİ, ortanca (ÇAG) 24 (22,6-25,2) 24,8 (23,4-29) 0,29 Yürüme hızı, m/s, ortalama±SD 0,63±0,24 0,56± 0,19 0,34 El sıkma gücü, kg, ortalama±SD 33,5±15,1 30,1±10,4 0,50 Koroner damar hastalığı, n (%) 7 (23,3) 7 (23,3) 1 İnme, n (%) 6 (20) 6 (20) 1 Kanser, n (%) 12 (40) 9 (30) 0,42 Hipertansiyon, n (%) 16 (53,3) 25 (83,3) 0,01* Tiroid hastalığı, n (%) 5 (16,7) 11 (36,7) 0,08 Diabetes mellitus, n (%) 3 (10) 7 (23,3) 0,17 Sistolik KB, ortalama±SD 124±19 134±16 0,06 Diyastolik KB, ortalama±SD 67±10 72±12 0,19 PMI, saat, ortanca (ÇAG) 5,63(4,3-15,3) 6,93(4,2-10,6) 0,98 Kısaltmalar: AH, Alzheimer Hastalığı; ÇAG, Çeyrekler arası aralık (interquartile range); KB, kan basıncı; NK, Kognitif bozukluğu olmayan; PMI, ölüm sonrası geçen süre (post-mortem interval); SD, standart sapma; VKİ, vücut kitle indeksi; * p £ 0.05. 4.1.2. Alzheimer Hastalığı’nda Beyin RAS Ana Ligandı Anjiyotensinojen ve Katalitik Enzimlerin (Renin ve ACE) Gen İfade Düzeylerindeki Farklılıklar Beyin RAS sistemi ana ligandı Anjiyotensinojen (AGT) gen ifadesinde iki grup arasında fark saptanmamıştır (p = 0,33). Benzer şekilde, katalik enzimler Renin (REN) ve ACE gen ifade seviyelerinde de istatistiksel anlamlı fark saptanmamıştır (sırası ile, p = 0,07, p = 0,66). Gen ifadelerinin kat değişim sonuçları Tablo 3’te verilmiştir. Tablo 2. Alzheimer Hastalığı Olan Katılımcılarda Kognitif Olarak Normal Olan Bireylere Göre AGT, REN ve ACE Gen İfadeleri Gen Protein Kat değişimi p değeri AGT Anjiyotensinojen 0,79 0,33 REN Renin 0,65 0,07 33 ACE Anjiyotensin-dönüştürücü enzim 0,92 0,66 4.1.3. Alzheimer Hastalığı’nda Anjiyotensin Reseptörlerinin Gen İfade ve Protein Seviyelerindeki Farklılıklar Oktapeptid Ang II, anjiyotensin sisteminin ana vazoaktif peptididir. Ang II, her ikisi de G-protein kenetli reseptörler olan AT1R ve AT2R anjiyotensin reseptörlerine eşit afinite ile bağlanır (254). Ang II bağlanmasının işlevsel sonuçları, reseptör alt tipi ekspresyonu ve mevcudiyeti tarafından yönetilir, yani, daha yüksek AT1R seviyeleri, daha baskın bir AT1R yanıtını tetikleyecektir. Bu tez çalışmasında, bu bağlamda AT1R, AT2R ve AT4R gen ve protein ifade seviyelerini iki grup arasında karşılaştırılmıştır. Sonuçlar, AH'li katılımcıların daha düşük AT1R mRNA düzeyine (0.40 kat-değişimi, p = 0.01) ve daha yüksek AT1R protein düzeyine sahip olduklarını göstermiştir (ortanca [ÇAG] 0.59 [0.45-0.76] vs. 0.47 [0.19-0.63], AH vs. NK, p = 0.03) (Şekil 2). Şekil 2. Kognitif olarak normal olan ve Alzheimer Hastalığı olan katılımcılarda angiotensin II tip 1 reseptör gen ve protein ifade seviyeleri (A) Rölatif gen ekspresyon seviyesi NK’li (n = 29) ve AD’li (n = 30) grupta. Gen kat-değişimi 2-ddCT metotu ile hesaplandı ve log2 olarak gösterilmiştir. Veri ortalama ve güven aralığı şeklinde