| dc.contributor.advisor | Dinçer, Pervin Rukiye | |
| dc.contributor.author | Düz, Nilüfer | |
| dc.date.accessioned | 2024-03-07T11:22:46Z | |
| dc.date.issued | 2024 | |
| dc.date.submitted | 2024-01-19 | |
| dc.identifier.uri | https://hdl.handle.net/11655/34776 | |
| dc.description.abstract | Desmin, a muscle-specific protein, shapes the network of intermediate filaments (IFs) in different types of muscles, such as cardiac, skeletal, and smooth muscles. Recent studies have elucidated cytoskeletal proteins' well-defined structural and cytoplasmic functions, including Desmin. Contrary to the traditional understanding of these proteins primarily residing in the cytoplasm, emerging evidence suggests their subcellular translocation into the nucleus, where they can carry out crucial functions. In the C-terminal tail domain of Desmin, there exists a binding domain for Lamin B, which is localized in the nucleus. The dysfunction of this domain has been associated with myofibrillar myopathy-1. However, despite its impact on mechanotransduction pathways and the nuclear localization of Desmin in affected individuals, there is no identified pathophysiology for this condition. This thesis aims to contribute to understanding the nuclear localization of Desmin under mechanical stress conditions and investigate the role of Desmin in regulatory pathways. Immunofluorescence co-staining analyses demonstrated the concurrent colocalization of Desmin with the nuclear markers DAPI and Lamin B. This colocalization was notably higher under mechanical strain and showed a strain-dependent manner. Immunoblotting confirmed Desmin's presence in the nuclear fraction, providing additional validation. Proteomic integration with an extended transcriptomic dataset from wild-type and Desmin KO mice revealed Desmin's role in the post-transcriptional process, affecting RNA binding proteins. Actinomycin-D (Act-D) chase assay for MyoD and Myogenin, two myogenic differentiation markers, in Desmin knockdown cells, confirmed this role. The investigation into the myogenic potency and morphological characteristics of myotubes in Desmin knockdown cells revealed defects in morphological parameters associated with myotube maturation and commitment in myogenesis. | tr_TR |
| dc.language.iso | en | tr_TR |
| dc.publisher | Sağlık Bilimleri Enstitüsü | tr_TR |
| dc.rights | info:eu-repo/semantics/embargoedAccess | tr_TR |
| dc.subject | Desmin | tr_TR |
| dc.subject | nuclear translocation | tr_TR |
| dc.subject | RNA stability | tr_TR |
| dc.subject | myogenic potency | tr_TR |
| dc.subject.lcsh | Bilgi kaynakları | tr_TR |
| dc.title | The Investıgatıon of Mechanoregulatory Role of Desmın | tr_TR |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis | tr_TR |
| dc.description.ozet | İskelet kas dokusunun, çevresel değişikliklere uyum sağlaması gerekmektedir. Bu uyum, protein sentezinin artışıyla sağlanır. Kasın çevresel değişikliklere yanıtını etkileyen faktörler arasında büyüme faktörlerindeki değişiklikler, sitokin seviyeleri, nöral uyarım ve egzersiz/direnç antrenmanı gibi mekanik yüklemeler yer almaktadır. Ayrıca, amino asitler de (AA) adaptif yanıtı arttıran faktörlerdendir.
Hücre iskeleti, hücrenin şeklini korur ve yapısal desteği sağlar. Bu özellik, hücrenin dış etkilere karşı direncini arttırır ve hücrenin işlevselliğini sürdürmesine yardımcı olur. Ayrıca, hücre iskeleti, hücre içinde ve hücreler arasında hareketi sağlar. Hhücrenin göç etmesi, bölünmesi, organellerin yer değiştirmesi gibi süreçlerde önemli bir rol oynar. Hücre iskeleti ayrıca hücre içindeki maddelerin taşınması ve hücre zarının şeklinin değiştirilmesi gibi işlevleri destekler. Hücre iskeletinin bu temel işlevleri, hücrenin yapısal bütünlüğünü koruması ve hareket yeteneğini sağlamasıyla hücrenin yaşamsal işlevlerini destekler. Hücre iskeleti, hücre biyolojisi ve hücrenin işlevi açısından önemli bir role sahiptir. Bu işlevler, hücre iskeletinde bulunan üç temel filament türü aracılığıyla gerçekleştirilir: aktin, mikrotübüller ve ara filamentler (IF). Bu yapılar hücrenin içinde ve dışında çeşitli süreçlerin gerçekleşmesini sağlarlar.
IF'lerin ortalama çapı yaklaşık olarak 10 nm'dir ve bu da onları mikrofilamentlerin (7 nm) ve mikrotübüllerin (yaklaşık olarak 25 nm) ortalama çapı arasına yerleştirir. Diğer hücre iskeleti bileşenlerin aksine, IF'ler hücresel hareketlilikte aktif olarak yer almazlar. Bunun yerine, temel rolleri çoğunlukla yapısal olup, hücreleri ve dokuları mekanik kuvvetlere karşı desteklemektir.
