dc.contributor.advisor | Aerts Kaya, Fatima Susanna Faustina | |
dc.contributor.author | Esken, Gülen | |
dc.date.accessioned | 2018-10-22T11:33:16Z | |
dc.date.issued | 2018-04-04 | |
dc.date.submitted | 2018-10-04 | |
dc.identifier.citation | VANCOUVER | tr_TR |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11655/5253 | |
dc.description.abstract | Griscelli type 2 Syndrome (GS-2) is a rare, autosomal recessive
immune deficiency syndrome. The RAB27A gene mutation in GS-2 patients results in
the loss of function of T and NK cells. Induced pluripotent stem cells (iPSC) express
pluripotency genes, have the capacity for infinite expansion and can differentiate into
cells from all three germ layers. They can be induced using integrative and nonintegrative
systems by the use of the Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc (OSKM) transcription
factors. To better understand GS-2 disease and to test novel treatment options, there is
a need for an in vitro GS-2 model. For this reason, in this thesis, iPSC clones were
made from 3 GS-2 patients and thoroughly characterized. GS-2 iPSCs were stained for
SSEA1, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 and Oct4 via immunofluorescent staining’s.
They also expressed SOX2, NANOG and OCT4, as confirmed by RT-PCR. They were
differentiated in vitro into hematopoietic lineage and in vivo in a teratoma assay into
cells from all three germ layers. In addition, all GS-2 iPSCs displayed a normal
karyotype (46, XX or 46, XY) and were shown to express the RAB27A gene mutation
that was present in the original somatic donor cells. In conclusion, using lentiviral
transfer of OSKM, we were able to create bona fide iPSCs from 3 GS-2 patients and
characterized the cells. These cells can be used in future studies for the development
of novel treatment options and to study the pathophysiology of GS-2 disease. | en |
dc.description.tableofcontents | İÇİNDEKİLER
ONAY SAYFASI iii
YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv
ETİK BEYAN v
TEŞEKKÜR vi
ÖZET vii
ABSTRACT viii
İÇİNDEKİLER ix
SİMGELER VE KISALTMALAR xiii
ŞEKİLLER xvi
TABLOLAR xviii
1. GİRİŞ 1
2. GENEL BİLGİLER 5
2.1. Kemik iliği mezenkimal kök hücreler (Kİ-MKH) 5
2.1.1. Kİ-MKH’lerin karakterizasyonu 5
2.1.2. Kİ-MKH’lerin hematopoez desteği ve immünmodulatuvar rolü 6
2.2. Embriyonik kök hücreler (EKH) 10
2.2.1. EKH’lerin karakterizasyonu 10
2.2.2. EKH’lerin kullanımında etik sorunlar 11
2.3. Uyarılmış pluripotent kök hücreler (uPKH) 12
2.3.1. uPKH’lerin karakterizasyonu 12
2.3.2. EKH/uPKH arasındaki farklar 14
2.4. uPKH eldesinde farklı gen aktarım sistemleri 15
2.4.1. İntegratif aktarım sistemleri 16
2.4.2. Non-integratif aktarım sistemleri 17
2.5. Griscelli Tip 2 Sendromu (GS-2) 19
2.6. GS-2 uPKH geliştirilmesi 21
2.7. İn vitro hematopoetik farklılaşma sistemleri 22
