T.C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ REKOMBİNANT GRANÜLOSİT KOLONİ UYARICI FAKTÖRÜN BİYOPOLİMERLERLE ENZİMATİK KONJUGASYONU VE PROTEİNİN ÖZELLİKLERİ ÜZERİNDEKİ ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI ÜZERİNDE ÇALIŞMALAR Dr. Ecz. Ayşe Göksu KAYA ÖZSAN Farmasötik Biyoteknoloji Programı DOKTORA TEZİ ANKARA 2017 T.C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ REKOMBİNANT GRANÜLOSİT KOLONİ UYARICI FAKTÖRÜN BİYOPOLİMERLERLE ENZİMATİK KONJUGASYONU VE PROTEİNİN ÖZELLİKLERİ ÜZERİNDEKİ ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI ÜZERİNDE ÇALIŞMALAR Dr. Ecz. Ayşe Göksu KAYA ÖZSAN Farmasötik Biyoteknoloji Programı DOKTORA TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Ayşe Filiz ÖNER ANKARA 2017 vi TEŞEKKÜR Tez çalışmam süresince engin bilgi ve tecrübesiyle bana her konuda destek olan, karşılaştığım zorluklarda ilgisi ve desteği ile yol gösteren, yardımını esirgemeyen çok değerli danışman hocam Prof. Dr. Sayın Ayşe Filiz ÖNER’e, Eğitim hayatım boyunca gösterdikleri ilgi, destek ve bilimsel katkılarından dolayı Anabilim Dalı başkanımız Prof. Dr. Türkan ELDEM’e, Tez çalışmalarım sırasında analizlerdeki destekleri için Analitik Kimya Anabilim Dalı öğretim üyesi Doç. Dr. Emirhan NEMUTLU’ya, Farmasötik Kimya Anabilim Dalı öğretim üyesi Prof. Dr. Erhan PALASKA’ya ve Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı öğretim üyesi Yrd. Doç. Dr. Işıl ÖZAKÇA’ya, hücre kültüründeki desteği için Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı öğretim üyesi Prof. Dr. İmran VURAL ve araştırma görevlisi Ecz. Naile ÖZTÜRK’e, Tez çalışmam boyunca bana destek olan, güler yüzü ve enerjisi ile bana moral veren anabilim dalımız araştırma görevlisi Ecz. Özgün Fırat DÜZENLİ’ye, deneylerimde büyük bir özveri ile birçok konuda yardımlarını gördüğüm, dostluklarını ve desteklerini esirgemeyen Analitik Kimya, Farmasötik Teknoloji, Farmasötik Kimya, Biyokimya ve Eczacılık Temel Bilimleri Anabilim Dallarının araştırma görevlilerine, Duydukları güven ve sevgi ile her zaman yanımda olan, hayatımın her aşamasında gösterdikleri sabır ve özveri için annem Aynur KAYA, babam Süleyman Recai KAYA, kardeşim Gökberk KAYA ve eşim Utku ÖZSAN başta olmak üzere değerli aileme, Hayata gözlerini açalı sadece 2 ay olmuşken doktora çalışmalarım için bana izin veren, hayattaki zorlu testlerin sadece laboratuvarda olmadığını gösteren, yaşadığımız anların ve boşa harcanan zamanın kıymetini daha iyi anlamamı sağlayan biricik oğlum Utkan Alp ÖZSAN’a, Tez çalışmalarımı yürütmem için proje (114S759) desteği sağlayan TÜBİTAK Araştırma Destek Programları Başkanlığı Sağlık Bilimleri Araştırma Grubu’na, Akademik çalışmalarımı verdikleri burs (2211-A) ile destekleyen TÜBİTAK Bilim İnsanı Destekleme Daire Başkanlığı’na teşekkür ederim. vii ÖZET Kaya Özsan, AG. Rekombinant Granülosit Koloni Uyarıcı Faktörün Biyopolimerlerle Enzimatik Konjugasyonu ve Proteinin Özellikleri Üzerindeki Etkilerinin Araştırılması Üzerinde Çalışmalar, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Farmasötik Biyoteknoloji Programı Doktora Tezi, Ankara, 2017. Son yıllarda ikinci kuşak protein ilaçlar üzerinde araştırmalar yapılmakta ve ürünler geliştirilmektedir. Bu tez çalışmasında proteinlerle ikinci kuşak ilaç geliştirme yaklaşımlarına bir yenisini eklemek amaçlanmıştır. Bu amaçla filgrastimin mikrobiyal transglutaminaz aracılığı ile daha önce bu yaklaşımla üzerinde çalışma yapılmamış bir polimer ile konjugatının hazırlanması planlanmıştır. Konjugasyon çalışmaları polisakkarit yapıda doğal bir polimer olan kitosanın hidrolizatları ile yapılmıştır. SEC-HPLC, RP- HPLC, Fourier transform infrared spektroskopisi, kütle spektroskopisi, SDS-PAGE jel elektroforezi, izoelektrik odaklama ve western blot ile yapılan analizlerle konjugat oluşumu gösterilmiştir. Ayrıca HPLC, FTIR ve kütle spektroskopisi analizlerinde konjugatın birbirine yakın büyüklükte üç farklı moleküler yapıdan oluştuğu belirlenmiştir. Konjugat oluşumu başarıldıktan sonra sıcaklık, bekletme süresi, pH, bileşenlerin farklı oranları gibi etkenlerin konjugat oluşumu ve dayanıklılığı üzerindeki etkileri incelenmiş ve konjugat oluşumunda polimerin oranının etkili olduğu görülmüştür. Konjugatın çözeltisinin ve liyofilize formunun kararlılığının dört ay 5±3o C derecelik bekletme koşulunda değişmediği görülmüştür. Konjugat çözeltisinin biyoetkinliği hücre kültürü çalışmaları ile Avrupa Farmakopesi’ne uygun şekilde NFS-60 hücreleri kullanılarak araştırılmış ve referans filgrastime göre oluşan konjugatın daha etkili olduğu görülmüştür. Anahtar Kelimeler: Proteinler, filgrastim, rh G-CSF, farmasötik biyoteknoloji, transglutaminazlar, kitosan hidrolizatları, protein konjugatları. Destekleyen Kurumlar: TÜBİTAK (SBAG 114S759 nolu 1001 projesi) viii ABSTRACT Kaya Özsan, AG. Enzymatic Conjugation of Recombinant Granulocyte Colony Stimulating Factor with Biopolymers and Studies on the Effects on Protein Properties, Hacettepe University Health Sciences Institute Ph.D. Thesis in Pharmaceutical Biotechnology, Ankara, 2017. Second generation protein products are studied and products are developed in recent years. Aim of this thesis is to add a new alternative to second generation drug development approaches with filgrastim. For this purpose, enzymatic conjugation of filgrastim with transglutaminase is designed by using a polymer which is not used for this aim before. Conjugation studies are conducted with hydrolysates of chitosan, which is a natural polymer in the polysaccharide structure. Conjugate formation is shown by SEC-HPLC, RP-HPLC, Fourier transform infrared spectroscopy, mass spectroscopy, SDS-PAGE gel electrophoresis, isoelectric focusing and western blot analysis. In addition, HPLC, FTIR and mass spectral analysis showed that conjugate is formed of three similar molecular weight subfraction. After the conjugate formation, effects of parameters such as temperature, reaction period, pH and different ratios of components on the formation and stability of conjugates are studied. Polymer ratio is found to be the main factor on conjugate formation. Solution and lyophilized forms of conjugate is found stable at 5±3oC for four months. Bioactivity of the conjugate solution is studied on cell cultures complying with the European Pharmacopeia by using NFS-60 cells and conjugate is seen more active than reference filgrastim. Keywords: Proteins, filgrastim, rh G-CSF, pharmaceutical biotechnology, transglutaminases, chitosan hydrolysates, protein conjugates. This study was supported by grant 114S759 from TUBITAK. ix İÇİNDEKİLER ONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER VE KISALTMALAR xiii ŞEKİLLER xvi TABLOLAR xx 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1. Rekombinant DNA Teknolojisi ile Üretilen Proteinler 4 2.1.1. Rekombinant Büyüme Faktörleri 5 2.2. İkinci Kuşak Protein İlaçlar 10 2.3. Protein-Polimer Konjugatları 11 2.3.1. Kimyasal Konjugasyon 12 2.3.2. Enzimatik Konjugasyon 13 2.4. Polimerler 15 2.4.1. Polietilen Glikol (PEG) 15 2.4.2. Kitosan 16 2.5. Enzimler 20 2.5.1. Transglutaminaz 20 2.6. Protein Analizinde Kullanılan Yöntemler 22 2.6.1. Kromatografik Yöntemler 23 2.6.2. Spektroskopik Yöntemler 26 x 2.6.3. Elektroforetik Yöntemler 28 2.6.4. Diğer Yöntemler 29 2.7. Filgrastimin Biyotayini 30 3. GEREÇ VE YÖNTEM 31 3.1. Kullanılan Maddeler ve Cihazlar 31 3.2. Filgrastimin Fizikokimyasal Özellikleri 34 3.2.1. Filgrastim Çözeltisinin Hazırlanması 34 3.2.2. Filgrastimin UV Spektroskopik Analizi 34 3.2.3. Filgrastimin HPLC ile Analizi 34 3.3. Kitosanın Fizikokimyasal Özellikleri 40 3.3.1. Kitosan Çözeltisinin Hazırlanması 40 3.3.2. Kitosan Hidrolizatlarının Elde Edilmesi 41 3.3.2. Düşük Molekül Ağrılıklı Kitosan ve Kitosan Hidrolizatlarının UV Spektrumu 41 3.4. Transglutaminazın Fizikokimyasal Özellikleri 41 3.4.1. Transglutaminaz Çözeltisinin Hazırlanması 41 3.5. Enzimatik Yöntemle Konjugatların Oluşturulması 42 3.6. Konjugat Oluşumunun Tayini 43 3.6.1. HPLC ile Tayinler 43 3.6.2. Elektroforetik Yöntemlerle Yapılan Analizler 44 3.6.3. Preparatif Amaçlı Kromatografi Çalışmaları 50 3.6.4. Spektroskopik Tayinler 51 3.6.5. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) 51 3.6.6. Konjugattan Ayrılan Filgrastimin Tayini 52 3.6.7. Hücre Kültürlerinde Filgrastimin ve Konjugatının Biyoetkinliğinin Tayini 53 3.6.8. Proteinin Konjugattaki Kararlılığı 56 4. BULGULAR 57 4.1. Filgrastimin Fizikokimyasal Özelliklerinin Tayini 57 4.1.1. Filgrastimin UV Spektroskopik Analizi 57 4.1.2. Filgrastimin Ters-Faz HPLC ile Miktar Tayini ve Yöntemin Validasyonu 59 xi 4.1.3. Filgrastimin Büyüklük Dışlama HPLC (SE-HPLC) Kromatografisi ile Tayini- 1 64 4.1.4. Filgrastimin Büyüklük Dışlama HPLC (SE-HPLC) Kromatografisi ile Tayini- 2 64 4.2. Kitosanın Fizikokimyasal Özellikleri 65 4.2.1. Düşük Molekül Ağırlıklı Kitosan ve Hidrolizatlarının UV Spektrumu 65 4.3. Konjugat Oluşumunun Tayini 66 4.3.1. HPLC ile Tayinler 66 4.3.2. Elektroforetik Yöntemlerle Yapılan Analizler 75 4.3.3. Preparatif Amaçlı Kromatografi Çalışmaları 87 4.3.4. Spektroskopik Tayinler 89 4.3.5. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) 93 4.3.6. Konjugattan Ayrılan Filgrastimin Tayini 94 4.3.7. Hücre kültürlerinde Filgrastimin ve Konjugatının Biyoetkinliğinin Tayini 95 4.3.8. Proteinin Konjugattaki Kararlılığı 97 5. TARTIŞMA 99 5.1. Filgrastimin Fizikokimyasal Özelliklerinin Tayini 99 5.1.1. Filgrastimin UV Spektroskopik Analizi 99 5.1.2. Filgrastimin Ters-Faz HPLC ile Miktar Tayini ve Yöntemin Validasyonu 99 5.1.3. Filgrastimin Büyüklük Dışlama HPLC (SE-HPLC) Kromatografisi ile Tayini- 1 100 5.1.4. Filgrastimin Büyüklük Dışlama HPLC (SE-HPLC) Kromatografisi ile Tayini- 2 101 5.2. Kitosanın Fizikokimyasal Özellikleri 101 5.2.1. Düşük Molekül Ağırlıklı Kitosan ve Hidrolizatının UV Spektrumunun Belirlenmesi 101 5.3. Konjugat Oluşumunun Tayini 102 5.3.1. HPLC ile Tayinler 102 5.3.2. Elektroforetik Yöntemlerle Yapılan Analizler 105 5.3.3. Preparatif Amaçlı Kromatografi Çalışmaları 109 5.3.4. Spektroskopik Tayinler 110 xii 5.3.5. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) 111 5.3.6. Konjugattan Ayrılan Filgrastimin Tayini 111 5.3.7. Hücre Kültürlerinde Filgrastimin ve Konjugatının Biyoetkinliğinin Tayini 112 5.3.8. Proteinin Konjugattaki Kararlılığı 113 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 114 7. KAYNAKLAR 116 8. EKLER EK-1: Tez Çalışması ile İlgili Poster EK-2: Tez Çalışması ile İlgili Yayın 9. ÖZGEÇMİŞ xiii SİMGELER VE KISALTMALAR AC Affinite Kromatografisi ACN Asetonitril ALS Amyotrophic Lateral Sclerosis, Amyotrofik Lateral Skleroz APS Amonyum Persülfat ATRP Atom Transfer Radical Polymerization, Atom Transfer Radikal Polimerizasyonu BSA Bovine Serum Albumin, Sığır Serum Albumini CN 4-kloro-1-naftolol COS Kitooligosakkarit DAB 3,3´-diaminobenzidin DMSO Dimetil Sülfoksit DNA Deoxyribonucleic Acid, Deoksiribonükleik Asit DSC Differential Scanning Calorimetry, Diferansiyel Taramalı Kalorimetre ECL Enhanced Luminol-Based Chemiluminescence, İyileştirilmiş Luminol Bazlı Kemilüminesans EPO Erythropoietin, Eritropoetin ESI Electrospray İonization, Elektrosprey İyonizasyon Fab Fragment Antigen Binding, Antijen Bağlayan Kısım FBS Fetal Bovin Serumu Fc Fragment Crystallizable Region, Değişmez Kısım FDA United States Food and Drug Administration, Amerikan İlaç ve Gıda Dairesi FTIR Fourier Transform Infrared, Fourier Dönüşümlü Kızılötesi G-CSF Granulocyte Colony Stimulating Factor, Granülosit Koloni Stimüle Edici Faktör GF Gel Filtration, Jel Filtrasyon Gln Glutamin Aminoasidi GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor, Granülosit Makrofaj Koloni Stimüle Edici Faktör GM-DF Granulocyte Macrophage Differentiation Factor, Granülosit Makrofaj Farklılaştırıcı Faktör xiv H/DX Hydrogen Deuterium Exchange, H/D Değişim HES Hydroxyethyl starch, Hidroksietil Nişasta HIC Hydrophobic Interaction, Hidrofobik Etkileşim HILIC Hydrophilic Interaction, Hidrofilik Etkileşim HPLC High Performance Liquid Chromatography, Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi HPMA N-(2-hydroksipropil) metakrilamid HRP Horseradish Peroksidazı IEF Isoelectric Focusing, İzoelektrik Odaklama IEX Ion Exchange, İyon Değiştirme IFN Interferon IgG Immunoglobulin G IL Interleukin, İnterlökin k Kapasite Faktörü kDa Kilo Dalton LOD Limit of Detection, Saptama Sınırı LOQ Limit of Quantification, Tayin Sınırı Lys Lizin Aminoasidi MALDI Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization, Matriks ile Desteklenmiş Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon metG-CSF Filgrastim mPEG Monometoksi Polietilen Glikol MS Mass Spectroscopy, Kütle Spektroskopisi MTS 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sülfofenil)-2H- tetrazolyum MTT 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2, 5-difenil-2H-tetrazolyum bromid N Teorik Tabaka Sayısı NMR Nuclear Magnetic Resonance, Nükleer Manyetik Rezonsans PAGE Poliakrilamid Jel Elektroforezi xv PBS Phosphate Buffered Saline, Fosfat Tamponlu Tuz PEG Polietilen Glikol PGA Poliglutamik Asit pH Potential of Hydrogen, Hidrojenin Gücü pKa Acid Dissociation Constant, Asitlik Sabiti PMS Fenazin Metosülfat PVP Polivinil Prolidon RAFT Reversible Addition−Fragmentation Chain Transfer Polymerization, Zincir Transfer Ajanı ile Geri Dönüşümlü Ekleme-Fragmentasyon Zincir Transferi rDNA Rekombinant DNA rh Rekombinant İnsan RP Reverse Phase, Ters Faz RPMI Roswell Park Memorial Institute, Roswell Park Memorial Enstitüsü RSD Bağıl Standart Sapma SCF Stem Cell Factor, Kök Hücre Faktörü scFv Single Chain Variable Fragment, Tek Zincir Değişken Kısım SDS Sodyum Dodesil Sülfat SE Size Exclusion, Büyüklük Dışlama SS Standart Sapma TBST Tween 20 İçeren Tris Tamponlu Tuz Çözeltisi TEMED Tetrametiletilendiamin TFA Trifloroasetik Asit Tgase Transglutaminase, Transglutaminaz TGF Transforming Growth Factor, Tümör Büyüme Faktörü TNF Tumor Necrosis Factor, Tümör Nekroz Faktör TPO Thrombopoietin, Trombopoetin tR Alıkonma Zamanı UV Ultraviyole WHO World Health Organisation, Dünya Sağlık Örgütü xvi ŞEKİLLER Şekil Sayfa 2.1. Hematopoetik büyüme faktörlerinin işlevleri (7). 7 2.2. Filgrastim molekülünün amino asit dizilimi (19). 9 2.3. Protein-polimer konjugatlarının tarihsel gelişimi (36). 11 2.4. metG-CSF’in 135. glutamin artığının moleküldeki yeri (54). 15 2.5. Polietilen glikolün kimyasal yapısı. 15 2.6. Kitosanın elde edilmesi (67). 17 2.7. Kitosanın parçalanma yolları (89). 19 2.8. Transglutaminaz çalışma prensibi (92). 20 2.9. (A) ɛ-(γ-glutamil) lizin çapraz bağ oluşumu (B) Küçük molekül ağırlıklı aminlerin proteine bağlanması (97). 21 2.10. Transglutaminazın katalizlediği reaksiyonlar (101). 22 2.11. Kromatografik ayırım (118). 24 2.12. Jel Filtrasyon (Büyüklük Dışlama) Kromatografisi çalışma prensibi (117). 25 3.1. Float-A-Lyzer G2 yüzen membranların kullanımı. 13 53 3.2. Filgrastim ve konjugat çözeltilerinin karşılaştırılmasında kullanılan plaka düzeni. F: Filgrastim, K: Konjugat. 14. 55 3.3. Filgrastim, filgrastim-polimer ve konjugat çözeltilerinin karşılaştırılmasında kullanılan plaka düzeni. F: Filgrastim, K: Konjugat, FP: Filgrastim-polimer. 15 55 4.1. Filgrastimin UV Spektroskopisi ile kalibrasyon doğrusu (n=6). 16 57 4.2. Filgrastimin UV Spektroskopisi ile kalibrasyon doğrusu (n=6). 17 58 4.3. Filgrastim, enzim ve polimere ait kromatogramlar. Mavi: filgrastim, kırmızı: enzim, yeşil: polimer. 18 59 4.4. Filgrastimin kalibrasyon doğrusu (n=6). 19 60 4.5. Yöntemin doğruluğu için çizilen kalibrasyon doğrusu (n=6). 20 61 4.6. Filgrastim çözeltisinin kromatogramı.21 63 4.7. Filgrastim, enzim ve polimere ait kromatogramlar. Mavi: filgrastim, kırmızı: enzim, yeşil: polimer.22 64 4.8. Filgrastim, enzim ve polimere ait kromatogramlar. Mavi: filgrastim, kırmızı: enzim, yeşil: polimer. 23 65 4.9. Düşük molekül ağırlıklı kitosanın spektrumu.24 65 xvii 4.10. Düşük molekül ağırlıklı kitosan hidrolizatının spektrumu.25 66 4.11. Konjugat ve filgrastim kromatogramları. Mavi: filgrastim, kırmızı: filgrastim ve polimer, yeşil: enzim varlığında filgrastim ve polimer. 26 66 4.12. Düşük molekül ağırlıklı kitosan ile oluşturulan konjugat çözeltisine ölçüm sırasında eklenen filgrastimin etkisi. Kırmızı: konjugat çözeltisi, mavi: konjugat çözeltisine ölçüm sırasında eklenen filgrastimi içeren konjugat çözeltisi. 27 67 4.13. Referans filgrastim ile konjugasyon ortamındaki filgrastim çözeltisi kromatogram karşılaştırması. Mavi: referans filgrastim, kırmızı: pH 5,5 filgrastim çözeltisi.28 68 4.14. Filgrastim ve konjugat çözeltilerine ait kromatogramlar. Mavi: konjugat çözeltisi, kırmızı: filgrastim çözeltisi. 29 68 4.15. Filgrastim, enzim-filgrastim, polimer-filgrastim ve konjugat çözeltisi kromatogramlarının karşılaştırması. Mavi: konjugat çözeltisi, kırmızı: enzim-filgrastim çözeltisi, yeşil: polimer-filgrastim çözeltisi, mor: filgrastim çözeltisi. 30 69 4.16. Filgrastim, ve K1, K2 ve K3 konjugat pikleri. Mavi: konjugat çözeltisi, kırmızı: filgrastim çözeltisi. 31 69 4.17. Farklı sıcaklıklarda oluşan konjugatlara ait kromatogramlar. Mavi: 5 ˚C’deki konjugat çözeltisi, kırmızı: 25 ˚C’deki konjugat çözeltisi, yeşil: 40 ˚C’deki konjugat çözeltisi. 32 70 4.18. Farklı sıcaklıklarda oluşan konjugat ve referans filgrastim çözeltilerinin kromatogramları. Mavi: 5 ˚C’deki konjugat çözeltisi, kırmızı: 25 ˚C’deki konjuugat çözeltisi, yeşil: referans filgrastim çözeltisi. 33 71 4.19. Farklı sürelerde oluşan konjugat çözeltilerine ait pikler. Mavi: 24 saat bekletilmiş konjugat çözeltisi, kırmızı: 48 saat bekletilmiş konjugat çözeltisi, yeşil: 96 saat bekletilmiş konjugat çözeltisi, mor: 168 saat bekletilmiş konjugat çözeltisi. 34 71 4.20. Farklı enzim/filgrastim oranlarında oluşan konjugatlara ait kromatogramlar. Mavi- 1:1 enzim:filgrastim (a/a), kırmızı- 5:1 enzim:filgrastim (a/a). 35 72 4.21. Farklı polimer/filgrastim oranlarında oluşan konjugatların kromatogramı. Mavi- 4:1 polimer:filgrastim (a/a), kırmızı- 20:1 polimer:filgrastim (a/a). 36 73 4.22. Artan filgrastim miktarının konjugat oluşumuna etkisi. Mavi-5:1 enzim+polimer:filgrastim (a/a), kırmızı- 5:2 enzim+polimer:filgrastim (a/a). 37 73 4.23. Farklı pH’larda oluşan konjugat çözeltilerinin kromatogramları. Mavi: pH 4,5’teki konjugat çözeltisi, kırmızı: pH 5,5’teki konjugat çözeltisi, yeşil: pH 6,5’teki konjugat çözeltisi, mor: pH 7,5’teki konjugat çözeltisi. 38 74 4.24. Filgrastim, kitosan ve transglutaminazın ikili karışımlarının jel görüntüleri. 39 75 xviii 4.25. Filgrastim, kitosan hidrolizatı ve mikrobiyal transglutaminazın ikili ve üçlü karışımlarının jel görüntüleri. 40 76 4.26. Farklı kitosan türleri ile yapılan konjugasyon çalışmaları. 41 77 4.27. Kitosan hidrolizatları ile hazırlanan konjugatlar. 42 78 4.28. Farklı sıcaklıklarda yapılan konjugasyon çalışmaları. 43 79 4.29. Farklı sürelerde yapılan konjugasyon çalışmaları. 44 80 4.30. Farklı pH’larda yapılan konjugasyon çalışmaları. 45 81 4.31. Farklı pH’larda hazırlanan konjugatlar. 46 82 4.32. İndirgenmemiş ve indirgenmiş konjugat örnekleri. 47 83 4.33. Konjugatın izoelektrik noktasının tayini. 48 84 4.34. İndirgenmemiş ve indirgenmiş konjugat örneklerinin kromojenik tayini. 49 85 4.35. Konjugatın Western blot ile görüntülenmesi. 50 86 4.36. K1, K2, K3 fraksiyonlarının Western Blot görüntüleri. 51 87 4.37. Gradient tuz uygulamasına ait kromatogram. 52 88 4.38. 2 M NaCl ile gözlenen pik. 53 88 4.39. Konjugatın preparatif büyüklük dışlama kromatografisi ile ayırımı. 54 89 4.40. Filgrastimin IR spektrumu. 55 90 4.41. K1 fraksiyonunun IR spektrumu. 56 91 4.42. K2 fraksiyonunun IR spektrumu. 57 91 4.43. K3 fraksiyonunun IR spektrumu. 58 91 4.44. Filgrastimin kütle spektrumu. 59 92 4.45. Kitosan hidrolizatının kütle spektrumu. 60 92 4.46. K1 örneğinin kütle spektrumu. 61 92 4.47. K2 örneğinin kütle spektrumu. 62 93 4.48. K3 örneğinin kütle spektrumu. 63 93 4.49. Filgrastim ve konjugata ait DSC termogramları. 64 93 4.50. 20 kDa’luk membrandan diyalizlenen filgrastim yüzdeleri (ortalama±SS) (n=6). 65 94 4.51. Filgrastim ve konjugatın 48 saatteki ortalama proliferasyon değerleri ve standart sapmaları (tek yönlü) (n=6). 66 95 4.52. Filgrastim ve konjugatın 72 saatteki ortalama proliferasyon değerleri ve standart sapmaları (tek yönlü) (n=6). 67 96 xix 4.53. Filgrastim, konjugat ve filgrastim-polimer karışımının 72 saatteki ortalama proliferasyon değerleri değerleri ve standart sapmaları (çift yönlü) (n=6). 68 96 4.54. Kararlılık çalışmaları. 69 98 xx TABLOLAR Tablo Sayfa 2.1. Büyüme faktörleri ve etki ettikleri hücre tipleri (3). 5 2.2. Hematopoetik büyüme faktörleri ve etki ettikleri hücre tipleri (6). 6 2.3. Protein analizlerinde kullanılan kromatografik yöntemler (115, 116). 23 3.1. Kullanılan maddeler. 4 31 3.2. Kullanılan cihazlar.5 32 3.3. RP-HPLC yönteminde kullanılan hareketli faz oranları. 6 37 3.4. Farklı pH’larda kitosan-filgrastim çözeltilerinde kullanılan tampon miktarları.7 43 4.1. Filgrastimin kalibrasyon doğrusuna ait değerler (n=6). 8 57 4.2. Filgrastimin UV Spektroskopisi ile doğruluk denklemine ait veriler.9 58 4.3. Filgrastimin kalibrasyon doğrusunun özellikleri (n=6). 10 60 4.4. Doğru denklemine ait veriler (n=6). 11 61 4.5. Günler Arası Kesinlik ve Doğruluk Değerleri (n=4). 12 62 4.6. RP-HPLC Sistem Uygunluk Verileri (n=6). 13 63 4.7. Örneklerin IR frekansları (cm-1). 15 90 4.8. Konjugat ve filgrastimin paralel çizgi tayini ile karşılaştırılması.16 97 4.9. Konjugat ve filgrastim-polimerin paralel çizgi tayini ile karşılaştırılması.17 97 1 1. GİRİŞ Farmasötik Biyoteknoloji ürünü peptid-protein ilaçlar veya biyofarmasötikler 1982 yılında rekombinant insan insülininin Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) onayı alması ile insan sağlığına sunulmuş olup, bugün yüzlerce rekombinant protein ilaç daha önceleri tedavisi çok zor veya olanaksız olan hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır. Klinik çalışma aşamalarında olan yüzlerce biyoteknolojik ilaç, aşı ve tanı ürünleri ise sağlık alanına sürekli yeniliklerle sunulmakta ve ilaç alanında kimyasal ilaçlardan biyoteknolojik ilaçlara doğru hızlı ve büyük bir dönüşüm yaşanmaktadır. Rekombinant DNA teknolojisi ile üretilen peptid-protein yapıdaki ilaçlar artık birinci kuşak biyoteknoloji ürünleri olarak adlandırılmakta ve bu ilaçların in vivo-in vitro dayanıksızlık, uygulama yolunun hemen hemen tamamen parenteral olmasından kaynaklanan istenmeyen uygulama yolu, antijenik ve toksik yan etkiler gibi pek çok sorunu bulunmaktadır. Son yıllarda protein ilaçlara ait sorunların çözümüne yönelik olarak ikinci kuşak protein ilaçlar üzerinde çalışmalar yapılmakta, hatta ürünler geliştirilmekte ve tedaviye sunulmaktadır. Bu tez çalışmasında rekombinant filgrastimin ikinci kuşak yeni bir konjugat formunu geliştirmek üzere çalışmalar yapılması amaçlanmaktadır. İkinci kuşak protein ilaçlar; bölgeye özgü mutajenez, füzyon protein, kimyasal veya enzimatik modifikasyon gibi yöntemler uygulanarak geliştirilmektedir. Piyasada kimyasal yöntemlerle modifiye edilmiş proteinler bulunmaktadır. Son yıllarda enzimatik modifikasyon, kimyasal modifikasyondan daha az toksik ve çevreyle daha uyumlu bir seçenek olarak farmasötik biyoteknoloji alanına girmeye başlamıştır. Kullanılan enzimler arasında transglutaminazlar, sortazlar ve tirozinazlar öncelikle dikkat çekmektedir. Transglutaminazlar (TGase) protein substratlarını çapraz bağlayıcı özellikleri nedeniyle bilimsel ve endüstriyel alanlarda çok ilgi çekmektedir. Yiyecek endüstrisinde çok yaygın olarak uygulanan ve “et tutkalı” gibi adlarla da anılan transglutaminazların farmasötik biyoteknoloji alanındaki uygulamaları çok sınırlı ve yenidir. Bitki, hayvan ve bakteri kökenli çok değişik çeşitleri olan transglutaminazlar farklı substrat özgüllükleri nedeniyle 2 önemli bir uygulama potansiyeline sahiptir. Sağlık alanında kanamalarda, çölyak hastalığının tanısında, yara iyileşmesinde uygulamaları vardır. Transglutaminaz substrat özgüllüğü yüksek ve sıcaklığa dayanıklı bir enzim olduğundan besin biyoteknolojisinde en fazla kullanılan enzimlerden biridir. Son yıllarda mikrobiyal transglutaminazın