sunulmuştur. (B) AT1R protein seviyesi NK’li (n = 30) ve AH’li (n = 30) katılımcılarda. Veri kutu-çizgi (minimum-maksimum değerleri ile) grafiği ile verilmiştir. * p £ 0.05. Kısaltmalar: AH, Alzheimer Hastalığı; AT1R, Anjiyotensin II tip 1 reseptör; NK, Normal Kognisyon 34 Anjiyotensin II tip 2 reseptör seviyesine baktığımızda ise, verilerimiz AH'li katılımcıların daha düşük AT2R gen ifade düzeyine sahip olduğunu göstermiştir (kat değişimi= 0,38, p = 0,01), ancak gruplar arasında AT2R protein ifade seviyeleri açısından istatistiksel anlamlı bir fark gözlemlenmemiştir (p = 0,86). Son olarak, beyin RAS’ın en yeni üyelerinden olan anjiyotensin tip 4 reseptörü gen ifadesi seviyeleri açısından gruplar arasında fark gözlenmemiştir (p = 0,88). Benzer şekilde, AT4R protein seviyeleri NK’li ve AH’li bireyler arasında farklı saptanmamıştır (p = 0,95). Reseptörlerin gen ifade kat değişim sonuçları Tablo 4’te verilmiştir. Tablo 3. Alzheimer Hastalığı Olan Katılımcılarda Kognitif Olarak Normal Olan Bireylere Göre AGTR1, AGTR2 ve LNPEP Gen İfadeleri Gen Protein Kat değişimi p değeri AGTR1 Anjiyotensin II tip 1 reseptörü 0,40 0,01 AGTR2 Anjiyotensin II tip 2 reseptörü 0,38 0,01 LNPEP Anjiyotensin tip 4 reseptörü 1,10 0,88 Bu sonuçlar birlikte ele alındığında, AH'li katılımcıların beyinlerinde Anjiyotensin II tip 1 reseptör proteini daha yüksek seviyedeyken, AT2R ve AT4R seviyelerinde bir farklılık gözlenmemiştir (Şekil 3). Daha yüksek AT1R protein seviyelerinin, AT1R’nin bilinen etkileriyle korele olup olmadığını ve Alzheimer Hastalığı ile ilişkisini incelemek için, daha sonra anjiyotensin reseptörlerinin oksidatif stres ve inflamasyon ile ilişkisini incelenmiştir. 35 Şekil 3. Alzheimer Hastalığı olan katılımcıların beyin renin anjiyotensin sistemlerindeki farklılıkların şekilsel gösterimi. Kısaltmalar: ACE; Anjiyotensin dönüştürücü enzim, Ang; Anjiyotensin, AP-A; Aminopeptidaz A, AP-N; Aminopeptidaz N, AT1R; Anjiyotensin II tip 1 reseptörü, AT2R; Anjiyotensin II tip 2 reseptörü, AT4R; Anjiyotensin tip 4 reseptörü, Kesikli ok; İstatistiksel anlamlı olmayan değişiklikler, Ok; İstatistiksel anlamlı değişiklikler. 4.1.4. Anjiyotensin Reseptörleri ve Oksidatif Stres İlişkisi Beyin AT1R protein seviyeleri hem kognitif olarak normal olan hem de Alzheimer Hastalığı olan katılımcılarda oksidatif stres göstergesi olan protein karbonil seviyeleri ile pozitif korele bulunmuştur (r = 0,62 p = 0,02, r = 0,337 p = 0,03, sırası ile) (Şekil 4). Beyin AT2R protein seviyeleri ile oksidatif stres arasında bir korelasyon bulunmazken, beyin AT4R protein seviyeleri ile protein karbonil seviyeleri normal kognisyonlu bireylerde ters ilişkili bulunmuştur (r = -0,363 p = 0,02) . 