Mikrofilament ve mikrotübüllerin monomerleri sırasıyla aktin ve tübülin iken IF’ler temel yapı taşlarında heterojenlik gösterirler. 50' den fazla IF proteini, yapısal benzerliklerine göre altı gruba ayrılabilir. Epitel hücreleri, her biri yaklaşık olarak 15 farklı proteini içeren ve keratinler olarak bilinen Tip I (asidik) ve Tip II (nötr/bazik) IF' leri ifade ederler. Epitel hücrelerde, her iki tip keratin de birlikte polimerleşme (co-polymerization) yoluyla sentezlenir. Sert keratinler, saç, tırnak ve boynuzlar gibi özelleşmiş yapıların gelişimine katkıda bulunur. Bu süreçte, farklı tip keratinler bir araya gelirler. Tip III ara filamentler, nöronlarda bulunan ara filamentler olup nöronların yapısal bütünlüğünü korur ve sinir sinyallerinin iletilmesinde rol oynar. Tip IV ara filamentler, nöronların aksiyon potansiyellerinin iletiminde görev alan nörofilamentlerdir. Tip V ara filamentler, bazı özel hücre türlerinde ve dokularda bulunan az bilinen filamentlerdir. Bu tip IF'lerin işlevleri ve özellikleri henüz detaylı bir şekilde açıklanmamıştır.
IF'ler, ortak yapısal özelliklere sahiptirler. Tüm IF’lerde amino-terminal baş domaini, merkezi α-helikal rod domaini ve karboksiterminal kuyruk domaini bulunur. Bu proteinlerin lif benzeri yapıları ve merkezi α-helikal rod domainleri IF'lerin dördüncül yapısında dayanıklılık ve esneklik sağlar. Baş ve kuyruk domainlerdeki değişkenlik, farklı ara filament proteinleri arasındaki moleküler ağırlık farkına yol açar.
Desmin, 53 kDa molekül ağırlığına sahip tip III IF olup sarkoplazmada Z bandında bulunur. Memelilerde, tek bir DES tarafından kodlanır ve 2q35'te bulunur. DES, 9 ekson ve sekiz introndan oluşur. Kas dokusundaki temel IF olan Desmin'in yanı sıra, kas hücrelerinde Vimentin ve Nestin gibi diğer ara filamentler de bulunabilir. Desmin'in başlıca işlevi, miyofibril Z bandının etrafında bir karkas oluşturmaktır. Bu karkas, tüm kasılmayı düzenleyen mekanizmayı sağlar ve subsarkolemmal hücre iskeletine bağlanarak bir ağ oluşturur. Ayrıca, bu protein, çekirdek ve mitokondri gibi organellerin konumlandırılmasında kritik bir rol oynar. Desmin, çizgili kas hücrelerinin Z diskleri etrafında uzunlamasına bağlantılar oluşturur. İskelet kasında miyotendinous ve nöromüsküler bağlantılarda, kalp kasında ise kardiomyositleri birbirine bağlayan interkale disklerde yer alır. Memelilerde, kalp kası hücrelerinde Desmin miktarı iskelet kası hücrelerinden daha yüksektir (sırasıyla toplam proteinin %2'si ve %0,35'i).
Miyogenez farklılaşma sürecinde miyogenik bir belirteç olarak tanınan Desmin, miyogenez sırasında ortaya çıkan en erken proteinlerden biridir. Desmin, farklılaşmış kas hücrelerinde (miyotüplerde) yüksek düzeyde ifade edilirken, çoğalan miyoblastlarda ve satellit hücrelerinde minimal düzeyde bulunur. Desmin ifadesi, embriyonik gelişimin erken aşamalarında, özellikle fare embriyolarının 7.5. gün civarındaki prekardiyak bölgelerinde başlar. Daha sonra, 9. gün civarında miyotomlar ve düz kas hücrelerinde gözlenir.
DES'teki hastalık ile ilişkili varyasyonlar, hem iskelet hem de kalp kaslarını etkileyen bir dizi hasara (alternatif olarak desminopatiler olarak adlandırılır) neden olur. Desminopatiler veya Desmin ile ilişkili miyopatiler (DRM) klinik ve genetik olarak çeşitlilik gösteren Miyofibriller Miyopatiler'in (MFM) bir alt türü olarak da bilinir. Farklılık, Desmin için pozitif protein birikimlerinin varlığı ve miyofibrillerde görülen dejeneratif değişikliklerle belirlenir.
Ailevi desminopatilerde, kalıtım modeli genellikle otozomal dominant veya otozomal resesif olarak sınıflandırılır. Ancak, birçok vakada, de novo DES mutasyonlarıyla ilişkilendirilen ailevi bir arka plan bulunmamaktadır. Hastalığın başlangıç yaşı ve seyri, kalıtım modeline ve etkilenen protein domainlerine bağlı olarak değişebilir.