filgrastim, eritropoetin, insan büyüme hormonu gibi bazı rekombinant ilaçların polimerlerle konjuge edilerek modifiye edilmesi amacıyla kullanılmasına ait çalışmalar yapılmaktadır. Mikrobiyal transglutaminaz ile proteinlerde bölgeye özgü polimer konjugasyonu yapılabilmektedir. Rekombinant insan granülosit koloni uyarıcı faktör (rh G-CSF) kemoterapi alan kanser hastalarında ortaya çıkan nötropeni tedavisinde kullanılmaktadır. Parenteral yoldan uygulanan filgrastim kandan hızla uzaklaşan ve yüksek dozda uygulanan bir proteindir. İlacın vücutta kalış süresini uzatmak üzere polietilen glikol ile konjuge edilmiş uzun etkili formu da mevcuttur. Ayrıca farklı polimerler ile hazırlanan nanopartikül ve mikropartikül formunda protein preparatları ile ilgili çalışmalar da yapılmaktadır. Bu tez çalışmasında biyoteknolojik yöntemlerle üretilmiş rekombinant insan G- CSF’in mikrobiyal transglutaminaz aracılığı ile daha önce bu yaklaşımla üzerinde çalışılmamış polisakkarit yapıda bir doğal polimer olan kitosan ile konjuge edilerek modifiye edilmesi üzerine çalışmalar yapılmıştır. Hasta uyuncu, toksik ve istenmeyen etkiler dikkate alınarak, dayanıklı ve uzatılmış etkili ikinci kuşak filgrastim formülasyonlarının geliştirilmesi ile ilgili çalışmalar doğrultusunda besin endüstrisinde yaygın olarak kullanılan ve toksik olmayan polimer ve enzimler yardımıyla yeni bir konjugat yapı oluşturulması hedeflenmiştir. Proteinler, transglutaminazlarla çapraz bağlanarak daha dayanıklı duruma getirilebilmektedir. Bu özellik gıda endüstrisinde hayvan ürünlerinin işlenmesinde sıklıkla kullanılmaktadır, ancak eczacılık alanında son yıllarda yapılan çok az sayıda çalışma ve patent bulunmaktadır. Bu çalışmaların hemen hemen tamamı sentetik ve inert bir polimer olan polietilen glikol kullanılarak yapılmıştır. Bu tez çalışması kapsamında birinci kuşak 3 rekombinant proteinlerle ilgili sorunların çözümüne yönelik çalışma konularından birisi olan enzimatik yolla protein-polimer konjugasyonu yöntemi ile protein yapıdaki bir etkin maddenin ikinci kuşak formunun geliştirilmesi için doğal ve toksik olmayan bir polimerin kullanılması hedeflenmiştir. Etkin madde olarak rh metG-CSF (filgrastim), enzim olarak mikrobiyal transglutaminaz, polimer olarak da polisakkarit yapıda ve daha önce bir protein ilaç ile enzimatik konjugasyonu çalışılmamış olan kitosan kullanılmıştır. Öncelikle konjugat oluşumunun başarılması hedeflenmiştir. Konjugat oluşumu farklı analiz yöntemleri ile gösterilmiştir. Oluşan konjugatlarda proteinin dayanıklılığı ve in vitro biyoetkinlik konjuge olmamış proteine göre karşılaştırılmıştır. 4 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Rekombinant DNA Teknolojisi ile Üretilen Proteinler Proteinler vücutta en dinamik ve değişken role sahip makromoleküllerdir. Biyokimyasal reaksiyonların katalizi, reseptörler ve mebranlardaki kanalların oluşumu, hücre içi ve dışı yapı iskelesinin oluşumu ve hücre, doku veya organlar arası molekül transferi gibi görevlerde yer alırlar. Küçük moleküllü kimyasal ilaçlara göre protein ilaçlar birçok faydaya sahiptir. Bunların en başında kimyasal moleküllerle başarılamayan tedavilerin protein yapılı ilaçlar ile başarılabilmesi yer almaktadır. Ayrıca, protein ilaçlarla sunulan tedavi, yüksek özgüllüğe sahip olduğundan normal biyolojik süreçlerle girişim ve ciddi yan etki riski yoktur. Vücutta doğal olarak üretilmekte olan proteinlerin ilaçları iyi tolere edilir. Aynı zamanda bu proteinlerin vücut tarafından üretilememesi yahut yetersiz üretilmesi durumunda tedavi için çözüm sağlar (1). Rekombinant DNA teknolojisi ile üretilmiş insan insülinin 1982 yılında FDA tarafından onay alması ile protein terapötikler insan hizmetine sunulmuş ve dünya ilaç pazarını yönlendirmiştir. Proteinlerin biyokimyasal ve biyofiziksel özelliklerinin değiştirilebilmesi sayesinde ilaç endüstrisinde klinik potansiyele sahip proteinler giderek artmaktadır (2). Protein ilaçların farklı etki mekanizmaları ve işlevleri vardır. Eksik veya anormal durumdaki proteinin yerine konması, var olan metabolik yolağın taklidi ya da yeni bir aktivite veya fonksiyon sağlanması rollerini üstlenen enzimatik ya da düzenleyici aktiviteye sahip ilaçlar birinci kuşak proteinlerdir. Enzimler, enzim inhibitörleri, immünoglobülinler, koloni stimüle edici faktörler, hormonlar, interferonlar ve kan faktörleri bu grupta yer alır. Taşıma ve hedefleme rollerini üstlenen proteinler de mevcuttur. Hedefleme ağırlıklı olarak monoklonal antikorlar vasıtasıyla gerçekleştirilir. Vücudu zararlı yabancı maddelerden koruyan, otoimmün bir hastalığı tedavi eden ya da kanseri tedavi eden protein aşılar da bir başka grubu oluşturmaktadır (1). 5 2.1.1. Rekombinant Büyüme Faktörleri Ökaryotik hücrelerin farklılaşma, büyüme ve bölünmelerini düzenleyen çeşitli faktörlerden en ön önemlisi büyüme faktörleridir. Polipeptid yapıda birçok büyüme faktörü tanımlanmıştır (Tablo 2.1). Büyüme faktörlerinin çoğu, birden farklı hücre tipi tarafından sentezlenir. Spesifik hücre yüzeyi reseptörlerine bağlanarak endokrin, parakrin veya otokrin etki gösterirler. İnterferonlar ve TNF gibi hücre çoğalmasını önleyen faktörler de mevcuttur. İnterlökinler, TGF-β ve koloni stimüle edici faktörler, sitokinler olarak sınıflandırılan rekombinant büyüme faktörleridir (3). Tablo 2.1. Büyüme faktörleri ve etki ettikleri hücre tipleri (3). Büyüme Faktörü Temel Hedef Hücreler İnterlökinler Çeşitli, başlıca bağışıklık ve enflamasyona aracılık eden hücreler İnterferon-γ Başlıca lenfositler ve bağışıklığa (ve enflamasyona) aracılık eden diğer hücreler Koloni stimüle edici faktörler Çoğunlukla hematopoetik hücreler Eritropoetin Eritrosit öncül hücreleri Trombopoetin Çoğunlukla megakaryositler Nörotropik faktörler Çeşitli, ama çoğunlukla nöronal hücre popülasyonları İnsülin Çeşitli İnsülin benzeri büyüme faktörleri Çeşitli doku tiplerinde bulunan farklı tipte hücreler Epidermal büyüme faktörü Çeşitli, epitel ve endotel hücreler ile fibroblastlar dahil Platelet kökenli büyüme faktörü Çeşitli, fibroblastlar, glial hücreler ve düz kas hücreleri dahil Fibroblast büyüme faktörleri Çeşitli, fibroblastlar, osteoblastlar ve kas endotel hücreleri dahil Transforme olan büyüme faktörleri-α Çeşitli Lösemi inhibitör faktör Çoğunlukla çeşitli hematopoetik hücreler 6 Vücudun taşıma ve bağışıklık sistemlerinin temeli olan kan hücrelerinin üretim ve olgunlaşma süreçleri hematopoez olarak adlandırılır. 1900’lü yılların başında hematopoezi kanda dolaşan faktörlerin yönettiği keşfedilmiştir. Yeni kan hücrelerinin büyüme ve yaşamaları için ortamda koloni stimüle edici faktörlerin yer alması gerekmektedir. Klinikte kullanılmakta olan hematopoetik büyüme faktörleri arasında granülosit koloni stimüle edici faktör (rh G-CSF – filgrastim, lenograstim, pegfilgrastim, lipegfilgrastim), granülosit makrofaj koloni stimüle edici faktör (rh GM-CSF – molgramostim, sargramostim), eritropoetin (rh EPO – epoetin alfa, epoetin beta, darbepoetin alfa), kök hücre faktörü (rh SCF - ancestim) ve interlökin 11 (rh IL-11 – oprelvekin) önemli bir yer tutmaktadır (4, 5). Hematopoetik büyüme faktörlerinin etki ettikleri hücre tipleri Tablo 2.2’de, kan hücrelerinin oluşumundaki görev yerleri ise Şekil 2.1’de gösterilmektedir. Tablo 2.2. Hematopoetik büyüme faktörleri ve etki ettikleri hücre tipleri (6). Hematopoetik Büyüme Faktörü Temel Hedef Hücreler G-CSF Adanmış granülosit öncül hücreleri GM-CSF Daha az olgunlaşmış myeloid öncül hücreleri ve makrofaj öncül hücreleri M-CSF Adanmış makrofaj öncül hücreleri EPO Eritrosit öncül hücreleri TPO Megakaryosit öncül hücreleri IL-3 Olgunlaşmamış myeloid öncül hücreleri (eritroid ve megakaryositik olanlar dahil) IL-6 Megakaryosit ve B-lenfosit öncül hücreleri SCF Pluripotent projenitör hücreler 7 Şekil 2.1. Hematopoetik büyüme faktörlerinin işlevleri (7). Rekombinant Granülosit Koloni Uyarıcı Faktör (rh G-CSF) İlk olarak 1980 yılında Burgess ve Metcalf (8) tarafından keşfedilen granülosit- makrofaj farklılaştırıcı faktör (GM-DF) daha sonra seçici olarak granülosit kolonilerinin Kendini yenileme Multipotent kök hücre Adanmış öncül hücreler Birincil projenitör hücreler Monositler Nötrofiller, eozinofiller, bazofiller M-CSF G-CSF, IL-5, SCF GM-CSF SCF, TPO 8 oluşumunu uyardığı anlaşıldığından Nicola ve ekibi (9) tarafından granülosit koloni uyarıcı faktör (G-CSF) olarak adlandırılmıştır. G-CSF genel olarak nötrofilik granülositlerin üretimini düzenleyen polipeptid yapıda bir büyüme faktörüdür. Vücudun savunma mekanizması, stres koşullarında granülosit üretimini 10 kata kadar artırabilir. G-CSF ise nötrofil üretiminde temel role sahip bir elemandır. Ayrıca, nötrofillerin ve projenitör hücrelerin vücutta dağılımını da kontrol eder (10). G-CSF endotelyum, monositler ve diğer bağışıklık hücreleri tarafından üretilip salınır (11). Pluripotent aktiviteye sahip insan hematopoetik koloni uyarıcı faktör genlerinin izole edilerek Escherichia coli’ye klonlanmasıyla 19,6 kDa molekül ağırlığına sahip O- glikozile protein rekombinant granülosit koloni uyarıcı faktör (rh G-CSF) üretilmiştir. Nötrofil proliferasyonunu, erken eritroid koloni ve karışık koloni oluşumunu, makrofaj ve granülosit farklılaşmasını desteklediği tespit edilmiştir (12). Daha sonra yapılan çalışmalarda G-CSF’in, hastaların belirli enfeksiyonlara karşı direnç göstermesinde, düşük sayıda veya bozuk granülosit varlığında nötrofil yanıtının geliştirilmesinde, kemoterapi, ışın tedavisi veya kemik iliği transplantasyonunda oluşan granülosit azalmasını engellemede rol oynadığı anlaşılmıştır (13). G-CSF, 174 amino asitten oluşan bir polipeptid olup, iki disülfid bağında dört sistein, 17. konumda serbest bir sistein ve 133. konumdaki treonin üzerinden O- glikozilasyon bölgesi içerir. G-CSF’in biyolojik aktivite göstermesi için glikozile olması şart değildir (14). Filgrastim (rh metG-CSF) Primer yapısı granülosit koloni uyarıcı faktörden N-terminale eklenmiş bir metiyonin amino asiti ile farklılaşan filgrastim (rh metG-CSF), glikozile değildir. Rekombinant DNA (rDNA) teknolojisi ile bakteri hücrelerinde üretilir (11). Sahip olduğu 175 amino asitten 104’ü dörtlü α-heliks yapacak şekilde katlanmış haldedir (15, 16). 9 Filgrastim iki disülfid bağı ile stabilize edilmektedir (Şekil 2.2) (17). Asidik pH’larda yüksek oranda stabil olmakla birlikte, yüksek pH değerlerinde de stabilitesini korumaktadır. Ancak pH 7,00’nin üzerinde saklanması önerilmemektedir (18). Şekil 2.2. Filgrastim molekülünün amino asit dizilimi (19). 1991 yılında kanser kemoterapisinde ortaya çıkan nötropeni ve ilgili enfeksiyonların tedavisinde kullanılmak üzere piyasaya sürülmüş olup (20), bugün myelosüpresif kemoterapi gören kanser hastalarında, indüksiyon ya da konsolidasyon kemoterapisi gören akut myeloid lösemi hastalarında, hematopoetik kök hücre transplantasyonunda, kemik iliği transplantasyonu yapılmış kanser hastalarında ve ağır kronik nötropeni vakalarında kullanılmaktadır (15). Ayrıca, amyotrofik lateral skleroz (motor nöron hastalığı, ALS) ve omurilik yaralanmalarında yetim ilaç statüsünde onaylıdır (21). Biyoteknoloji ürünü protein ilaçlar arasında kullanımı en fazla olan ilaçlardan birisidir. 10 Filgrastim günde bir kez deri altına, kas içerisine parveya damar içi uygulanır. Kandaki yarılanma ömrünün çok kısa olması, saklama sırasında immünojenisiteye neden olan agregatların oluşumu ve etkinlik için uygulanan yüksek dozlar nedeniyle ikinci kuşak formlarının geliştirilmesi için üzerinde pek çok çalışma yapılmaktadır. 2.2. İkinci Kuşak Protein İlaçlar Peptid-protein ilaçlarda etkinliği artırmak, eliminasyonu azaltmak, metabolizmayı değiştirmek, hedefe yönlendirmek, hedefte kalıcılığı uzatmak gibi farklı amaçlarla modifikasyonlar yapılabilmektedir. Günümüzde ikinci kuşak protein ilaçların modifikasyonu için bölgeye özgü mutajenez, füzyon protein, kimyasal ve enzimatik konjugasyonla modifikasyon gibi yöntemler kullanılmaktadır. Bu yöntemlerle yapılan çalışmalar sonucunda protein ilaçların farmakokinetik performansının ve biyodağılımının iyileştirilmesi hedeflenmektedir. En önemli stratejilerden biri serum yarı ömrünün uzatılmasıdır. 