36 Şekil 4. Anyiyotensin II tip 1 reseptör seviyesi ile oksidatif stres ilişkisi. Serpilme diyagramı (95% güven aralığı ve regresyon çizgisi) protein karbonil seviyeleri ile AT1R seviyeleri arasındaki korelasyon (A) Normal kognisyonlu katılımcılar (n = 30) (B) Alzheimer Hastalığı olan katılımcılar (n = 30). 4.1.5. Anjiyotensin Reseptörleri ve İnflamasyon İlişkisi Alzheimer Hastalığı nöropatogenezinde önemli bir yeri olan inflamasyonun anjiyotensin reseptörleri ile ilişkisini ortaya koymak için AT1R, AT2R ve AT4R seviyeleri ile serum ve beyin IL-6, TNF-α, IFN-γ ve IL-1β seviyeleri arasındaki ilişki incelenmiştir. Bu iki grupta, serum ve beyin IL-6, TNF-α, IFN-γ, ve IL-1β sitokin seviyeleri ile anjiyotensin reseptör seviyeleri arasında bir korelasyon saptanmamıştır. Ayrıca, inflamatuvar sitokinlerin serum ve beyin seviyeleri arasında da bir korelasyon saptanmamıştır. 4.1.6. Anjiyotensin Reseptör Seviyeleri ile Amiloid-Beta Yükü ve Tangle Yoğunluğu İlişkisi Son olarak, anjiyotensin reseptörleri ile Alzheimer Hastalığı patogenezinde önemli bir yere sahip olan amiloid-beta ve tangle skoru arasındaki ilişki bu tezin ilk hipotezi çerçevesinde incelenmiştir. AT1R proteini ve AT2R protein seviyeleri ile beyin patolojileri arasında NK ve AH gruplarında bir korelasyon saptanmamıştır. AT4R proteini, AH'de tüm beyin ve hipokampal tangle skorları ile negatif korelasyon göstermiştir (sırasıyla r = −0,349, p = 0,03, r = −0,356, p = 0,03). 37 4.1.7. AT1R Protein Seviyelerinin Oksidatif Stres Aracılığıyla Tangle Yoğunluğu Üzerine Etkisi Beyin oksidatif stresinin AT1R ve AH patolojileri arasındaki ilişkiye aracılık edebileceğini düşünerek bunu test etmek için standartlaştırılmış bağımsız değişkenler ve bootstrapped aracılar (n = 1000) kullanarak bir aracılık modeli oluşturduk. Hipotezimizle uyumlu olarak, AT1R ve tangle oluşumuna sahip modelin önyüklemeli yol analizi, bu değişkenler arasında oksidatif stres aracılığıyla etkileşim gösteren önemli bir dolaylı yol (beta = 0,2372, %95 Güven aralığı [0,0487, 0,4318]) bulundu. Bu aracılı etki kısmiydi ve toplam etkinin %35.7'sini oluşturuyordu (Şekil 6). Buna karşılık, AT1R ve amiloid-beta arasında böyle bir dolaylı etki mevcut değildi. Şekil 5. Anyiyotensin II tip 1 reseptörünün oksidatif stres aracılı etkisi. a*b, dolaylı etki; c’, doğrudan etki. Aracılı analiz bootstrapping metotu ile SPSS için the PROCESS macro programı kullanılarak yapılmıştır. 4.2. Anjiyotensin Reseptör Blokörü Kullanımının Normal Kognisyonlu Bireylerin Beyinlerine Etkisi Öncelikle ARB’lerin normal kognisyonlu bireylere etkisini incelemek için ARB ve ACEİ hiç kullanmamış normal kognisyonlu bireyler ile ARB kullanmış Oksidatif Stres a*b= 0.2372 %95 CI (0,0487, 0,4318) 38 normal kognisyonlu bireylerin ölüm sonrası elde edilen beyin dokularında AGT, ACE ve REN gen ifadeleri ve beyin ana anjiyotensin reseptörlerinin (AT1R, AT2R ve AT4R) gen ve protein ifadeleri ölçülmüştür ve birbirleri ile karşılaştırılmıştır. Daha sonra bu düzeylerin oksidatif stres, inflamasyon, amiloid-beta yükü ve tangle yoğunluğu ile ilişkisi incelenmiştir. 