Desminopati genellikle yaşamın orta dönemlerinde (üçüncü ila dördüncü on yıllarında) ortaya çıkar ve belirtiler MFM1'e göre daha erken yaşlarda görülür. Kalp yetmezliği sıkça rastlanan bir durumdur ve desminopati vakalarında oranları %40 ila %90 arasında değişmektedir. Kasların distrofik durumu genellikle yavaş ilerler. Hastalığın erken evrelerinde, distal kasları daha çok etkilerken, proksimal kaslar ve özellikle alt ekstremiteler, üst ekstremitelere göre daha fazla etkilenir. Proksimal kas distrofisi, ileri evrelerde belirgin hale gelebilir. Distrofi düzeyi, aynı aileye mensup bireyler arasında bile önemli ölçüde değişebilir.
c.1289-2A>G mutasyonu, daha önce grubumuz tarafından bildirilen, Desmin'in kuyruk domaininde bulunan homozigot bir splice site mutasyonudur. Bu mutasyon, Desmin’in Lamin B bağlama domainine 16 amino asit eklemiş ve etkilenen bireylerde MFM1 hastalığının gelişimine yol açmıştır. Otozomal resesif kalıtıma sahip Desmin mutasyonları genellikle erken başlangıçlı belirtiler (ortalama beş yaşta başlar) ve ağır miyopati ve kardiyomiyopati ile karakterize bir seyir gösterir. Resesif kalıtıma sahip mutasyonlar sadece birkaç hastada tanımlanmış olmasına rağmen, c.1289-2A>G mutasyonunu taşıyan bireylerde kardiyomiyopati içermeyen geç başlangıçlı semptomlar ortaya çıkmıştır. Bu mutasyon, mutant Desmin'in ifade düzeyinde azalmaya neden olmamıştır. İskelet kası liflerinin hücre iskeleti ağında herhangi bir anormalliğe neden olmaz. Hasta bireylerin kas kesitlerinde yapılan araştırmalarda çekirdek ve mitokondri gibi zara sahip organellerin konumunda anormal değişiklikler bulunmamıştır. Bununla birlikte, sol gastroknemius kasından alınan biyopsi örneklerinde, kas liflerinin boyutunda farklılık ve lif boyunca gözlenen çekirdeklerin yanısıra internal çekirdeklerin varlığı da tespit edilmiş ve distrofik özellikler belirlenmiştir. Hasta hücrelerinde mekanotransdüksiyon hasarı öngörülmüş olsa da, hastalığın kesin nedeni halen bilinmemektedir. Literatürde yaygın olarak görülen desminopati patolojisi bulunmasa da, bu hastalarda Desmin-Lamin B etkileşiminin eksikliğinin hastalığın gelişimine yol açabileceği düşünülmektedir.
Desmin ve Lamin B'nin birbirleriyle fiziksel etkileşime girerek çekirdek ve sitoplazma arasında bir iletişim ağı oluşturduğunu gösteren araştırmalar bulunmaktadır. Bu etkileşim, zebra balığı kas dokusunda yapılan eş-immün çöktürme deneyleri ile doğrulanmıştır. Ayrıca, Desmin'in Torpedo marmorata elektrik hücresinin postsinaptik membranında Lamin B ile etkileştiğini tanımlayan başka bir çalışma da mevcuttur.
Farklı çalışmalardan elde edilen bulgular, Lamin dışındaki diğer ara filamentlerin çekirdeğe yerleşebileceğini gösteriyor. Bu durumda, hücre iskeleti elemanlarının çekirdeğin transkripsiyon ile ilgili süreçlerini dinamik olarak etkileyebileceği düşünülüyor.
Elde ettiğimiz ön veriler, Desminin çekirdekte yerleşmemesinin, kaslarda mekanotransdüksiyon hasarına ve uzun süreli mekanik stres altında kas dejenerasyonuna yol açabileceğini öne sürmektedir. Bu tez çalışmasındaki hipotezimiz, çizgili kas hücrelerinde mekanik gerilimin Desmin proteininin çekirdeğe yerleşimini arttırdığı ve bunun sonucunda aday genlerin ifade seviyelerinde doğrudan veya dolaylı olarak değişikliklere yol açtığı yönünde oluşmuştur. Bu tezin temel amacı ise, Desmin'in mekanik stres koşullarında çekirdekte yerleşiminin anlaşılmasına katkı sağlamak ve Desmin'in regülasyon yolaklarındaki rolünü araştırmaktır.