50 kDa ve daha küçük molekül ağırlığına sahip proteinler renal filtrasyon yoluyla kandan uzaklaşarak idrar ile atılır. Bu nedenle interleukin-2 (IL-2), interferon-α (IFNα) ve interferon-ß (IFNß) gibi düşük molekül ağırlığına sahip sitokinlerin yarı ömrü 5 saat veya daha da kısadır. Bu moleküllere büyük inert kimyasal gruplar veya ikinci bir protein ile füzyon yapılarak kanda kalış süreleri uzatılmaya çalışılmaktadır. Bilinen en yaygın kimyasal modifikasyon PEGilasyondur. PEG-interferon, PEG-filgrastim, PEG- adenozin deaminaz örnek PEGile protein ilaçlardır. İkinci bir proteinle füzyon amacıyla insan serum albümini ve antikorların Fc porsiyonları kullanılmaktadır. İnsan serum albümini ile büyütülmüş interferon (Albuferon) ve Fc porsiyonu ile büyütülmüş TNF (etanersept) örnek olarak verilebilir. Biyodağılımın iyileştirilmesi amacıyla da antikorlarla füzyon gerçekleştirilmektedir. Radyoaktif moleküllerle, sitotoksik proteinlerle, ilaçlarla ve sitokinlerle füzyon gerçekleştirilerek moleküllerin istenilen hücre tipine hedeflendirilmesi sağlanmaktadır. Füzyon sadece monoklonal antikorlar ile değil, aynı zamanda antikorların Fab kısmı, scFv kısmı ve bispesifik antikorlar ile de yapılabilir. Bunlara ek olarak bağırsaklarda yer alan transport sistemlerinden faydalanmak amacıyla da proteinlerle füzyon çalışmaları yapılmaktadır (22-25). 11 2.3. Protein-Polimer Konjugatları İlaçların polimerlerle konjugasyonu in vitro ve in vivo özelliklerinde değişikliklere yol açar. Çözünürlükte artış, hidrodinamik hacim artışı sayesinde azalan renal filtrasyon sonucu biyoyararlanımda iyileşme, enzimlerce proteinin parçalanmasına karşı koruma, agregasyon, immünojenisite ve antijenisitede azalma, hedeflemede artmış geçirgenlik ve tutulma etkisi gibi sonuçlar elde edilir (25-32). 1977 yılında monometoksi-PEG (mPEG) ve sığır serum albuminin konjugasyonu ile ilk protein-polimer konjugatı oluşturulmuştur. Hayvan modellerinde doğal proteine göre daha az immünojenik olduğu ve kanda kalış süresinin uzadığı tespit edilmiştir (33, 34). Protein-polimer konjugatlarının tarihsel gelişimi Şekil 2.3’te gösterilmektedir. Protein-polimer konjugatlarında en çok kullanılan polimer polietilen glikoldür. Bunun yanında Japonya Sağlık Bakanlığı’ndan ruhsat almış stiren-maleik asit kopolimeri ile yapılmış antitümör kromoprotein neokarzinostatin konjugatı (zinostatin stimalamer) mevcuttur (35). N-(2-hydroksipropil) metakrilamid (HPMA), polivinil prolidon (PVP), poli(2-oksazolinler), dekstran, poliglutamik asit (PGA) ve hidroksietil nişasta (HES) biyolojik aktiviteleri araştırılmış diğer polimerlerdir. Bu polimerler dallı, zwitter iyonik, yan zincir olarak tekli veya çiftli, dendritik ya da glikopolimer şeklinde konjuge olabilirler (25, 30, 36). Şekil 2.3. Protein-polimer konjugatlarının tarihsel gelişimi (36). Protein konjugasyonlarında iki farklı strateji uygulanmaktadır. Daha önceden oluşturulmuş polimerin proteinle konjugasyonu “Grafting to” yöntemi olarak 12 bilinmektedir. Üzerinde çok çalışılmış olan bu stratejinin en önemli basamağı iki makromolekülü bir araya getirecek bağlanma reaksiyonudur. Bu reaksiyondan yüksek derecede verim beklenir. Diğer bir konjugasyon yaklaşımı “Grafting from” olarak bilinen, monomerlerin proteinde yer alan başlangıç ajanından itibaren polimerleşmesini hedefleyen yöntemdir. Protein burada makrobaşlatıcı olarak görev alır. Bu yöntemin çalışabilmesi için polimerleşmenin başlayacağı başlangıç ajanın biyolojik moleküle yerleştirilmiş olması gerekmektedir. Bu işlemin uygulanabilmesi için kontrollü radikal polimerizasyon ile kimyasal konjugasyon yapılması şarttır. Bu yöntem sonucu elde edilen ürünler kolay saflaştırılıp karakterize edilebilirler (30, 36). 2.3.1. Kimyasal Konjugasyon Bir polimerin proteinle konjuge edilebilmesi için öncelikle polimerin aktive edilmesi gerekmektedir. Aktivasyon için polimerin bir veya iki ucunda fonksiyonel grup içeren türevleri geliştirilir. Fonksiyonel grup, bağlanacak proteindeki reaktif gruba göre değişmektedir. Proteinlerde en reaktif amino asitler lizin, sistein, histidin, arjinin, aspartik asit, glutamik asit, serin, treonin, tirozin, N-terminaldeki amino grup veya C-terminaldeki karboksilik asittir. İlk kimyasal konjugasyon çalışmaları polimer molekülünün fonksiyonel grubunun amin grubu taşıyan bir proteinle konjugasyonu şeklinde yapılmıştır. Proteinlerde genellikle iyi aktivite gösteren lizin aminoasitlerinin amin grubu bu amaca yönelik olarak kullanılır. Bu yöntemin yol açtığı diol kontaminasyonu, stabil olmayan bağlar, yan reaksiyonlar, düşük molekül ağırlıklı polimer kullanma zorunluluğu ve bağlanma bölgesindeki düşük özgüllük yeni kimyasal konjugasyon yöntemleri için arayışların sürdürülmesine neden olmuştur. Ancak yöntemlerin hepsinde sert çalışma koşulları ve protein yapısında değişiklik yapma gereklilikleri mevcuttur. Kovalan bağla elde edilen moleküllerin biyolojik aktiviteleri natif proteinlerden daha düşüktür (25, 29). Kontrollü radikal polimerizasyon kimyasal konjugasyon yöntemleri arasında en sık kullanılan tekniktir. Geçiş-metallerin katalizörlüğünde halojenlenmiş başlatıcı ile geri dönüşümlü redoks reaksiyonuna dayanan atom transfer radikal polimerizasyonu (ATRP) 13 ve zincir transfer ajanı ile geri dönüşümlü ekleme-fragmentasyon zincir transferi (RAFT) olarak bilinen kontrollü radikal polimerizasyonu bunun örnekleridir. Bu teknikler ile molekül ağırlığı dağılımı dar olan polimerler elde edilir (36). 2.3.2. Enzimatik Konjugasyon Organik sentezlerde yaygın olarak kullanılan biyokataliz yönteminde substratın ürüne tamamen dönüştürebilmesi ile yüksek etkinlik sağlanır. Stereo seçicilik, bölge seçiciliği ve kimyasal seçicilik özellikleri ve ılımlı reaksiyon koşulları nedeniyle endüstride önemli bir uygulamaya sahiptir (37). Ayrıca, proteinlerin kimyasal yollar ile erişilemeyen bölgelerine ulaşılarak polimerlerin bağlanabilmesi sağlanır (25). Eritropoetin, filgrastim ve insan büyüme hormonu gibi protein ilaçların modifiye edilerek dayanıklılığının artırılması ve uygulanabilirliğinin kolaylaştırılması için sortaz, tirozinaz ve transglutaminazlarla yapılan enzimatik konjugasyon çalışmaları çok yenidir ve üzerinde yapılmış çok az çalışma bulunmaktadır (38-48). Sortaz enzimi Gram pozitif bakterilerin hücre duvarındaki sortaz-penta-peptid motifine oligo-glisin içeren polipeptidlerin veya küçük moleküllerin bağlanmasını sağlar. Transpeptidazlar ailesinin bir üyesidir (45, 49). Tirozinazlar monofenollerin o-hidroksilasyonu ve devamında o- difenollerin o-kinonlara okside olmasını sağlayan iki işlevli bir enzimdir [EC 1.10.3.1]. O-kinonlar ise yüksek reaktiviteleri ile sistein ve lizinlerin amino ve sülfidril grupları ile reaksiyona girerek çapraz bağlanma sağlarlar (46). Enzimlerin bu özellikleri protein- polisakkarit konjugatlarının elde edilmesi için çalışmalar yapılmasına neden olmuştur (47, 50). Bölgeye Özgü Konjugasyon Polipeptidlerde yer alan çok sayıdaki fonksiyonel grup nedeniyle proteinlerin modern kimyasal biyoloji ile bölgeye özgü modifikasyonu çok zordur (51). Kimyasal konjugasyonda bağlanma bir dizi reaksiyon ile gerçekleşir ve ortamda reaktif grupların bulunması yeterlidir ve bölgeye özgülük mümkün değildir. Tektür molekül elde edilebilmek için reaktif bölgelerin bir inhibitör, substrat ya da ligand vasıtasıyla 14 maskelenmesi yönünde çalışmalar yapılmaktadır. Ancak burada sadece reaksiyona daha fazla yatkın olan kısımlar maskelenmekte, seçimli bir bölge maskelemesi yapılamamaktadır. Seçiciliği artırmak amacıyla mutajenez ile reaktif amino asitler yerine reaktif olmayan aminoasitlerin yerleştirilmesi yoluna gidilmiştir (30). Ancak bunu yaparken proteinin yapısı değişmekte, biyolojik aktivitede azalmalar meydana gelmektedir (52). Protein yapılarında yer alan reaktif grupların oksidasyonu veya disülfid bağlarının indirgenmesi ile de nispeten daha seçici bağlanmalar meydana gelmektedir. Bu sorunlar nedeniyle bölgeye özgü konjugasyon sadece substrata özgü reaksiyon gösteren enzimler ile gerçekleştirilebilmektedir (30, 36). Proteinlerde polimer zincirlerinin konjugasyonu için en reaktif gruplar lizinlerin ε-amino grupları ve polipeptid zincirinin N-terminalindeki amino asidin α-amino gruplarıdır. G-CSF’in konjugasyona açık grupları dört lizin (Lys 16, Lys 23, Lys 34, Lys 40) ve polipeptid zincirinin N-terminalindeki amino asidin serbest α-amino grubudur ve bu gruplar sulu çözeltide erişilebilir durumdadır. Transglutaminazlar polipeptid zincirlerindeki glutamin amino asitlerinin açil-akseptör γ-karboksamid gruplarına spesifik olarak etki ederler. G-CSF üzerindeki yaklaşık her 10 amino asitten biri glutamin olduğundan, polipeptid zinciri toplamda 17 glutamin artığına sahiptir. Ancak G-CSF’in üç boyutlu yapısı göz önünde bulundurulduğunda sadece bir kaçı enzim tarafından erişilebilir durumdadır. Bunlardan altı tanesine (70, 173, 131, 119, 90 ve 11) % 40 veya daha yüksek oranda erişilebilir. 20 kDa monometoksi-PEG-aminin mikrobiyal transglutaminaz ile met-G-CSF’e 135. glutamin artığından bölgeye özgü bağlandığı ve mono-konjuge protein elde edildiği gösterilmiştir (39). Ca++ gerekmeden etki gösteren mikrobiyal transglutaminaz ile PEG molekülleri filgrastime glutamin artığından bölgeye özgü olarak bağlanmıştır. Burada, transglutaminaz enziminin diğer glutamin artıklarına göre çok daha yüksek çözücü yüzey ulaşılabilirliğine sahip olan 135. konumda yer alan glutamin artığından bağlanma olduğu gösterilmiştir (Şekil 2.4) (39, 53, 54). 15 Şekil 2.4. metG-CSF’in 135. glutamin artığının moleküldeki yeri (54). 2.4. Polimerler 2.4.1. Polietilen Glikol (PEG) Doğrusal ya da dallı olarak sentezlenen farklı molekül ağırlıklarına sahip doğal bir polieter olan PEG’in suda ve birçok organik çözücüde çözünürlüğü yüksektir (Şekil 2.5). Farmasötik biyoteknoloji ve biyomühendislik alanlarında çok kullanılmaktadır. Bunun temel nedeni, sulu ortamda PEG’in diğer polimerleri uzaklaştırma yeteneğidir. Böylece proteinleri de uzaklaştırarak immünojenisite ve antijenisite göstermez. Aktif proteinlere ve hücre membranlarına zarar vermediği için toksik değildir (55, 56). Şekil 2.5. Polietilen glikolün kimyasal yapısı. 1970’lerden itibaren yaygın olarak kullanılmakta olan PEGilasyon yöntemi (30) biyolojik makromoleküllerin ve yüzeylerinin farmasötik ve biyoteknolojik amaçlarla PEG ile kovalan modifikasyonudur (29). Kovalan bağlanmış PEG diğer moleküllerin çözünürlüğünü artırır, proteinlerin immünojenisitesini azaltarak tolere edilirliğini artırır, böbreklerden süzülmeyi azaltır, yüzeyleri protein-itici hale getirir, elektroosmotik akışı değiştirir, moleküllerin hücre membranından geçişini sağlar ve farmakokinetiği değiştirir 16 (55). PEGilasyon yöntemleri olarak klasik PEGilasyon (serbest sisteinler ve N-terminal), köprü PEGilasyonu (disülfid bağları), enzimatik PEGilasyon (glutaminler ve C-terminali) ve glikoPEGilasyon (O- ve N-glikozilasyon bölgeleri veya glikoproteinlerdeki glikanlar) sayılabilir. Bu yöntemler ile bölgeye özgü PEGilasyon yapılarak tek bir izomer oluşturulabilir ve homojenlik artar (57). Ancak FDA tarafından onaylanmış protein-PEG konjugatlarının birçoğunda spesifik olmayan yöntemler kullanılmıştır (58). Bugün itibari ile 12 adet PEG’lenmiş molekül FDA tarafından onaylanmıştır (56, 59). 2.4.2. Kitosan 1859 yılında, doğal polimer olan kitinden yarı-sentetik yollarla elde edilen aminopolisakkarit kitosan, doğada en yaygın bulunan polimerlerdendir (60-62). Kimyasal ve mekanik modifikasyonlarla yeni özellik, fonksiyon ve uygulamalara olanak sağlayan kitosan, biyomedikal alan başta olmak üzere endüstride yaygın olarak kullanılmaktadır. Antimikrobiyal etkisi ve düşük immünojenitesinin yanında biyouyumlu/biyobozunur olması ve toksik olmaması farmasötik kullanımı için temel nedenlerdir (63). Kitosanın elde edilmesinde kullanılan kitin, kabuklular ve böcekler başta olmak üzere doğadaki birçok organizma tarafından üretilen bir biyopolimerdir. Bu yüksek miktardaki üretim ile kitin, selülozdan sonra dünyadaki en yaygın polimerdir (64). Kitosan ise bazı mikroorganizmalarda ve mayalarda doğal olarak bulunur (65). Besin endüstrisinde deniz ürünlerinin temel artıklarından olan karides kabuklarının ve diğer kabuklulardan, böceklerden ve mantarlardan elde edilen ham materyalin öğütülüp, elenmesi sonucu elde edilen toz malzeme öncelikle proteinlerinden arındırılır. Ardından minerallerinden de arındırılıp renksizleştirildikten sonra kitin elde edilir. Kitinin deasetilasyonu ile de kitosan elde edilir (Şekil 2.6) (66, 67). 