4.2.1. Demografik Özellikler Katılımcıların karakteristik özellikleri Tablo 2.de verilmiştir. Vücut kitle indeksi ve fiziksel işlev göstergeleri istatistiksel olarak gruplar arasında farklı değilken ARB kullanan grubun eğitim yılı ARB kullanmayan gruba göre daha düşük saptanmıştır. Ayrıca, ARB kullanan grupta kullanmayan gruba göre daha fazla sayıda hipertansiyon tanısı alan katılımcı saptanmıştır (p <0,001) ve ortalama sistolik kan basıncı da bu grupta daha yüksek saptanmıştır (p = 0,025). Tablo 4. Anjiyotensin reseptör blokör (ARB) kullanan ve kullanmayan normal kognisyonlu katılımcı karakteristik özellikleri NK (n=30) NK +ARB (n=30) p value Yaş, ortalama±SD 90,2±5,1 90,04±3,5 0,858 Cinsiyet, erkek, n (%) 5 (17) 5 (16,7) 1 Eğitim, yıl, ortanca (ÇAG) 18 (16-21) 15 (12-17) <0,001* VKİ, ortanca (ÇAG) 24 (22,6-25,2) 25,6 (23-28,6) 0,156 Yürüme hızı, m/s, ortalama±SD 0,63±0,24 0,58±0,17 0,441 El sıkma gücü, kg, ortalama±SD 33,5±15,1 36,1±11,0 0,605 Koroner damar hastalığı, n (%) 7 (23,3) 7 (23,3) 1 39 İnme, n (%) 6 (20) 8 (26,7) 0,542 Kanser, n (%) 12 (40) 14 (46,7) 0,605 Hipertansiyon, n (%) 16 (53,3) 29 (96,7) <0,001* Tiroid hastalığı, n (%) 5 (16,7) 12 (40) 0,045* Diyabet mellitus, n (%) 3 (10) 6 (20) 0,472 Sistolik KB, ortalama± SD 124±19 136±18 0,025* Diyastolik KB, ortalama± SD 67±10 71±10 0,420 PMI, saat, ortanca (ÇAG) 5,63 (4,3-15,3) 5,33 (4,5-6,5) 0,574 Kısaltmalar: ÇAG, Çeyrekler arası aralık (interquartile range); KB, kan basıncı; NK, Kognitif bozukluğu olmayan; PMI, ölüm sonrası geçen süre (post-mortem interval); SD, standart sapma; VKİ, vücut kitle indeksi. * p £ 0.05. 4.2.2. Normal Kognisyonlu ARB Kullanan Bireylerde Kullanmayanlara Göre Beyin RAS Ana Ligandı Anjiyotensinojen ve Katalitik Enzimler (Renin ve ACE) Gen İfade Düzeylerindeki Farklılıklar Beyin RAS sistemi ana ligandı Anjiyotensinojen (AGT) ve renin (REN) gen ifadesi ARB kullanan grupta azalmıştır (0,54 kat-değişimi, p = 0,03- 0,47 kat-değişimi, p = 0,03, sırası ile). ACE gen ifade seviyelerinde ise istatistiksel anlamlı fark saptanmamıştır (p = 0,26). Kat değişim sonuçları Tablo 6’da verilmiştir. Tablo 5. Anjiyotensin Reseptör Blokör Kullanan Normal Kognisyonlu Bireylerin Kullanmayanlara Göre AGT, REN ve ACE Gen İfadeleri Gen Protein Kat değişimi P değeri AGT Anjiyotensinojen 0,54 0,03 REN Renin 0,47 0,03 ACE Anjiyotensin-dönüştürücü enzim 0,71 0,26 40 4.2.3. Normal Kognisyonlu Bireylerde ARB Kullanımının Anjiyotensin Reseptör Gen ve Protein İfade Düzeyleri Üzerine Etkisi Anjiyotensin reseptör blokörünün beyin anjiyotensin