2.8. Rag2-/- immün yetmezliği fare modeli 24
2.9. Tez çalışmasının hipotezi ve amaçları 24
x
3. GEREÇ VE YÖNTEM 26
3.1. Materyaller 26
3.1.1. İnsan kaynaklı materyaller 26
3.1.2. Hücre hatları 27
3.2. Kök hücre izolasyonu 28
3.2.1. Kemik iliği mononükleer hücre (MNH) izolasyonu 28
3.2.2. Kordon kanı CD34+ hücre seleksiyonu 29
3.3. MKH kültürü 30
3.3.1. MKH kültürü 30
3.3.2. MKH sayımı, dondurma ve çözme yöntemi 30
3.4. MKH karakterizasyonu 31
3.4.1. MKH farklılaşmaları 31
3.4.2. MKH immünofenotiplendirilmesi 32
3.5. XL-1 Blue kompetan bakteriler 33
3.5.1. XL-1 Blue bakterilerden kompetan stok hazırlanması 33
3.5.2. XL-1 Blue kompetan bakteri kültürü 34
3.6. Plazmit çoğaltılması ve izolasyonu 34
3.6.1. Plazmitlerin özellikleri ve haritaları 34
3.6.2. XL-1 Blue kompetan bakteri transformasyonu 41
3.6.3. Plazmit izolasyonu ve kantifikasyonu 41
3.7. Lentiviral vektör üretimi 42
3.7.1. Geçici HEK293T hücre transfeksiyonu 42
3.7.2 Lentiviral vektörlerin konsantre edilmesi ve saklanması 43
3.8. Sağlıklı ve Griscelli tip 2 hücrelerin yeniden programlaması 43
3.8.1. mRNA yöntemiyle yeniden programlama 43
3.8.2. Lentiviral yöntemleri ile yeniden programlama 44
3.8.3. SeV ile yeniden programlama 47
3.8.4. Uyarılmış pluripotent Kök Hücre (uPKH) kolonilerin seçilmesi 48
3.9. uPKH devam kültürü 49
3.9.1. uPKH dondurma ve çözme yöntemleri 49
3.9.2. uPKH ekimi ve çoğaltılması 50
3.10. uPKH karakterizasyonu 50
xi
3.10.1. uPKH immünfenotiplendirilmesi 50
3.10.2. uPKH immünfloresan boyamaları ve görüntülemesi 51
3.10.3. Pluripotent gen ifadeleri RT-PCR 52
3.10.4. uPKH karyotip analizi 54
3.10.5. uPKH teratom deneyleri 55
3.10.6. uPKH RAB27A mutasyon analizi 56
3.11. uPKH’lerin Op9 hücreler ile ko-kültürü ve hematopoetik farklılaşması
CD34+ hücrelere farklılaşma ve FACS 57
3.12. RAG2-/- farelere HKH nakli ve engrafmanı 58
3.13. Mikoplazma testi 58
3.14. İstatistik analizler 58
3.15. Kullanılan sarf malzemeler ve cihazlar 59
3.16. Kimyasallar, besi yeri, tamponlar ve solüsyonlar 62
4. BULGULAR 66
4.1. Sağlıklı ve GS-2 MKH izolasyonu ve karakterizasyonu 66
4.1.1. Sağlıklı ve GS-2 MKH morfolojileri benzerdir 66
4.1.2. Sağlıklı ve GS-2 MKH farklılaşma kapasiteleri benzerdir 67
4.1.3. Sağlıklı ve GS-2 MKH immünofenotipleri benzerdir 68
4.2. Sağlıklı ve GS-2 MKH yeniden programlaması 69
4.2.1. mRNA yöntemi ile yeniden programlama 69
4.2.2. SeV yöntemi ile yeniden programlama 72
4.2.3. Lentiviral vektör yöntemi ile yeniden programlama 74
4.3. Sağlıklı ve GS-2 uPKH karakterizasyonu 77
4.3.1. Sağlıklı ve GS-2 uPKH: akım sitometre 77
4.3.2 Sağlıklı ve GS-2 uPKH: floresan mikroskop 80
4.3.3. Sağlıklı ve GS-2 uPKH: RT-PCR 82
4.3.4. Sağlıklı ve GS-2 uPKH: karyotiplendirme 84
4.3.5. Sağlıklı ve GS-2 uPKH: teratomlar 85
4.3.6. Sağlıklı ve GS-2 uPKH: RAB27A mutasyon analizi 87