Bu doğrultuda, Desmin'in hücre içindeki konumunu araştırmak ve mekanik gerilimin Desminin hücredeki yerleşimi üzerinde olan etkisini değerlendirmek için immünfloresan boyama çalışmaları gerçekleştirildi. Desmin'i tanıyan antikorun yanı sıra hücre germe deneyleri için pozitif kontrol olarak T-YAP'i, çekirdek belirteci olarak ise DAPI ve Lamin B'yi tanıyan antikorlar kullanıldı. Hücre germe deneyinden sonra, Pearson Korelasyon Katsayısı (PCC) kullanarak piksel tabanlı analiz yoluyla iki kanal arasındaki örtüşme derecesi (Desmin/DAPI, Desmin/Lamin B ve Desmin/T-YAP) ve dolayısıyla proteinlerin eş-yerleşim miktarı kantitatif olarak ölçüldü. İmmünofloresan boyama işleminden sonra, farklı gerilim seviyelerine maruz kalan hücre grupları arasındaki eş-yerleşim değerleri istatistiksel olarak analiz edildi. Kontrol grubu ile çeşitli gerilmeye maruz kalan gruplar arasında anlamlı bir PCC değeri artışı gözlendi (p < 0.01). Eş-yerleşim analizi, Desmin'in çekirdek içinde bulunduğunu ve Lamin B ve DAPI gibi çekirdek belirteçleriyle aynı konumda yer aldığını ortaya koydu. Bu durum özellikle, statik gruplara göre gerilime maruz kalan hücrelerde belirgin bir şekilde artış gösterdi.
Desmin'in çekirdek yerleşimini doğrulamak için, protein fraksiyonu deneyleri gerçekleştirildi. Bu fraksiyonun kalite kontrolü, çekirdek (Lamin B) ve sitoplazmik (GAPDH) belirteçler kullanılarak değerlendirildi. Ardından, aynı hücresel fraksiyonlar, Desmin'e özgü bir antikorla immünoblot analizine tabi tutuldu. Sonuçlar, Desmin'in hem sitoplazmik hem de çekirdek fraksiyonunda varlığını doğruladı.
Son zamanlarda yapılan çalışmalar, Desmin'in regülatör işlevi, hücresel yerleşimi ve çekirdek-sitoplazma arasındaki taşınımı üzerine odaklanmıştır. Bu çalışmalar Desmin'de iki potansiyel çekirdek yerleşim sinyal dizisi (NLS) ve bir çekirdek dışına taşınım sinyali dizisi (NES) bulunduğunu göstermiştir. Bu sinyal dizilerinin silindiği mutant diziler içeren transfeksiyon çalışmaları, her iki NLS'nin işlevselliğini göstermiş ve Desmin'in çekirdek-sitoplazma arasındaki taşınımındaki potansiyel rolünü güçlendirmiştir.
Mekanik stres altında çekirdekteki Desmin miktarında bir artış gözlenmesine rağmen, Desmin'in çekirdek içindeki özgün rolleri henüz netleştirilmemiştir. Çekirdekte bulunan Desmin'in regülatör rollerinin aydınlatılması öncelikli hedef olarak belirlendiği için, tez kapsamındaki araştırmalar standart fizyolojik koşullar altında sadece statik grupta yürütüldü. Genellikle, mekanik uyarıcılar proteinlerin regülatör işlevlerini tetikleyici olmaktan ziyade yanıtı arttırıcı ve hızlandırıcı bir etkiye sahiptirler. Benzer senaryolar diğer mekanosensitif proteinlerde de gözlenmiştir. Ancak, gelecekteki çalışmalar bu koşulları dikkate almalı, uygun bir deneysel çerçeve oluşturmalı ve farklı fizyolojik koşulları ayrıntılı bir şekilde incelemelidir. Bu bulgular, mekanik gerilim koşulları altında Desmin ve çekirdek bileşenleri arasındaki potansiyel mekanistik etkileşimler hakkında değerli ipuçları sunmaktadır.
Desmin'in çekirdeğe taşınımının önemi, özellikle Desmin'in eksik olduğu embriyonik kök hücreler üzerinde yapılan in vitro çalışmalarla vurgulanmıştır. Bu çalışmalar, Desmin'in düz kasın gelişimi üzerindeki kritik rolünü ve miyogenez sırasında çekirdek işlevleri üzerindeki etkisini ortaya koymaktadır. Desmin ifadesinin RNAi aracılığıyla baskılanması, kas işlevine özgü genlerin ifadesinin bozulması gibi belirgin sonuçlara yol açmaktadır. Desmin'i hedef alan antisens çalışmaları, RNA taşınımındaki rolünü ve MyoD ve myogenin gibi farklılaşma faktörlerinin transaktivasyonunu etkileyebileceğini öne sürmektedir. Ancak, Desmin gibi bir hücre iskeleti proteininin transkripsiyon faktörlerinin denge durum (steady-state) seviyelerini nasıl etkilediği hala bilinmemektedir.