17 Şekil 2.6. Kitosanın elde edilmesi (67). Kitosanın Kimyasal Yapısı Kitinin kısmi deasetilasyonu ile N-asetil-d-glukozamin’ler d-glukozamin’lere dönüşürler. β-(1–4)-bağlarıyla bağlanmış N-asetil-d-glukozamin ve d-glukozamin moleküllerinin kopolimerizasyonu sonucunda uzun polimer zinciri şeklinde kitosan oluşur. Kitosan kelimesi farklı molekül ağırlıklarına (50 kDa – 2000 kDa), viskoziteye (% 1 asetik asit içindeki % 1 kitosan <2000mPaS) ve asetilasyon derecesine (% 40 - % 98) sahip bir seri polimeri tanımlar (65). Kitosan, kitinin asetil gruplarının yüksek alkali koşullarda ve yüksek sıcaklıkta hidroliz edilmesiyle elde edilir. % 40 sodyum hidroksit içeren çözeltide 1-3 saat boyunca 120 ˚C’de muamele edilen kitinden, yaklaşık % 70 oranında deasetillenmiş kitosan elde 18 edilir (68). Uygulanan koşullar elde edilen polimerin molekül ağırlığı ve deasetilasyon derecesinin belirlenmesinde etkilidir (62). Yüksek molekül ağırlığına sahip kitosan nötr pH’da düşük çözünürlüğe ve yüksek viskoziteye sahip olduğundan gıda, kozmetik, tarım ve ilaç endüstrisinde kullanımı sınırlıdır (69). N-asetil-d-glukozamin ve d-glukozamin’lerin birbirine oranı kitosanın yapısında belirli değişikliklere yol açar. Bu yapısal değişiklikler, deasetilasyon derecesi ve molekül ağırlığı farklı kitosan türlerini oluşturur. Bu türlerin kimyasal ve biyolojik özellikleri birbirlerinden farklıdır (62). Çalışmalarda iki tip kitosan kullanılmaktadır. Birincisi % 75’ten daha fazla deasetile olan ve molekül ağırlığı hakkında net bilgi bulunmayan “karides kabuklarından elde edilen kitosan”dır. Diğeri ise “düşük molekül ağırlıklı kitosan” olarak bilinen ve % 1 asetik asit içerisindeki ağırlıkça % 1 çözeltisinin viskozitesi 20-300 cP, molekül ağırlığı 50 kDa - 190 kDa, deasetilasyon derecesi % 75’ten fazla olan kitosandır. Kitosan katyonik bir polimer olup, nötral ve bazik çözeltilerde serbest amino grupları nedeniyle çözünmez (70). Organik ve inorganik asitlerle tuz oluşturarak çözünür. Çözünme sonrası polimerdeki amin grupları protonlanarak polisakkaritin pozitif yüklenmesini sağlar. Deasetilasyon derecesi düşük olan kitosan (% 40) pH 9’a kadar, daha yüksek deasetilasyon derecesine sahip kitosan (% 85) ise ancak pH 6,5’e kadar çözünür (65). Kitosanın çözünürlüğü ve biyobozunurluğu polimer zincirindeki amino gruplarının protonlanmasına bağlıdır. pKa’sı 6,2-7 arasında değişen amin gruplarının pKa’sı 6,2’den düşük asitlerle protonlanmasıyla kitosan çözünür hale getirilir (71). Kitosanın çözünürlüğü, serbest amin grupları ve N-asetil gruplarının dağılımından etkilenmektedir (70). Kitosanın Biyolojik Etkileri Kitosan biyouyumlu, biyobozunur, toksik olmayan ve düşük immünojenisiteye sahip doğal bir biyopolimerdir (63). Kitosan ve kitosanın hidrolizasyonu ile elde edilen 19 kito-oligosakkaritler, antimikrobiyal (72-76), hipokolesterolemik (77, 78), antidiyabetik (79), antitümör (80, 81), nöroprotektif (82, 83), antienflamatuvar (84-86) ve daha birçok biyolojik etkileri nedeniyle kullanılmaktadır. Kitosanın toksik olmadığı çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir. İnsanlarda günlük 6,75 g kitosan uygulanması ile hiç bir yan etki görülmemiştir (87). FDA tarafından yara örtüsü olarak kullanımı onaylanmıştır (88). Formülasyonun ve uygulama yolunun kitosanın biyouyumluluğu üzerinde etkili olduğu bildirilmiştir (89). Hücre içine penetre olması istenen kitosanın molekül ağırlığının yaklaşık 5 kDa’dan düşük olması gerekmektedir (90). Kitosanın parçalanma yolları net olarak bilinmemekle birlikte tahmin edilen yolaklar Şekil 2.7’de gösterilmiştir (89). Şekil 2.7. Kitosanın parçalanma yolları (89). 20 Kitosanın Hidrolizatları Kitosanın çözünürlüğünün az olması nedeniyle çeşitli kimyasal modifikasyonlar denenmiş ve böylece uygulama alanı artırılmaya çalışılmıştır. Son zamanlarda kitosanın oligosakkaritleri üzerinde çalışılmaktadır. Kitosanın depolimerizasyonu ile elde edilen ürünlerin sudaki çözünürlüğü daha iyidir (91). Kitooligosakkaritler (chitooligosaccharides (COS)) enzimatik ya da asit hidrolizi ile kitin ve kitosandan elde edilen parçalanma ürünleridir. Enzimatik parçalama için selülaz, lipaz ve proteaz gibi enzimler kullanılmaktadır. Genel olarak elde edilen kitosan oligosakkaritlerinin molekül ağırlığı 10 kDa veya daha azdır (69). 2.5. Enzimler 2.5.1. Transglutaminaz Transglutaminaz enzimi protein yapıdaki substratlarda kovalan çapraz bağ yapabilen oksidatif γ-glutamil transferaz enzimlerindendir. Transglutaminazlar (EC 2.3.2.13), glutaminlerin γ-karboksamid grubundaki aminler ile primer aminlerden amonyum çıkışıyla bağ oluşumunu katalizler. Böylece peptidlere bağlı lizinler veya primer aminler ile (γ-glutamil) lizin veya poliamin çapraz bağları oluşur. Kovalan, stabil ve proteolize dirençli olan bağlar, kimyasal, enzimatik ve fiziksel degredasyona dayanıklı dokular oluşturur (92-94). Transglutaminazın çalışma mekanizması Şekil 2.8’te verilmiştir. Şekil 2.8. Transglutaminaz çalışma prensibi (92). 21 Peptide bağlı glutamin amino asitlerinin γ-karboksamid grubu açil donörü (amin akseptörü), lizin amino asitlerinin ɛ-amino grubu ise açil akseptörü (amin donörü) olarak davranır, ɛ-(γ-glutamil) lizin çapraz bağları oluşur (95) ve primer amin grubuna açil grubu eklenmiş olur (57). Ortamda primer amin bulunmaması durumunda, su açil akseptörü olarak davranır ve glutamin amino asitleri deamine olarak glutamik asite dönüşür (96) (Şekil 2.9). Şekil 2.9. (A) ɛ-(γ-glutamil) lizin çapraz bağ oluşumu (B) Küçük molekül ağırlıklı aminlerin proteine bağlanması (97). Transglutaminazlar, primer amin grubu içeren lizin dışındaki başka molekülleri de amin donörü olarak tanıyarak glutaminler ile çapraz bağ oluşturabilir, glutamin amino asitinin olduğu yerde sekansa dayalı seçicilik gösterirler (98, 99). Transglutaminaz balık, tavuk, bitki, memeli gibi ökaryortik canlılardan izole edilebildiği gibi çeşitli Streptomyces ve Bacillus bakteri türlerinden de elde edilir (100). Memelilerden elde edilen transglutaminazlar etkinlik için kalsiyum iyonuna ihtiyaç duyarken, çeşitli mikroorganizmalardan elde edilen transglutaminazlar kalsiyuma ihtiyaç duymadan aktivite gösterirler (96). 22 Transglutaminazlar üç farklı reaksiyonu katalizler. Şekil 2.10’da ayrıntılı olarak gösterildiği üzere, birincisi (a) açil transferi, ikincisi (b) glutamin ve lizin artıkları arasında oluşan çapraz bağlanma ve üçüncüsü (c) ise deamidasyon reaksiyonlarıdır (101). Şekil. 2.10. Transglutaminazın katalizlediği reaksiyonlar (101). Bir proteini polisakkarit yapıda bir biyopolimere transglutaminaz ile bağlamak için amin grubu içermesi gerekmektedir. PEG ile yapılan konjugasyon çalışmalarında da PEG molekülü amin gruplarına bağlanmaktadır. Gıda endüstrisinde transglutaminaz enziminin çeşitli amaçlarla kullanıldığı birçok çalışma bulunmaktadır (100-107). Besin maddeleriyle yapılan çalışmalarda proteinlerin çapraz bağlanmasıyla jelleşme, stabilite artışı, görünüş güzelleştirilmesi, dayanıklılık artışı gibi olumlu sonuçlar elde edilmektedir (93, 108). Kitosanın transglutaminaz aracılığı ile jelatinle oluşturduğu jeller yapay doku malzemesi olarak hazırlanmıştır (108). 2.6. Protein Analizinde Kullanılan Yöntemler Protein analizlerinde kullanılan farklı analitik teknikler mevcuttur. Kromatografik, spektroskopik, elektroforetik ve immünolojik yöntemler başta olmak üzere çeşitli analiz yöntemleri kullanılmaktadır (109, 110). 23 2.6.1. Kromatografik Yöntemler Rus botanikçi Mikhail S. Tswett, bitkilerden elde ettiği ekstraktları ayırmak için 1900’lü yılların başlarında yaptığı çalışma ile farklı renklerdeki (chroma) maddeleri bir kolondan sıvı yardımıyla geçirip ayırarak sıvı kromatografisinin temelini atmıştır (111, 112). Kromatografik yöntemler proteinlerin yük, büyüklük, çözünürlük, hidrofobiklik, hidrofiliklik ve affinite gibi özelliklerinden yararlanılarak ayrılması ve saflaştırılması amacıyla yaygın olarak kullanılmaktadır (Tablo 2.3). Bu analizler preparatif amaçla büyük hacimli kolonlarla yapılabileceği gibi, analitik amaçla daha iyi ayırımın sağlandığı küçük yüksek basınca dayanıklı kolonlarla da yapılabilmektedir. Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (High Pressure Liquid Chromatography) olarak adlandırılan sistem daha sonra daha yüksek basınçlarda çalışılabildiği için Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi (High Performance Liquid Chromatography) olarak adlandırılmıştır (112). İlaç geliştirme ve üretiminde kullanılan başlıca analitik yöntem Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisidir (113). 1300 bar basınca dayanıklı Ultra Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi (Ultra High Performance Liquid Chromatography, UHPLC) sistemleri ile analizler daha kısa sürede yapılabilmektedir (114). Tablo 2.3. Protein analizlerinde kullanılan kromatografik yöntemler (115, 116). Protein Özelliği Kromatografik Yöntem Yük İyon değiştirme (IEX), Kromatofokuslama Büyüklük Jel filtrasyon (GF, Büyüklük dışlama, SEC) Hidrofobisite Hidrofobik etkileşim (HIC), Ters faz (RPC) Hidrofilisite Hidrofilik etkileşim (HILIC) Biyotanıma (ligand özgüllüğü) Affinite (AC) Kromatografik sistemlerde ayırım, kolon dolgu materyali olan sabit faz ile etkileşime giren analiz edilecek maddenin kolonda tutulma süresine bağlıdır. Belirli bir akış hızında kolondan geçirilen hareketli faz ile kolondan çıkan fraksiyonlar belirli 24 aralıklarla toplanır ve analiz edilir. Protein analizlerinde kolonda kalma süresi ayırt edici özelliktir (116, 117). Şekil 2.11’de kromatografi işlemi şematize edilmiştir (118). Şekil 2.11. Kromatografik ayırım (118). İyon Değiştirme Kromatografisi ve Kromatofokuslama Proteinlerin karakterizasyonunda kullanılmakta olan İyon Değiştirme Kromatografisi, proteinlerin denatüre olmadan analizine olanak sağlar. Kolonun tipi, hareketli fazın pH’sı, tuz derişimi gibi faktörler analizin temel parametreleri olup, proteinin molekül ağırlığı arttıkça artan yük dağılım varyantlarına göre yöntem belirlenir (109). Kolon dolgu malzemesine bağlı iyonik gruplara zıt yüklü iyonların elektrostatik olarak bağlanması esasına dayanır. Analiz edilecek karışım kolona uygulandığında daha güçlü etkileşime giren madde kolona daha uzun süre tutulur (117). Kolona bağlı maddeler artan tuz gradyanı veya pH gradyanı uygulanarak ayrılır. Proteinlerin yük varyantlarının tayininde kullanılmaktadır (119). Proteinlerin izoelektrik noktalarına göre ayrımı ise kromatofokuslama olarak adlandırılır. Genellikle zayıf anyon değiştirici reçinelerle analiz gerçekleştirilir. Ayırım, pH gradyanı uygulanarak gerçekleştirilir (120). Kolon sabit fazla doldurulur Sürekli mobil faz akışı sağlanır Analiz edilecek maddeler kolona uygulanır Maddeler kolonda tutulur Farklı zamanlarda örnekler toplanır Maddeler kolondan farklı zamanlarda ayrılır 25 Jel Filtrasyon (Büyüklük Dışlama) Kromatografisi Bu yöntemde kolona uygulanan madde molekül büyüklüğüne göre kolondan ayrılır. Sabit faz farklı açıklıkta porlara sahiptir. Küçük moleküller bu porlara girerken büyük moleküller porların arasından ilerler. Bu nedenle kolondan önce büyük molekül ağırlıklı proteinler ayrılır. Porlara girerek hızı yavaşlayan küçük molekül ağırlıklı proteinler ise kolonu geç terk eder (Şekil 2.12) (117, 121, 122). Şekil 2.12. Jel Filtrasyon (Büyüklük Dışlama) Kromatografisi çalışma prensibi (117). Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi Yüklerinden arındırılmış hidrofobik gruplara sahip sabit faz ile proteinlerin hidrofobik etkileşimine dayanan kromatografi yöntemidir. Bu etkileşimler ortamdaki iyonik güç artırılarak (genellikle yüksek tuz derişimi ile) sağlanır. Hareketli fazın polaritesi veya iyonik gücü azaltılarak, ya da pH artırılarak moleküllerin kolondan ayrılması sağlanır (123). Daha önceleri preparatif amaçla kullanılan yöntem artık analitik amaçla da yaygın olarak kullanılmaktadır. Proteinler bu yöntemde denatüre olmadığı için analiz sonrası diğer ölçümlerde de kullanılabilmektedir (116). Sürekli mobil faz akışı sağlanır Büyük moleküller Küçük moleküller Kolon dolgu materyali 26 Ters faz Kromatografisi Ters faz kromatografisinde ayırım için kullanılan hidrofobik etkileşimler farklıdır. Sabit faz hidrofobik etkileşim kromatografisindekinden daha fazla hidrofobiktir. Yüksek etkileşimi döndürmek için polar olmayan, organik solvanların kullanılması gerekmektedir. Bu nedenle apolar ve denatüre edici ortamda çalışılmaktadır. Bu durum olumsuz görünse de ayırım koşulları değiştirilebilir ve yüksek duyarlılıkta ayırım sağlanır. İzokratik, gradyan ya da basamaklı hareketli faz uygulamaları ile ayırım sağlanabilir (123). HPLC analizlerinde bu ayırım yöntemi yaygın olarak kullanılmaktadır. Hidrofilik Etkileşim Kromatografisi Polar sabit faz ile etkileşimin organik solvan içeren hareketli faz ile gradyan uygulanarak ölçüldüğü kromatografik yöntemdir. Genellikle N-glikan içeren biyofarmasötiklerin analizinde kullanılmaktadır (116). Affinite Kromatografisi Antijen-antikor, enzim-substrat gibi özgül bağlanma özelliğine dayanarak kolonda tutulma sağlayan bu kromatografik yöntem, genellikle proteinlerin saflaştırılmasında kullanılmakta ve yüksek saflıkta ürün elde edilmektedir (124, 125). 2.6.2. Spektroskopik Yöntemler 19. yüzyılda sadece görünür, UV ve IR ışığın maddeler tarafından absorbsiyonu, emisyonu ve saçılmasına dayanan spektroskopik analizler, sonrasında elektromanyetik radyasyon, X-ışınları, mikrodalga ve enerjik partiküllerin (elektron ve iyonlar) de maddeler üzerindeki etkilerini inceleyecek şekilde gelişmiştir (126). Translasyon sonrası modifikasyonların, proteinlerin ileri derece üç boyutlu yapılarının (ikincil, üçüncül, dördüncül) ve agregatlarının analizinde spektroskopik yöntemler yaygın olarak kullanılmaktadır (127-130). 27 Infrared Spektroskopisi Proteinlerin yapısal konformasyonlarının belirlenmesinde en sık kullanılan yöntemlerden biri Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi’dir (FTIR) (128, 130, 131). Proteinlerin α-heliks ve β-yaprak ikincil yapıları ayırt edici sinyaller verir ve farklı uzunluklardaki α-heliksler farklı bantlar verir. FTIR ile peptid bağlarının titreşimleri de (Amid-I, Amid-II ve Amid-III absorbsiyon bantları) ölçülür. Amid-I bantları (1600–1700 cm-1) proteinin genel konformasyonel yapısı hakkında fikir verir (131). FTIR, sekonder yapıların aydınlatılmasının yanı sıra işlemden kaynaklanan safsızlıkların (tampon bileşenleri, deterjanlar vb.) tayini ve agregat analizi için de kullanılmaktadır (132). Nükleer Manyetik Rezonsans Spektroskopisi Elementlerin çekirdeklerindeki spin hareketlerinin oluşturduğu manyetik rezonansı ölçen NMR spektroskopisi proteinlerin ileri derece yapılarının aydınlatılmasında, translasyon sonrası modifikasyonların karşılaştırılmasında ve safsızlık tayininde kullanılır (127). Kütle Spektroskopisi Serbest gaz iyonları oluşturulup ardından yüksek vakum altında manyetik ve elektrik alan uygulanarak kütle/yük oranlarının elde edildiği spektroskopik yöntemdir. Proteinlerin molekül ağırlığının tayininde, translasyon sonrası modifikasyonların analizinde, supramoleküler biyopolimerlerin etkileşim analizlerinde ve biyomolekül tanıma işlemlerinde kullanılmaktadır (25). Molekül ağırlığı 100 kDa’nun üzerindeki biyomoleküllerin kütle tayini Elektrosprey İyonizasyon (ESI-MS) ve Matriks ile Desteklenmiş Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon (MALDI-MS) teknikleri ile yapılabilmektedir (133). Molekül ağırlığı tayininde % 0,01 hassasiyet ile ESI cihazlarından kuadripol spektrometreler tercih edilmektedir (134). Hidrojen/Doteryum Değişim Kütle Spektroskopisi (Hydrogen Deuterium Exchange Mass Spectrometry, 28 H/DX-MS) ile proteinlerin ileri derece yapıları yüksek duyarlılıkta aydınlatılabilmektedir (128). Dairesel Dikroizm (Circular Dichroism) Spektroskopisi Dairesel polarize olmuş ışığın optik olarak aktif veya kiral merkez içeren bir örnekten geçerken sola ve sağa doğru verdikleri absorpsiyonun farkını ölçen spektroskopik yöntemdir (135). Moleküllerin konformasyon analizinde kullanılır (136). Proteinlerin ikincil ve üçüncül yapılarının analizi için en yaygın kullanılan tekniklerden biridir (128). 2.6.3. Elektroforetik Yöntemler Elektrik akımı etkisiyle çözelti içindeki partiküllerin hareketi elektroforez olarak tanımlanmaktadır (137). Tiselius (138) ilk olarak proteinlerin elektroforetik ortamlardaki davranışlarını incelemiş, kolloidal çözeltilerin ayrılmasında kullanılmak üzere bir aparat oluşturmuş, daha sonra geliştirilen çeşitli elektroforez yöntemleri proteinlerin farklı ortamlardan izolasyon ve karakterizasyonunu incelemek için kullanılmıştır. Akrilamid moleküllerinin bir tabaka halinde polimerleştirilmesi ile proteinlerin hareket etmesinin sağlandığı poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) yöntemi büyüklük, konformasyon ve net yüke dayalı ayırım sağlar (139). Bu yöntemin kapiller içersinde uygulandığı şekli ise kapiller elektroforezdir. Daha otomatize, daha ayırt edici ve yüksek verim ile analiz sağlanabilmektedir (116, 140). Protein katlanma değişikliklerinin ve konformasyonel farklılıkların tayinini sağladığı için biyomoleküllerin fiziksel stabilitesinin analizinde kullanılmaktadır (140). Güç kaynağını, örnek alanını ve dedektörü minyatür bir çip üzerinde taşıyan, yüksek verimle analize olanak sağlayan çok kanallı minik kapiller elektroforez sistemleri olan mikroçip elektroforezler de ilaç analizlerinde kullanılmaktadır (141). Kapiller ve mikroçip elektroforez sistemlerinin düşük miktar örnek gereksinimi, yüksek duyarlılık, kısa analiz süresi, tam otomasyon ve gerçek zamanlı ölçüm gibi üstünlükleri vardır (142). 29 Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi İlk olarak Laemmli’nin tanımladığı sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren yöntemle proteinlerin sadece molekül ağırlıklarına göre ayırım sağlanır. Anyonik deterjan SDS ve indirgeyici ajan 2-merkaptoetanol vasıtasıyla denatüre edilen proteinler negatif yüklü doğrusal yapıya dönüşür ve elektroforetik sistemde sadece molekül büyüklüklerinin etkisiyle ayırılırlar (143). İzoelektrik Odaklama Amfolitler ve elektrik akımı varlığında gradyan bir pH geçişi sağlanan ortamda, yüksek pH değerlerinde negatif yüklenen proteinlerin net yüklerinin 0 olduğu pH değerine (izoelektrik noktalarına) doğru göç etmesine ve orada asılı kalmalarına dayanan, yüklü proteinlerin izoelektrik noktalarına göre ayırımını sağlayan yöntemdir (144). Protein yapılarının ve parçalanma ürünlerinin karakterizasyonu ve stabilite çalışmalarında birincil analiz yöntemidir (119). 2.6.4. Diğer Yöntemler Diferansiyel Taramalı Kalorimetre Sıcaklık değişimleri ile oluşan ısı kaynaklı dönüşümleri ve maddelerin ısı kapasitelerini ölçme yöntemidir. Proteinlerde termodinamik stabilite denge noktaları, katlanma mekanizmaları, ligand bağlanması, kristal oluşumu ve konformasyonel yapı hakkında fikir verir (128, 145). Yukarıda derlenen yöntemler proteinlerin yapı analizinde kullanılan temel yöntemlerdir. Bu yöntemler proteinlerin birincil, ikincil, üçüncül ve dördüncül yapılarının aydınlatılmasında ve fonksiyonları hakkında fikir verir. Analizler tek başlarına veya sıralı olarak yapılabilir. LC–NMR–MS, CE-MS, CE-LC, LC-MS-MS gibi analizler ile protein daha ayrıntılı olarak karakterize edilir. 30 2.7. Filgrastimin Biyotayini Filgrastimin potens tayini için Avrupa Farmakopesi’nde bir hücre kültürü testi önerilmiştir. Bu testte Uluslararası Standart filgrastim referans alınarak eşit dilüsyonlarda hazırlanan filgrastim çözeltisinin potensinin P=0,95 güven aralığında referansa göre % 80’den az ve % 125’ten fazla olmadığının paralel çizgi testi ile gösterilmesi önerilmektedir. Bu analiz için NFS-60 hücre hattının (ATCC No. CRL-1838) kullanılması, kuyucuklara 35.000 hücre konulması, analiz esnasında 0,1 mM 2- mercaptoetanolden kullanılması, 1,56-800 UI/mL derişim aralığında çalışılması ve 44-48 saat sonrasında tetrazolyum tuzlarından MTS ile boyama yapılarak ölçümün tamamlanması önerilmektedir. Avrupa Farmakopesi’nde ATCC No. CRL-1838 koduyla belirtilmiş hücre hattı M- NFS-60 olarak özelleşmiş hücre hattıdır. NFS-60 hücrelerinin IL-3, GM-CSF, G-CSF ve eritropoetine yanıt verdiği bilinmektedir (146). M-NFS-60 hücreleri ise, M-CSF ve IL-3’e güçlü, G-CSF’e ise zayıf yanıt veren bir alt hattır (147). Bu hattın G-CSF’e verdiği yanıtın optimize edilmesi amacıyla yapılan bir çalışmada, 0,78-25 UI/mL G-CSF derişim aralığında, kuyuda 35.000 hücre varken ve 72 saatlik inkübasyon süresinde en iyi sonuçların alındığı bildirilmiştir (148). Dünya Sağlık Örgütü tarafından PEG-G-CSF için Uluslarası Standart oluşturma çalışmasına ait WHO/BS/2013.2218 sayılı raporda farklı laboratuvarlara farklı koşullarda çalışma izni verilmiş, biyotayin koşulları açıklanmıştır. Proliferasyon testleri NFS-60 ve M-NFS-60 hücre hatları ile yapılmakta ve 24-48 saat sonra hücre sayısındaki artışın lüminesans (Cell-titer Glo), floresans (Alamar mavisi), radyoaktif (3H Timidin) ve/veya kolorimetrik (MTS, MTT, Cell Titer96 Aqueous One-MTS, WST-1) yöntemlerle tayinine dayanmaktadır (149, 150). 31 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Kullanılan Maddeler ve Cihazlar Tez çalışması kapsamında kullanılan maddeler Tablo 3.1’de, cihazlar ise Tablo 3.2’de yer almaktadır. Tablo 3.1. Kullanılan maddeler. 4 Kullanılan Maddeler Marka-Ülke Akrilamid Sigma Aldrich-ABD Amonyum bikarbonat Fluka Chemie-İsviçre Amonyum persülfat Sigma Aldrich-ABD Asetonitril Sigma Aldrich-ABD Bromfenol mavisi Merck-Almanya CellTiter 96 (MTS-PMS kiti) Promega-ABD Clarity ECL (iyileştirilmiş luminol bazlı kemilüminesans) substrat kiti BioRad-ABD CN/DAB (4-kloro-1-naftolol/3,3´-diaminobenzidin, tetrahidroklorür) substrat kiti Pierce-ABD Coomassie Brilliant Blue R-250 Sigma Aldrich-ABD Crocein Scarlet Sigma Aldrich-ABD Disodyum hidrojen fosfat Merck-Almanya DMSO Sigma Aldrich-ABD Düşük molekül ağırlıklı kitosan Sigma Aldrich-ABD ECL (iyileştirilmiş luminol bazlı kemilüminesans) substrat kiti Thermo Scientific-ABD Etanol Sigma Aldrich-ABD Fetal bovin serumu Biowest-Fransa Filgrastim (rhG-CSF) Arven İlaç-Türkiye Float-A-Lyzer G2 Sigma Aldrich-ABD Fosforik asit Sigma Aldrich-ABD Glasiyal asetik asit Sigma Aldrich-ABD Gliserol Merck-Almanya Glisin AppliChem-Almanya Hazır IEF jel BioRad-ABD Hidroklorik asit Merck-Almanya HRP konjuge anti tavşan keçi IgG sekonder antikoru Santa Cruz-ABD İzopropanol Sigma Aldrich-ABD 32 Karides kabuklarından kitosan Sigma Aldrich-ABD Kobay transglutaminazı Sigma Aldrich-ABD Metanol Sigma Aldrich-ABD Mikrobiyal transglutaminaz (Activa WM) Ajinomoto-Japonya Mini UNOsphere S kolon BioRad-ABD MTT Sigma Aldrich-ABD Nitroselüloz membran BioRad-ABD N'N'-bis-metilen-akrilamid Sigma Aldrich-ABD Polisorbat 20 Sigma Aldrich-ABD Polisorbat 80 Merck-Almanya Potasyum dihidrojen fosfat Riedel-de Haen- Almanya Potasyum klorür Merck-Almanya RP X-OMAT LO Sabitleme ve Durdurma Banyo Çözeltileri Kodak-ABD RPMI-1640 besiyeri Lonza-İsviçre Sephacryl S-100 HR Sigma Aldrich-ABD Sığır serum albumini Santa Cruz-ABD Sodyum asetat Sigma Aldrich-ABD Sodyum dodesil sülfat Sigma Aldrich-ABD Sodyum hidroksit Merck-Almanya Sodyum klorür Merck-Almanya Sorbitol Sigma Aldrich-ABD Tavşan poliklonal anti G-CSF primer antikoru Abcam-Birleşik Krallık TEMED Sigma Aldrich-ABD Trifloroasetik asit Merck-Almanya Tris bazı AppliChem-Almanya X-ray filmi Kodak-ABD β-merkaptoetanol Riedel-de Haen- Almanya Tablo 3.2. Kullanılan cihazlar.5 Kullanılan Cihazlar Marka-Model Kurum Çalkalayıcı Labnet Orbit 1000 Farmasötik Biyoteknoloji Araştırma Laboratuarı Çalkalayıcı Lab-Line Çalkalayıcı (stand) Farmasötik Biyoteknoloji