4.4. Sağlıklı ve GS-2 uPKH in vitro hematopoetik farklılaşması 87
4.5. Rag2-/- farelere nakil ve engrafman takibi 93
5. TARTIŞMA 95
xii
6. SONUÇ VE ÖNERİLER 108
6.1. Sonuçlar 108
6.2. Öneriler 109
7. KAYNAKLAR 110
8. EKLER
EK-1. Tez çalışması ile ilgili Etik Kurul izinleri Etik kurul izni
EK-2. Hayvan etik kurul izinleri
EK-3. Tez çalışması ile ilgili bildiriler
EK-4. Tez çalışması Orijinallik raporu
EK-5. Dijital Makbuz
9. ÖZGEÇMİŞ | tr_TR |
dc.language.iso | tur | tr_TR |
dc.publisher | Sağlık Bilimleri Enstitüsü | tr_TR |
dc.rights | info:eu-repo/semantics/openAccess | tr_TR |
dc.subject | tip 2 griscelli sendromu | tr_TR |
dc.subject | Kemik iliği | |
dc.subject | Mezenkimal kök hücre | |
dc.subject | Hematopoetik kök hücre | |
dc.subject | Uyarılmış pluripotent kök hücre | |
dc.subject | t, b ve doğal öldürücü hücreler | |
dc.title | Griscelli Sendromu Uyarılmış Pluripotent Kök Hücre Geliştirilmesi, Karakterizasyonu ve İn Vitro Hematopoetik Farklılaşması | tr_TR |
dc.type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis | tr_TR |
dc.description.ozet | Griscelli Tip 2 Sendromu (GS-2) nadir, otosomal resesif, kalıtsal immün yetmezliği
sendromudur. GS-2 hastalarında RAB27A gen mutasyonu; T ve Doğal Öldürücü
hücrelerin fonksiyonlarının bozulmasına neden olmaktadır. Uyarılmış Pluripotent Kök
Hücreler (uPKH); somatik veya kök hücrelerin Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc (OSKM)
transkripsiyon faktörleri ile yeniden programlaması sonucunda geliştirilmektedir.
uPKH’ler, pluripotent genleri ifade eden, sonsuz çoğalabilme ve üç germ yaprağına
farklılaşma potansiyeline sahip hücrelerdir. GS-2 patofizyolojisinin daha iyi
anlaşılması ve yeni tedavi yöntemlerini test edilmesi için in vitro bir GS-2 modeline
ihtiyacı vardır. Bu amaçla, bu tez kapsamında, 3 GS-2 hastasından uPKH klonları
oluşturulmuştur ve detaylı karakterizasyonları yapılmıştır. GS-2 uPKH’lerin
geliştirmesi için mRNA, Sendai ve lentiviral gen aktarım yöntemleri kullanılmıştır.
Lentiviral gen aktarım yöntemi ile geliştirilen uPKH’lerin; immünofloresan boyamalar
ile SSEA1, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 ve OCT4 protein ifadeleri; SOX2, NANOG
ve OCT4 gen ifadeleri, in vitro hematopoetik farklılaşma ve in vivo teratom
deneylerinde üç germ yapraklarına ait hücrelere farklılaşma kapasitesi gösterilmiştir.
Ayrıca, tüm GS-2 uPKH’lerin karyotipleri normal (46, XX veya 46, XY) ve ilerleyen
pasajlarda başlangıç donör hücrelerin bilinen RAB27A gen mutasyonunu taşıdıkları
gözlemlenmiştir. Sonuç olarak, 3 GS-2 hastadan uPKH geliştirilmiştir ve gelecekti
yeni ilaçların testinde, hastalığın patofizyolojisi veya rejeneratif tıp araştırmalarında
kullanılabilecektir. | tr_TR |
dc.contributor.department | Kök Hücre | tr_TR |
dc.embargo.terms | 6 ay | tr_TR |
dc.embargo.lift | 2019-04-26T11:33:17Z | |