Gen ifadesinin regülasyonu; proliferasyon, farklılaşma, hücre ölümü, hücre büyümesinin durması ve stres yanıtı gibi çeşitli hücresel olaylar sırasında; RNA transkripsiyonu, transkripsiyon sonrası RNA işlenmesi ve modifikasyonları, RNA taşınımı, translasyon ve mRNA/protein stabilitesi gibi farklı aşamalarda gerçekleşir. Desmin hangi regülasyon adımında rol almaktadır?
Gen ifadesinin düzenlenmesindeki tüm adımları ikiye ayırabiliriz. Doğrudan DNA'ya bağlanarak ve dolaylı olarak gen ifadesini düzenleyerek. Bu nedenle, çekirdekte bulunan Desmin'in kromatinle doğrudan etkileşimini araştırmak için ChIP deneyi gerçekleştirildi. Aday olarak seçilen genlerin (MyoD, Nkx2.5 ve MYOG) 3'-UTR bölgelerindeki Desmin varlığı, IgG ile ve antikor olmadan yapılan IP'ler aracılığıyla değerlendirildi. Kat değişim yöntemini kullanarak hesaplanan kat değişim değerlerini karşılaştırdığımızda, ilgili aday genlerin 3’-UTR bölgelerinde Desmin’in doğrudan kromatine bağlanması tespit edilemedi.
Desmin'in potansiyel çekirdek işlevini araştırmak için, zebra balığı verilerine ve literatürdeki mevcut RNA-Seq/proteomik verileri kullanarak işlevsel anotasyon analizleri gerçekleştirildi. Bu çalışma kapsamında özellikle, transkriptom ve proteomun Des KO fareler ile yabanıl tip fareler arasında karşılaştırıldı. Hem transkriptomik hem de proteomik veriler için moleküler işlev üzerine G.O. analizi yapıldığında, özellikle ribozom veya mRNA bağlanması ile ilişkilendirilen istatistiksel olarak anlamlı (P < 0.001) 10 terim belirlendi. Desmin'in regülatör rolü ile ilişkilendirilen 12 terim arasından yalnızca iki terimin Desmin'in doğrudan DNA'ya bağlanarak gen ifadesini etkileyebileceği istatistiksel olarak anlamlı bulundu (P < 0.01); bu terimler tek zincirli DNA bağlanması ve genel transkripsiyon başlatma faktörü bağlanması ile ilişkilendirilmiştir. Bunun yanı sıra, daha önceki araştırmamızda zebra balığı kas dokusunda gerçekleştirilen Desmin IP deneylerinden ve ardından yapılan kütle spektrometrisi analizi ile elde edilen proteomik veriler üzerinde G.O. analizi gerçekleştirildi. İlginç bir şekilde, fare ve zebra balığı örneklerinde yürütülen G.O. analizlerinde Desmin'in regülatör rolü ile ilişkilendirilen dört terim her iki model organizmada da ortak olarak tespit edildi. Sonuç olarak elde edilen veriler, Desmin'in çekirdekteki potansiyel rolünün özellikle mRNA ve ribozom etkileşimleri üzerinden olabileceğini ortaya çıkardı.
Desmin'in mRNA üzerinden gen ifadesini nasıl etkilediğini araştırmak amacıyla, hedef transkriptlerin mRNA stabilitesi ölçüldü. Hücreler içinde mRNA stabilitesini dolaylı olarak değerlendirmenin bir yöntemi, transkripsiyonu inhibe ettikten sonra mRNA yarı ömrünü analiz etmeyi içerir. Bu amaçla, transkripsiyonun inhibe edilmesi için act-D kullanıldı. Hedef genlerin mRNA yarı ömürlerini değerlendirmek için Desmin'in siRNA ile susturulduğu ve kontrol gruplarının kullanıldığı deneyler yapıldı. Transfeksiyonun 72. saatinde transkripsiyonu inhibe etmek için kontrol ve siRNA ile transfekte edilen gruplara 1.7 μM Act-D eklendi. Belirtilen zamanlarda total RNA izole edildi ve hedef transkriptlerin miktarı qRT-PCR ile ölçülerek mRNA yarı ömürleri hesaplandı. Sonuçlar, Desmin'in baskılandığı grupta hem MyoD (39.85'ten 20.62 dakikaya) hem de MYOG (59.65'ten 29.44 dakikaya) için yarı ömürde bir azalma tespit edildi. Hedef transkriptlerin translasyonu üzerinde Act-D'nin etkisini değerlendirmek için qRT-PCR için kullanılan deneysel kurulumu tekrarlandı ve total RNA yerine total protein izole edildi. Ardından gerçekleştirilen Western blot analizi, Desmin'in susturulduğu örneklerde aday proteinlerin translasyon süreci üzerinde herhangi bir inhibisyon etkisinin olmadığını gösterdi. Bu bulgular, Desmin'in etkisinin transkripsiyon veya translasyon süreçlerine doğrudan katılımdan ziyade, mRNA sentezinden sonra meydana gelen