reseptörleri üzerindeki etkilerini aydınlatmak için AT1R, AT2R ve AT4R'nin gen ve protein seviyeleri ölçülmüştür ve ARB ile tedavi edilen ve edilmeyen gruplar arasında karşılaştırılmıştır. Sonuçlarımız, kognitif bozukluğu olmayan (Hafif Kognitif Bozukluk veya demans olmayan) ARB kullanan ve kullanmayan iki grup arasında ARB kullanımı ile AT1R gen ifade düzeyi anlamlı şekilde düşükken (0,32 kat-değişimi, p = 0,004), AT1R protein seviyelerinde anlamlı bir fark olmadığını gösterilmiştir (ortanca (ÇAG) 0,47 (0,19-0.63) vs 0,46 (0,30-0.68), NK vs NK+ARB, p = 0,243) (Şekil 7A). Benzer şekilde, ARB tedavisi ile AT2R gen ifade düzeyi anlamlı şekilde düşükken (0,29 kat- değişimi, p = 0,003), AT2R protein seviyeleri arasında da istatistiksel anlamlı bir fark gözlenmemiştir (ortanca (ÇAG) 0,45 (0,26-1,08) vs 0,39 (0,27-1,11), NK ve NK+ARB, p = 0,848) (Şekil 7B). Bununla birlikte, ARB kullanan NK’li katılımcılarda AT4R gen ifade düzeylerinde fark yokken (1,14 kat-değişimi, p = 0,56), daha yüksek AT4R protein seviyeleri tespit edilmiştir (ortanca (ÇAG), 0,17 (0,01-0,76) ve 0,69 (0,23-0,96), NK vs NK+ARB, p = 0,018) (Şekil 7C). Kat değişim sonuçları Tablo 7’de verilmiştir. Tablo 6. Anjiyotensin Reseptör Blokör Kullanan Normal Kognisyonlu Bireylerin Kullanmayanlara Göre AGTR1, AGTR2 ve LNPEP Gen İfadeleri Gen Protein Kat değişimi P değeri AGTR1 Anjiyotensin II tip 1 reseptörü 0,32 0,004 AGTR2 Anjiyotensin II tip 2 reseptörü 0,29 0,003 LNPEP Anjiyotensin tip 4 reseptörü 1,14 0,56 41 Şekil 6. Normal kognisyonlu ARB kullanan ve kullanmayan bireylerde anjiyotensin reseptör protein seviyeleri farkları. (A) Anjiyotensin II tip 1 reseptör (AT1R) protein seviyeleri (B) Anjiyotensin II tip 2 reseptör (AT2R) protein seviyeleri (C) Anjyiotensin tip 4 reseptör (AT4R) protein seviyeleri ARB kullanan (n = 30) ve kullanmayan (n = 30) kognitif bozukluğu olmayan grupta. (D) Gruplara ait western blot örnekleri. Veriler kutu-çizgi (min-maks) ile gösterilmiştir. (* p £ 0,05). 4.2.4. Normal Kognisyonlu Bireylerde ARB Kullanımının Oksidatif Stres ile İlişkisi Yaşlanma ve kognitif işlevlerde önemli bir yere sahip olan oksidatif stresin biyolojik belirteci olarak beyin protein karbonil seviyeleri ölçüldü ve gruplar arasında karşılaştırıldı. Protein karbonil seviyeleri, NK grubuna kıyasla NK+ARB grubunda daha düşüktü (ortanca ve (ÇAG) 10,6 (9.5-11.9) vs. 11,3 (10.5-13.8), NK+ARB vs. NK, p = 0,035) (Şekil 8). 42 Şekil 7. ARB kullanan (NK+ARB) ve kullanmayan (NK) normal kognisyonlu bireylerde protein karbonil seviyeleri farkı. * p £ 0,05 4.2.5. Normal Kognisyonlu Bireylerde ARB Kullanımının İnflamasyon ile İlişkisi ARB kullanan ve kullanmayan gruplar arasında beyin ve serum sitokinleri (IL- 6, TNF-α, IFN-γ ve IL-1β) açısından fark saptanmamıştır. 4.2.6. Nor