Araştırma Laboratuarı Güç Kaynağı Bio-Rad PowerPac Basic Farmasötik Biyoteknoloji Araştırma Laboratuarı 33 Güç Kaynağı Thermo EC250-90 Farmasötik Biyoteknoloji Araştırma Laboratuarı Jel Elektroforez Sistemi Bio-Rad Mini-Protean Tetracell Farmasötik Biyoteknoloji Araştırma Laboratuarı Manyetik Karıştırıcı Lab-Line Pyro-Magnestir Farmasötik Biyoteknoloji Araştırma Laboratuarı Manyetik Karıştırıcı Isotex Magnetic Strirrer SH- 4C Farmasötik Biyoteknoloji Araştırma Laboratuarı NanoDrop Spektrometre Thermo Scientific 2000c Farmasötik Biyoteknoloji Araştırma Laboratuarı pH ölçer Sartorius Professional Meter PP20 Farmasötik Biyoteknoloji Araştırma Laboratuarı Santrifüj Hettich EBA12 Farmasötik Biyoteknoloji Araştırma Laboratuarı Su banyosu Şimşek Laborteknik Farmasötik Biyoteknoloji Araştırma Laboratuarı Hassas Terazi Shimadzub AX200 Farmasötik Biyoteknoloji Araştırma Laboratuarı Hassas Terazi Sartorius BP 121S Farmasötik Biyoteknoloji Araştırma Laboratuarı Vorteks Velp Scientifica Farmasötik Biyoteknoloji Araştırma Laboratuarı UV Spektrometre Agilent 8453 Analitik Kimya Araştırma Laboratuarı Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi Thermo Spectra System SCM1000, P200, AS3000, UV6000LP Analitik Kimya Araştırma Laboratuarı Soğutmalı Santrifüj Hettich Zentrifugen Universal 32 R Biyokimya Araştırma Laboratuarı FTIR Perkin Elmer Spectrum BX Farmasötik Kimya Araştırma Laboratuvarı Elisa okuyucu VersaMax, Molecular Devices Co. Farmasötik Teknoloji Araştırma Laboratuvarı Liyofilizatör Labconco FreeZone 4.5 Plus Farmasötik Teknoloji Araştırma Laboratuvarı İnkübatör Sanyo Farmasötik Teknoloji Hücre Kültürü Laboratuvarı Laminar Hava Akımlı Kabin Faster BHG 2004, Class 2 Farmasötik Teknoloji Hücre Kültürü Laboratuvarı Mikroskop Leica DM IL LED Farmasötik Teknoloji Hücre Kültürü Laboratuvarı 34 DSC TA Instruments Q100 İlaç ve Kozmetik Ar-Ge ve Kalite Kontrol Laboratuvarı (HÜNİKAL) Orta Basınçlı Kromtaografi Sistemi BioRad NGC 10 İlaç ve Kozmetik Ar-Ge ve Kalite Kontrol Laboratuvarı (HÜNİKAL) Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi Agilent 1100 İlaç ve Kozmetik Ar-Ge ve Kalite Kontrol Laboratuvarı (HÜNİKAL) Kütle Spektrometresi Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS Sem Laboratuar Cihazları Laboratuarı Soğutmalı Santrifüj Eppendorf Centrifuge 5430 R Temel Bilimler Araştırma Laboratuarı 3.2. Filgrastimin Fizikokimyasal Özellikleri 3.2.1. Filgrastim Çözeltisinin Hazırlanması Çalışmalarda filgrastimin 0,56 mg/mL ve 0,62 mg/mL derişimdeki stok çözeltileri kullanılmıştır. Çözelti 10 mM pH 4,0 sodyum asetat tamponu içerisinde % 5 oranında sorbitol ve % 0,004 oranında polisorbat 80 içermektedir (17). Çözeltileri hazırlamak için 10 mM pH 4,0 sodyum asetat tamponu kullanılarak seyreltmeler yapılmıştır. 3.2.2. Filgrastimin UV Spektroskopik Analizi Filgrastimin UV spektroskopisi ile analizleri Thermo Scientific NanoDrop 2000c UV spektrofotmetresi kullanılarak yapılmıştır. Filgrastimin 0,56 mg/mL derişimdeki stok çözeltisi 10 mM pH 4,0 sodyum asetat tamponu ile seyreltilerek 0,22-56 µg/mL (n=6) aralığında 14 farklı derişimde çözeltiler hazırlanmıştır. Bu çözeltilerden 600 µL hacminde örnekler alınarak Nanodrop spektrofotometreye küvet ile uygulanmış ve absorbansları 215 nm’de ölçülmüştür. 3.2.3. Filgrastimin HPLC ile Analizi Filgrastim konjugatlarının oluşup oluşmadığını belirlemek üzere kullanılan yöntemlerden birisi HPLC yöntemidir. 35 Filgrastimin HPLC ile analizi için Avrupa Farmakopesi 6.3 (European Pharmacopoeia) (151) tarafından iki yöntem önerilmiştir. Molekül ağırlığı filgrastimden büyük safsızlıkların tayini için SE-HPLC (Büyüklük Dışlama - Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi) yöntemi, ilgili proteinlerin tayini için ise RP-HPLC (Ters Faz - Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi) yöntemi verilmiştir. SE-HPLC yönteminde; 300 mm uzunluğunda ve 7,8 mm çapında, 5 µ partikül büyüklüğüne sahip hidrofilik silika jel kolon kullanılır. Molekül ağırlığı 10.000 ila 500.000 arasında olan globüler proteinlerin ayrılması için kolon 30 ˚C’ye ısıtıldıktan sonra, 0,5 mL/dk hızda 50 mM pH 7,0 Amonyum Bikarbonat tamponu hareketli faz olarak geçirilir, 100 mM pH 4,0 Sodyum Asetat tamponunda 0,4 mg/mL’ye seyreltilmiş test ve referans filgrastim çözeltileri 20 µL hacimde enjekte edilerek 215 nm’de ölçümler yapılır. Yöntemin amacı molekül ağırlığı filgrastimden büyük varyantların saptanmasıdır. Aggregatlar, filgrastim oligomerleri (2 belirgin tipte), filgrastim dimerleri ve filgrastim monomerleri bu şekilde belirlenir ve safsızlıkların % 2’den fazla olması istenmez. RP-HPLC yönteminde; 150 mm uzunluğunda ve 4,6 mm çapında, 200 Å gözenek büyüklüğüne sahip oktadesil silika (C18) jel kolonu 65 ˚C’ye ısıtılır ve 1 mL/dk hızda gradyan hareketli faz geçirilir. Hareketli faz A: Trifloroasetik Asit (TFA) : Asetonitril (ACN) : Su = 1 : 499 : 500 (hacmen) ve Hareketli faz B: TFA : ACN : Su = 1 : 950 : 49 (hacmen) oranında kullanılır. Hareketli faz için B % 8 - % 100 olacak şekilde gradyan uygulanır. 0,1 mg/mL polisorbat 80 ve 50 mg/mL sorbitol içeren 100 mM pH 4,0 sodyum Asetat tamponunda 0,3 mg/mL’ye seyreltilmiş test filgrastim çözeltisi ve bu çözeltinin hidrojen peroksit ve metiyonin ile muamele edilmesiyle elde edilmiş referans çözeltisi 50 µL hacimde enjekte edilir ve 215 nm’de ölçümler yapılır. Yöntemin amacı ilgili proteinlerin tayinidir. Okside filgrastim tipleri (2 belirgin tipte) ve referans filgrastim tespit edilir. Safsızlıkların tek tek % 2, toplamda ise % 3,5’tan fazla olması istenmez. Filgrastim ile konjugat oluşumunu tayin etmek için öncelikle Avrupa Farmakopesi 6.3’te yer alan RP-HPLC yöntemi seçilmiştir. Ancak bu yöntemde düşük derişimlerde 36 ölçüm yapılamamıştır. Tezde konjugasyon çalışmalarında düşük derişimlerdeki örnekler ile çalışılarak, konjuge olan/olmayan filgrastim miktarı tayin edileceğinden uygun bir yöntem geliştirilmesi gerekmiştir. Yöntem ayrıntıları Ters-Faz HPLC kromatografisi ile analiz bölümünde verilmiştir. SE-HPLC çalışmalarında önce 300 mm uzunluğunda, 7,8 mm çapında, 5 µ partikül büyüklüğüne sahip ve molekül ağırlığı 10.000 ila 500.000 arasında olan proteinlerin ayrılmasında kullanılan TSKgel® G3000SWXL HPLC kolonu kullanılmıştır. Ancak, ayrım daha iyi olabileceği için ek olarak molekül ağırlığı 5.000 ila 150.000 arasında olan globüler proteinlerin ayrılmasında kullanılan TSKgel® G2000SWXL HPLC kolonu ile de çalışmalar yapılmıştır. Ters-Faz HPLC kromatografisi ile Analiz Sistem ve Koşullar İlaç çalışmalarında sık kullanılan ve Avrupa Farmakopesi 6.3’te verilen oktadesil silika (C18) jel kolonları kullanılmıştır. Çeşitli uzunluklarda (100 mm, 150 mm ve 250 mm), çeşitli çaplarda (4 mm ve 4,6 mm), farklı partikül büyüklüklerine sahip (3,5 µ ve 5 µ) kolonlar denenmiş ve 100 mm uzunluğunda 4,6 mm çapında, 130 Å gözenek ve 3,5 µ partikül büyüklüğüne sahip XBridge model kolonun kullanılmasına karar verilmiştir. Tez çalışmaları sırasında ön çalışmalarda 65 ˚C’de elde edilen sonuçların oda sıcaklığında elde edilen sonuçlardan daha tekrarlanabilir olduğu görüldüğünden deneyler 65 ˚C’ye ısıtılmış kolon ile yapılmıştır. Filgrastimin belirgin pik gösterdiği 215 nm’de ölçümler yapılmıştır. Deneylerde Hareketli faz A: % 0,1 TFA, Su (h/h) ve Hareketli faz B: % 0,1 TFA, ACN (h/h) kullanılmıştır. 37 Çalışmalarda, Avrupa Farmakopesi 6.3 yönteminde verilen 1 mL/dk hızda farklı gradyan ve izokratik oranları kullanılmış ve Tablo 3.3’de verilen oranlar en uygun bulunmuştur. Tablo 3.3. RP-HPLC yönteminde kullanılan hareketli faz oranları. 6 Zaman (dk) Hareketli faz A (% hacim) Hareketli faz B (% hacim) 0 → 10 50 → 30 50 → 70 10 → 10,1 30 → 50 70 → 50 10,1 → 15 50 50 Ön çalışmalar sonucunda, 100 mm uzunluğunda, 4,6 mm çapında, 130 Å gözenek büyüklüğüne ve 3,5 µ partikül büyüklüğüne sahip oktadesilsilil silika (C18) jel kolonunun 65 ˚C’ye ısıtılarak kullanıldığı, 1 mL/dk akış hızında gradyan hareketli faz ile [Hareketli faz A: % 0,1 TFA, Su (h/h) ve Hareketli faz B: % 0,1 TFA, ACN (h/h), % 50→ % 70] 215 nm’de ölçüm yapılan koşulların en uygun olduğu saptanmıştır. Filgrastimin alıkonma zamanı 6,4 dk, analiz süresi ise 15 dk olarak gözlenmiştir. Stok ve Standart Çözeltiler Örneklerin analizi referans standart ile karşılaştırılarak yapılmıştır. Filgrastim stok çözeltisi, referans standart olarak kabul edilmiştir. 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 70, 140 ve 280 µg/mL derişimlerdeki örnekler ile analizler gerçekleştirilmiştir. Yöntemin Validasyonu Özgünlük Geliştirilen analitik yöntem ile filgrastimin, diğer ortam bileşenlerinden ayrı olarak ölçülebilme yeteneğini gösterebilmek için özgünlük testleri yapılmıştır. Bunun için düşük molekül ağırlıklı kitosan hidrolizatı, mikrobiyal transglutaminaz ve filgrastimin pH 38 5,5’e ayarlanmış çözelti içinde kromatogramları alınmış ve alıkonma zamanları karşılaştırılmıştır. Doğrusallık 10-280 µg/mL (n=2) ve 10-50 µg/mL (n=6) derişim aralıklarında doğrusallık çalışmaları yapılmıştır. Yöntem 10-280 µg/mL derişim aralığında valide edilmiş, çalışma aralığı 10-50 µg/mL seçilmiştir. Doğruluk ve Kesinlik Geliştirilen analitik yöntem ile elde edilen sonuçların gerçek değere yakınlığının kontrolü amacıyla kalibrasyon doğrusunun denklemi vasıtasıyla standart çözeltilerden elde edilen sonuçlar ile derişimler hesaplanmış ve olması gereken derişim (nominal) ile karşılaştırılmıştır (n=6). Geliştirilen analitik yöntem ile elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliğini ve doğruluğunu test edebilmek için üç derişim seviyesinde (15, 30, 45 µg/mL) dört ayrı çözelti kullanılarak iki ayrı günde çalışmalar yapılmıştır. Sistemin Uygunluğu Sistem uygunluğunun analizi için 30 ve 40 µg/mL derişime sahip çözeltilerin altı farklı ölçümündeki alıkonma zamanı, enjeksiyon tekrarlanabilirliği (alıkonma zamanlarının BSS değeri), kapasite faktörü (t0=1,1 dk), teorik tabaka sayısı (USP) ve pik asimetri oranı (% 10) hesaplanmıştır. 39 Büyüklük Dışlama HPLC (SE-HPLC) Kromatografisi ile Tayinler-1 Kromatografi Koşulları ve Sistem Avrupa Farmakopesi 6.3’te önerilen büyüklük dışlama kromatografi (SEC) kolonu kullanılmıştır (151). Monografta 300 mm uzunluğunda, 7,8 mm çapında, 5 µ partikül büyüklüğüne sahip ve molekül ağırlığı 10.000 ila 500.000 arasında olan globüler proteinlerin ayrılmasında kullanılan hidrofilik silika jel kolonu önerilmiştir. Bu amaçla TSKgel® G3000SWXL HPLC kolonu temin edilmiştir. Avrupa Farmakopesi 6.3’te molekül ağırlığı filgrastimden büyük olan safsızlıkların tayini için kullanılmakta olan bu yöntem, agregatlar, filgrastim oligomerleri (2 belirgin tipte), filgrastim dimerleri ve filgrastim monomerlerini tayin etmek için kullanılır. Çalışmamızda elde edilen filgrastim- kitosan konjugatları bu yöntemle tayin edilmiştir. Avrupa Farmakopesi 6.3’e uygun şekilde kolon 30 ˚C’ye ısıtılmıştır. 0,5 mL/dk hızda 50 mM pH 7,0 Amonyum Bikarbonat tamponu hareketli faz olarak kullanılmıştır. 10 mM pH 4,0 sodyum asetat tamponunda seyreltilmiş, 20 mM NaOH ile pH’ı ayarlanmış filgrastim, kitosan ve enzim içeren konjugat örnekleri kolona uygulanmıştır. 215 nm’de ölçümler alınmıştır. Özgünlük Analitik yöntemin oluşan konjugatı diğer ortam bileşenlerinden ayrı olarak ölçebilme yeteneğini gösterebilmek için özgünlüğü tayin edilmiştir. Bunun için düşük molekül ağırlıklı kitosan hidrolizatı, mikrobiyal transglutaminaz ve filgrastimin pH 5,5’e ayarlanmış çözelti içersinde kromatogramları alınmış ve alıkonma zamanları karşılaştırılmıştır. 40 Büyüklük Dışlama HPLC (SE-HPLC) Kromatografisi ile Tayinler-2 Kromatografi Koşulları ve Sistem Çalışmalarda önce 300 mm uzunluğunda, 7,8 mm çapında, 5 µ partikül büyüklüğüne sahip ve molekül ağırlığı 10.000 ile 500.000 arasında olan globüler proteinlerin ayrılmasında kullanılan TSKgel® G3000SWXL HPLC kolonu kullanılmıştır. Ancak, düşük molekül ağırlıklı proteinlerin ayırımı için TSKgel® G2000SWXL kolonu daha uygun olacağı için molekül ağırlığı 5.000 ila 150.000 arasında olan ve globüler proteinlerin ayrılmasında kullanılan TSKgel® G2000SWXL HPLC kolonu ile de çalışmalar yapılmıştır (152). Yöntemde başka bir değişiklik yapılmamış, Avrupa Farmakopesi 6.3’e uygun şekilde 30 ˚C’ye ısıtılmıştır. 