süreçlerde daha belirgin olduğu hipotezini desteklemektedir. Translasyon sonrası modifikasyonlar, protein yıkım hızları ve diğer regülatör mekanizmaların RNA stabilitesinden bağımsız olarak protein seviyeleri üzerinde etkili olduğuna dikkat çekilmesi önemlidir. Bununla birlikte, Desmin'in spesifik transkriptlerin translasyon süreçleri üzerindeki olası etkilerinin daha kapsamlı bir şekilde araştırılması gerekmektedir. Bu tez çalışması kapsamında aday olarak seçilen MyoD ve MYOG, miyojenik regülatör faktörler olarak tanımlanır ve miyoblastların proliferasyonundan terminal farklılaşmasına geçiş sürecini ve miyotüplerin birleşmesini düzenleyen kritik transkripsiyon faktörleridir. Bu faktörler, kas öncül hücrelerinin farklılaşma süreci boyunca ilerlemesini kontrol ederek, miyojenik programın başlatılmasından hücrelerin füzyonuna kadar olan evreleri düzenlerler. Myogenin KO farelerde miyoblast oluşumundaki eksiklikler, işlevsel iskelet kasının oluşmamasına ve bu nedenle ciddi bir fenotipe sebep olmaktadır. Bu durum, myogenin'in miyojenik farklılaşmanın ileri aşamalarındaki kritik rolünü teyit etmektedir. Diğer yandan, bu KO fareler, neredeyse normal seviyelerde MyoD ifade ediyor olmalarına rağmen, çok çekirdekli hücre oluşumlarında ve çekirdek yoğunluğunda belirgin bir azalma göstermektedir ki bu da kas kütlesinde kayda değer bir düşüşe neden olmaktadır. Ancak, bu hücrelerde miyojenik farklılaşma belirteçlerinin, MyHC ve Aktin de dahil olmak üzere, eksikliği gözlenmektedir. Bu bulgular, myogenin'in farklılaşma sürecindeki hayati önemini vurgulamaktadır. Bu kritik farklılaşma regülatör genlerin mRNA yarı ömürlerindeki artışlar, C2C12 hücrelerinin farklılaşmasının başlangıç aşamasını belirgin bir şekilde hızlandırmaktadır. Bu bilgiler doğrultusunda Desmin’in susturulduğunda ve MyoD ve MYG’un stabilitesindeki değişikliklerin kasların farklılaşma üzerindeki morfolojik etkileri incelendi. Desmin'in susturulduğu hücrelerin miyojenik potansiyelini değerlendirmek için öncelikle transfeksiyonun yapıldığı hücrelerde Desmin proteininin ifade örüntüsü incelendi. Sonuçlar, farklılaşma sonrası beşinci güne kadar Desmin proteininin ifade düzeyinin bazal seviyelerde kaldığını gösterdi. Ancak, yedinci gün Desmin ifadesinde bir artış gözlendi. Hücrelerin canlılığı ise hiçbir grupta önemli ölçüde değişmedi. Farklılaşmanın beşinci gününde, çok çekirdekli MyHC pozitif miyotüplerin miyojenik potansiyelinin değerlendirilmesi için altı parametre dikkate alındı. Myotüp oluşumunun kapsamlı bir değerlendirmesi için, susturulan hücreler ve kontrol hücreleri arasında farklılaşma ve füzyon oranının yanı sıra dallanma noktalarının sayısı, miyotüp alan yüzdesi, ortalama miyotüp çapı ve çekirdeklerin oluşturduğu küme sayısı gibi altı parametre nicel bir analizle karşılaştırıldı. Sonuçlar, farklılaşmanın başlatılmasından beş gün sonra Desmin'in susturulduğu hücrelerde bu parametrelerde kontrol grubuna göre önemli bir azalma olduğunu gösterdi. Elde edilen veriler, MyHC ifade eden hücre sayısının transfekte hücrelerde önemli bir azalma göstermemesine rağmen, miyojenik farklılaşmada, özellikle miyotüp olgunlaşma aşamasında, füzyon sürecinin hücrelerin ikili çekirdek pozisyonunda özellikle duraksadığını göstermektedir. Elde edilen bulgular, Desmin'in çekirdekte yerleşim göstermeyen MFM1 hastalarından elde edilen hücrelerde, Desminin susturulduğu hücrelerde gözlenen farklılaşma bozukluğu ile benzer sonuçlara yol açmıştır. Desmin ifadesinin %80 oranında başarılı bir şekilde baskılanmasına rağmen, geriye kalan %20'lik oran, normal miyogenezin sürdürülmesi için yetersiz kalmıştır. Ancak, miyojenik potansiyelin azalması ve farklılaşmış hücrelerin morfolojisindeki değişimler, yalnızca miyogenezin temel regülatörlerindeki mutasyonlarla sınırlı olmayıp, aynı zamanda çeşitli kas distrofilerinde kritik bir faktör olarak kabul edilen hücre iskeleti bileşenlerindeki mutasyonlardan da etkilenebilir. Miyogenezin temel regülatörlerinin RNA stabilitesindeki azalma ve hasarlı miyojenik farklılaşma sürecinin ortaya çıkması, mekanik uyarıcıların olmadığı durumlarda bile Desmin'in regülatör rolünün varlığına işaret etmektedir. Mekanosensitif proteinler doğrudan mekanik kuvvetleri algılamak ve hücresel yanıtları başlatmak için tasarlanmış olmalarına rağmen (mekanoregülatör işlev), bunların çoğu, mekanik uyarıcılar olmaksızın da biyokimyasal sinyaller tarafından aktifleştirilebilir. Örnek olarak, fokal adhezyon kinazı (FAK) olarak bilinen bir protein verilebilir. FAK, hücrenin adezyon, göç, proliferasyon ve hayatta kalmasını düzenleyen sinyal iletim yolaklarında rol alan bir proteindir. FAK'ın fokal adezyonları üzerinde etki gösteren mekanik kuvvetler tarafından aktifleştirildiği bilinmesine rağmen, aynı zamanda mekanik uyarıcılardan bağımsız olarak biyokimyasal sinyaller tarafından da aktifleşebilir. Örneğin, epidermal büyüme faktörü (EGF) gibi büyüme faktörleri, FAK'ı tirozin kinaz sinyal iletim yolları aracılığıyla aktifleştirerek hücresel yanıtlara yol açabilir. Bu nedenle, FAK, doğrudan mekanik uyarım olmaksızın bile hücresel süreçleri regüle edebilir. Benzer şekilde, bazı mekanosensitif proteinler, hücre içi sinyalleşmede rol oynar ve farklı uyarıcılara yanıt olarak tetiklenebilirler. Bir örnek, mekanosensitif proteinler tarafından hücre içi kalsiyum sinyalinin regülasyonudur. Bu proteinler, hücre zarındaki mekanosensitif kanallar aracılığıyla hücre dışı ortamdan mekanik stresi algılayabilir ve buna yanıt olarak hücreye kalsiyum iyonlarının akışını tetikleyebilir. Ancak, bu proteinler aynı zamanda hücre içi sinyalleşme moleküllerinin aktivasyonunu da düzenleyebilirler. Bu nedenle, mekanik uyarıcılar olmamasına rağmen, bu proteinler hücresel sinyal iletimine katkıda bulunabilirler.
Sonuç olarak, bu tez, iskelet kası hücrelerinde Desmin'in çok yönlü rolüne dair değerli veriler sunmaktadır. Elde edilen sonuçlar, Desmin'in iskelet kası üzerindeki etkisini kontrol eden karmaşık moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak için gelecekteki araştırmalara temel oluşturacak ve kas ile ilgili hasarlara yönelik terapötik çalışmalara zemin oluşturacaktır. Ancak Desmin'in bir ara filament proteini olarak monomer, dimer ve tetramer şeklinde farklı aşamalardan geçerek sonunda filamentler oluşturması göz önünde bulundurulmalı ve çekirdekte bulunan Desmin'in hangi yapıda olduğu araştırılması gereken konular arasında yer alır. Çekirdekte bulunan Desmin'in yapısını incelemek, homodimer oluşturup oluşturmadığını veya başka proteinlerle heterodimerik bir durumda olup olmadığını belirlemek son derece önemlidir. Bu bulgu, yalnızca Desmin'in çekirdeğe taşınımı altında yatan mekanizmaları değil, aynı zamanda Desmin'in çekirdek içinde farklı rollerini de ortaya çıkarabilir. Bu roller, RNA veya proteinler için bir taşıyıcı olarak hizmet etmekten, bir sinyal kaskadının bir parçası olmaya veya çekirdek içinde tamamen yapısal bir rol üstlenmeye kadar çeşitli olabilir. Bunun yanında dikkate alınması gereken bir diğer konu, farklı fizyolojik koşullar altında, örneğin mekanik stres altında, ChIP-Seq aracılığıyla daha detaylı bir araştırmanın yapılmasıdır. Bu yöntem, DNA ile ilişkili proteinlerin etkileşim bölgelerinin belirlenme şansını artırabilir. Bu yöntemle, Desmin'in global bağlanma bölgeleri kapsamlı bir şekilde haritalanabilir, böylece farklı hücresel durumlarda söz konusu etkileşimleri hakkında kapsamlı bir fikir sağlayabilir. Ayrıca, Desmin'in transkripsiyon faktörlerinin denge durumlarını nasıl etkilediği konusundaki kesin mekanizma henüz spekülatif niteliktedir. Gelecek çalışmalar, Desmin'in mRNA ile ilişkisini dikkate almalı ve gen ifadesini düzenleyen karmaşık ağlardaki rolünün daha geniş bağlamını araştırmalıdır.