0,5 mL/dk hızda 50 mM pH 7,0 Amonyum Bikarbonat tamponu hareketli faz olarak kullanılmıştır. 10 mM pH 4,0 sodyum asetat tamponunda seyreltilmiş, 20 mM NaOH ile pH’ı ayarlanmış filgrastim, kitosan ve enzim içeren konjugat karışımları kolona uygulanmış ve 215 nm’de ölçümler yapılmıştır. Özgünlük Analitik yöntemin oluşan konjugatı diğer ortam bileşenlerinden ayrı olarak ölçebilme yeteneğini gösterebilmek için özgünlük tayini yapılmıştır. Bunun için düşük molekül ağırlıklı kitosan hidrolizatı, mikrobiyal transglutaminaz ve filgrastimin pH 5,5’e ayarlanmış çözelti içinde kromatogramları alınmış ve alıkonma zamanları karşılaştırılmıştır. 3.3. Kitosanın Fizikokimyasal Özellikleri 3.3.1. Kitosan Çözeltisinin Hazırlanması Kitosan pH 6,0’dan düşük pH’larda çözünür (62). Filgrastimin dayanıklı olduğu pH 4,0 değerinde çalışmak üzere kitosan stok çözeltileri de 10 mM pH 4,0 sodyum asetat 41 tamponu ile hazırlanmıştır. 2,24 mg/mL derişimde stok çözeltiler hazırlanmış ve tampon ile istenilen oranda seyreltilmiştir. Ön çalışmalarda “karides kabuklarından kitosan” ve “düşük molekül ağırlıklı kitosan” karşılaştırılmıştır. 3.3.2. Kitosan Hidrolizatlarının Elde Edilmesi Çalışmalarda kitosanın molekül ağırlığının geniş bir aralıkta ve büyük olması nedeniyle konjugatları hazırlamak için küçük molekül ağırlıklı kitosan hidrolizatları da hazırlanmıştır. Kitosanın asit hidrolizi ile depolimerize edilmesi ile kitooligosakkaritler elde edilmiştir. Bu amaçla 1g kitosan, 100 mL 2M HCl`de çözüldükten sonra 3,5 saat boyunca distilasyon cihazında kaynatılıp soğutulmuş ve 300 mL etanol eklenerek çöktürülmüştür. Çökelti etanol ile 3 kez yıkanmış ve 24 saat boyunca vakum altında kademeli olarak liyofilize edilmiştir. Liyofilize kitosan hidrolizatlarından 10 mM pH 4,0 sodyum asetat tamponunda 2,24 mg/mL derişimde stok çözeltiler hazırlanmıştır. Çalışmalarda polimer olarak “düşük molekül ağırlıklı kitosan”dan elde edilen hidrolizat çözeltileri kullanılmıştır. 3.3.2. Düşük Molekül Ağrılıklı Kitosan ve Kitosan Hidrolizatlarının UV Spektrumu Düşük molekül ağırlıklı kitosanın hidrolizayon ile yapısının değişip değişmediğini ve HPLC çalışmalarında kullanılırken 215 nm’de girişim yapıp yapmadığını görmek amacıyla, düşük molekül ağırlıklı kitosan ve kitosan hidrolizatının 10 mM pH 4,0 sodyum asetat tamponunda hazırlanmış 2,24 mg/mL derişimdeki çözeltilerinin 180-500 nm dalga boyu aralığında UV spektrumları alınmıştır. 3.4. Transglutaminazın Fizikokimyasal Özellikleri 3.4.1. Transglutaminaz Çözeltisinin Hazırlanması Mikrobiyal transglutaminaz pH 5-8 aralığında optimum etkinlik gösterir. Ancak pH 4-9 arasında da aktivite gösterdiği bildirilmiştir (96). Çalışmalarda kobay 42 karaciğerinden liyofilize toz halinde elde edilen transglutaminaz ve mikrobiyal transglutaminaz ile ön deneyler yapılmıştır. 1U kobay transglutaminazı 1mL distile suda çözüldükten sonra dondurularak saklanmış ve kullanılacağı zaman çözülmüştür. Streptomyces mobaraensis (Streptoverticillium mobaraense)’den elde edilen mikrobiyal transglutaminaz % 99 maltodekstrin içeren bir toz karışımı halinde temin edilmiştir (Ajinomoto–Activa WM). Çalışmalar ilk olarak bu toz karışımın sudaki dağılımı ile yapılmıştır. Ardından, 10.000 G’de oda sıcaklığında 15 dk, 10.000 G’de 4 ˚C’de 15 dk (153), 10.000 G’de 4 ˚C’de 2 dk (154) ve 6.000 G’de 4 ˚C’de 15 dk (107) (106) santrifüjlenerek maltodekstirinin çökmesi sağlanmış ve üst sıvı enzim çözeltisi kullanılmıştır. Üst sıvı enzim çözeltilerinin SDS-PAGE ile yapılan karşılaştırmalarında fark gözlenmediği için sonraki çalışmalarda 10.000 G’de 4 ˚C’de 15 dk santrifüjlenerek maltodekstirinden ayrılmış enzim çözeltisi kullanılmıştır. Dondurularak saklanan enzim çözeltisi kullanımdan önce çözülerek kullanılmıştır. Buzdolabında bekletilen örnekler 2- 3 gün sonra SDS-PAGE analizlerinde farklı yerlerde bant verdiğinden dayanıksız olduğu görülmüş ve her çalışmada dondurucudan yeni bir stok çözelti alınıp çözülerek kullanılmıştır. 3.5. Enzimatik Yöntemle Konjugatların Oluşturulması Enzimatik yöntemle konjugatların oluşması için filgrastim, enzim ve kitosandan oluşan bir çözelti hazırlanmıştır. İstenilen kitosan:filgrastim oranındaki çözeltiler 20 mM NaOH çözeltisi içersinde farklı pH’larda hazırlanmıştır (Tablo 3.4). Kitosan, filgrastim ve enzimin stabilitesi ve işlevleri bakımından konjugat oluşumu için ortak uygun çalışma pH’sı 5,5 olarak belirlenmiştir. Öncelikle filgrastim, enzim ve polimer ile ikili karışımlar hazırlanmış ve filgrastim ve polimer yerine eşit hacimde 10 mM pH 4,0 sodyum asetat tamponu, enzim yerine eşit hacimde su eklenmiştir. Çalışmalar 5 ˚C, 25 ˚C ve 40 ˚C’de inkübatör ve su banyosu kullanılarak yapılmıştır. Uygun çalışma sıcaklığı olarak 25 ˚C seçilmiştir. Tepkimenin gerçekleşmesi için 24 saat beklenmiştir. Ön çalışmalar dikkate alınarak konjugat oluşumu gözlenen oranlarda çalışmalar tekrarlanmıştır. Kitosan:filgrastim oranı 20:1 (a/a) ve enzim:filgrastim oranı 1:1 olarak çalışılmıştır. 43 Tablo 3.4. Farklı pH’larda kitosan-filgrastim çözeltilerinde kullanılan tampon miktarları.7 pH 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 10 mL çözeltide kullanılacak 20mM NaOH (ml) 0.00 1.00 2.60 3.55 4.00 4.20 4.25 3.6. Konjugat Oluşumunun Tayini 3.6.1. HPLC ile Tayinler Filgrastimin HPLC ile analitik tayini için Avrupa Farmakopesi 6.3 (European Pharmacopoeia) (151) tarafından iki HPLC yöntemi önerilmiştir. Bunlar molekül ağırlığı filgrastimden büyük safsızlıkların tayini için SE-HPLC (Büyüklük Dışlama - Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi) yöntemi ve ilgili proteinlerin tayini için RP-HPLC (Ters Faz - Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi) yöntemidir. Filgrastim ile konjugat oluşumunu tayin etmek için öncelikle Avrupa Farmakopesi 6.3’te yer alan RP-HPLC yöntemi seçilmiştir. Ancak bu yöntemde düşük derişimlerde ölçüm yapılamamıştır. Tezde konjugasyon çalışmalarında düşük derişimlerdeki örnekler ile çalışıldığından uygun bir yöntem geliştirilmiş ve ayrıntıları 3.2.3. Filgrastimin HPLC ile Analizi’nde verilmiştir. SE-HPLC çalışmalarında önce 300 mm uzunluğunda, 7,8 mm çapında, 5 µ partikül büyüklüğüne sahip ve molekül ağırlığı 10.000 ila 500.000 arasında olan proteinlerin ayrılmasında kullanılan TSKgel® G3000SWXL HPLC kolonu kullanılmıştır. Ancak, ayırımın daha iyi olabileceği düşüncesi ile molekül ağırlığı 5.000 ila 150.000 arasında olan globüler proteinlerin ayrılmasında kullanılan TSKgel® G2000SWXL HPLC kolonu ile de çalışmalar yapılmıştır. 44 Ters-Faz HPLC Analizi Düşük molekül ağırlıklı kitosan hidrolizatları ile karıştırılan filgrastim çözeltisi mikrobiyal transglutaminaz ile ve transglutaminaz kullanılmadan pH 5,5 ortamında 24 saat 25 ˚C’de bekletilmiştir. Bekletilen çözeltiler 50 µL hacminde kolona uygulanmıştır. Büyüklük Dışlama HPLC (SE-HPLC) Kromatografisi ile Tayinler-1 Düşük molekül ağırlıklı kitosan hidrolizatları ile karıştırılan filgrastim çözeltisi mikrobiyal transglutaminaz ile ve transglutaminaz kullanılmadan pH 5,5 ortamında 24 saat 25 ˚C’de bekletilmiştir. Bekletilen çözeltiler 50 µL hacminde kolona uygulanmıştır. Büyüklük Dışlama HPLC (SE-HPLC) Kromatografisi ile Tayinler-2 Düşük molekül ağırlıklı kitosan hidrolizatları ile karıştırılan filgrastim çözeltisi mikrobiyal transglutaminaz ile ve transglutaminaz kullanılmadan pH 5,5 ortamında 24 saat 25 ˚C’de bekletilmiştir. Bekletilen çözeltiler 50 µL hacminde kolona uygulanmıştır. 3.6.2. Elektroforetik Yöntemlerle Yapılan Analizler SDS-PAGE Analizi (İndirgenmiş) Sodyum dodesil sülfat (SDS) poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) yöntemi proteinlerin analizinde en sık kullanılan yöntemlerden birisidir (143). Bu tez çalışmasında üç farklı derişimde jel hazırlanarak SDS-PAGE analizi yapılmıştır. 1. Hızlandırıcı kısım % 8 – Ayrıştırıcı kısım % 12 2. Hızlandırıcı kısım % 4 – Ayrıştırıcı kısım % 15 3. Hızlandırıcı kısım % 4 – Ayrıştırıcı kısım % 12 45 Aşağıda anlatıldığı şekilde hazırlanan jel çözeltileri etanolle yıkanmış cam plakalar arasına dökülerek jelleştirilmiştir. Jellerin hazırlanması için gerekli stok çözeltiler: 1. Akrilamid/Bisakrilamid Çözeltisi: 29,2 g akrilamid ve 0,8 g N'N'-bis- metilen-akrilamid distile su ile 100 mL’ye tamamlanır. Çözelti 5 ˚C’de en fazla 30 gün boyunca saklanabilir. 2. % 10 (a/h) SDS Çözeltisi: 10 g SDS distile su ile 100 mL’ye tamamlanarak çözeltisi hazırlanır. Oda sıcaklığında saklanır. 3. 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 Tamponu: 18,15 g Tris bazı 50 mL distile suda çözülür, 6 N HCl ile pH 8,8’e ayarlanır, distile su ile 100 mL’ye tamamlanır. 5 ˚C’de saklanır. 4. 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 Tamponu: 6 g Tris bazı 60 mL distile suda çözülür, 6 N HCl ile pH 6,8’e ayarlanır, distile su ile 100 mL’ye tamamlanır. 5 ˚C’de saklanır. 5. Örnek Tamponu (SDS İndirgeyici Tampon): 3,55 mL distile su, 1,25 mL 0,5 M Tris-HCl tamponu, pH 6,8, 2,5 mL gliserol, 2,0 mL % 10 (a/h) SDS çözeltisi, 0,2 mL % 0,5 (a/h) bromfenol mavisi ile toplam 9,5 mL çözelti hazırlanır. Oda sıcaklığında saklanır. Kullanmadan hemen önce 950 µL örnek tamponuna 50 µL β-merkaptoetanol (2-merkaptoetanol) eklenir. Örnekler kuyucuklara doldurulmadan önce bu çözeltiyle seyreltilir. 6. 10x Elektrod (yürütme) Tamponu, pH 8,3: 30,3 g Tris bazı, 144,0 g glisin ve 10,0 g SDS distile su ile 100 mL’ye tamamlanır. pH ayarlanmasına gerek yoktur. Çözelti 5 ˚C’de saklanır. Kullanımdan önce 50 mL 10x stok çözelti 450 mL distile suyla seyreltilir. 46 7. % 10 (a/h) APS Çözeltisi: 100 mg amonyum persülfat distile su ile 1 mL’ye tamamlanır. Kullanımdan hemen önce hazırlanır. Jellerin hazırlanması için kullanılan çözeltiler: 1. Hızlandırıcı kısmı % 4’lük olan jeller hazırlanırken distile su, Akrilamid/Bisakrilamid Çözeltisi, 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 tamponu ve % 10 (a/h) SDS çözeltisinden sırasıyla 6,1 mL, 1,3 mL, 2,5 mL ve 0,1 mL alınarak 10 mL’lik monomer çözeltisi hazırlanır. 2. Hızlandırıcı kısmı % 8’lik olan jeller hazırlanırken distile su, Akrilamid/Bisakrilamid Çözeltisi, 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 tamponu ve % 10 (a/h) SDS çözeltisinden sırasıyla 4,7 mL, 2,7 mL, 2,5 mL ve 0,1 mL alınarak 10 mL’lik monomer çözeltisi hazırlanır. Hızlandırıcı kısım monomer çözeltileri jel haznesine dökülmeden hemen önce, 10 mL için 50 µL % 10 APS çözeltisi ve 10 µL TEMED ile karıştırılarak polimerleşme reaksiyonu başlatılır. 3. Ayrıştırıcı kısmı % 12’lik olan jeller hazırlanırken distile su, Akrilamid/Bisakrilamid çözeltisi, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8 tamponu ve % 10 (a/h) SDS çözeltisinden sırasıyla 3,4 mL, 4,0 mL, 2,5 mL ve 0,1 mL alınarak 10 mL’lik monomer çözeltisi hazırlanır. 4. Ayrıştırıcı kısmı % 15’lik olan jeller hazırlanırken distile su, Akrilamid/Bisakrilamid Çözeltisi, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8 tamponu ve % 10 (a/h) SDS çözeltisinden sırasıyla 2,4 mL, 5,0 mL, 2,5 mL ve 0,1 mL alınarak 10 mL’lik monomer çözeltisi hazırlanır. 47 Ayrıştırıcı kısım monomer çözeltileri jel haznesine dökülmeden hemen önce, 10 mL için 50 µL % 10 APS çözeltisi ve 5 µL TEMED ile karıştırılarak polimerleşme reaksiyonu başlatılır. Yukarıda anlatıldığı gibi polimerleşen çözelti pipetle hazneye dökülür, üzeri izopropanol ile kaplanır. Ayrıştırıcı kısım jel haznesinde polimerleştikten sonra fazla izopropanol kurutma kağıtları ile alınır ve hızlandırıcı kısmın polimerleşen çözeltisi pipetle hazneye dökülür. Kuyucukları oluşturacak tarak yerleştirilip, polimerleşmesi için beklenir. Örneklerin Hazırlanması Örnek tamponu stok çözeltisi, kullanımdan hemen önce 95:5 oranında β- merkaptoetanol ile karıştırılır. Bu çözelti ile örnekler 1:1 oranında seyreltilir ve 95 ˚C’de 4 dakika ısıtılır. Kuyucuklara uygulanmaya hazır duruma gelir. Elektroforezin Yapılması Cam plakalar arasında polimerleşmiş jeller elektroforez cihazına yerleştirilir, taraklar çıkartılır, cihazın haznesi