Miyojenik farklılaşma üzerinde Desmin'in regülatör etkisinin moleküler mekanizmaları ve sinyal yolaklarını aydınlatmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Özellikle, miyogenezde rol oynayan önemli regülatör proteinlerle Desmin arasındaki etkileşimi araştırmak, iskelet kası gelişimini düzenleyen karmaşık moleküler olaylar hakkında önemli bilgi sağlayabilir. Ayrıca, Desmin'in mekanik stres veya büyüme faktörleri gibi dış uyarıcılara karşı oluşan hücresel yanıtların düzenlenmesindeki rolünü araştırmak, regülatör işlevi ile ilişkili olan yeni yolakları ortaya çıkarabilir. Dahası, Desmin'in çekirdek bileşenleriyle etkileşim dinamiklerini, özellikle transkripsiyon faktörleri ve kromatin modifiye edici enzimlerle olan etkileşimlerini incelemek, miyojenik farklılaşma sırasında transkripsiyonel regülasyondaki katkısını aydınlatabilir. Desmin’in ifade olmadığı durumlarda farklı fizyolojik koşullar altında ChIP-Seq ve RNA dizileme gibi ileri tekniklerden elde edilen verilerin entegrasyonu, iskelet kası hücrelerinde Desmin'in regülatör ağı hakkında kapsamlı bilgi sunabilir. Genel olarak, Desmin'in moleküler etkileşimlerinin ve sinyal kaskatlarının daha derinlemesine incelenmesi, miyojenik farklılaşmadaki kesin rolünün açığa çıkarılması ve kas ile ilgili hasarlar için hedefe yönelik terapötik stratejilerin geliştirilmesi umut verici görünüyor. | tr_TR |
| dc.description.ozet | İskelet kas dokusunun, çevresel değişikliklere uyum sağlaması gerekmektedir. Bu uyum, protein sentezinin artışıyla sağlanır. Kasın çevresel değişikliklere yanıtını etkileyen faktörler arasında büyüme faktörlerindeki değişiklikler, sitokin seviyeleri, nöral uyarım ve egzersiz/direnç antrenmanı gibi mekanik yüklemeler yer almaktadır. Ayrıca, amino asitler de (AA) adaptif yanıtı arttıran faktörlerdendir.
Hücre iskeleti, hücrenin şeklini korur ve yapısal desteği sağlar. Bu özellik, hücrenin dış etkilere karşı direncini arttırır ve hücrenin işlevselliğini sürdürmesine yardımcı olur. Ayrıca, hücre iskeleti, hücre içinde ve hücreler arasında hareketi sağlar. Hhücrenin göç etmesi, bölünmesi, organellerin yer değiştirmesi gibi süreçlerde önemli bir rol oynar. Hücre iskeleti ayrıca hücre içindeki maddelerin taşınması ve hücre zarının şeklinin değiştirilmesi gibi işlevleri destekler. Hücre iskeletinin bu temel işlevleri, hücrenin yapısal bütünlüğünü koruması ve hareket yeteneğini sağlamasıyla hücrenin yaşamsal işlevlerini destekler. Hücre iskeleti, hücre biyolojisi ve hücrenin işlevi açısından önemli bir role sahiptir. Bu işlevler, hücre iskeletinde bulunan üç temel filament türü aracılığıyla gerçekleştirilir: aktin, mikrotübüller ve ara filamentler (IF). Bu yapılar hücrenin içinde ve dışında çeşitli süreçlerin gerçekleşmesini sağlarlar.
IF'lerin ortalama çapı yaklaşık olarak 10 nm'dir ve bu da onları mikrofilamentlerin (7 nm) ve mikrotübüllerin (yaklaşık olarak 25 nm) ortalama çapı arasına yerleştirir. Diğer hücre iskeleti bileşenlerin aksine, IF'ler hücresel hareketlilikte aktif olarak yer almazlar. Bunun yerine, temel rolleri çoğunlukla yapısal olup, hücreleri ve dokuları mekanik kuvvetlere karşı desteklemektir.
Mikrofilament ve mikrotübüllerin monomerleri sırasıyla aktin ve tübülin iken IF’ler temel yapı taşlarında heterojenlik gösterirler. 50' den fazla IF proteini, yapısal benzerliklerine göre altı gruba ayrılabilir. Epitel hücreleri, her biri yaklaşık olarak 15 farklı proteini içeren ve keratinler olarak bilinen Tip I (asidik) ve Tip II (nötr/bazik) IF' leri ifade ederler. Epitel hücrelerde, her iki tip keratin de birlikte polimerleşme (co-polymerization) yoluyla sentezlenir. Sert keratinler, saç, tırnak ve boynuzlar gibi özelleşmiş yapıların gelişimine katkıda bulunur. Bu süreçte, farklı tip keratinler bir araya gelirler. Tip III ara filamentler, nöronlarda bulunan ara filamentler olup nöronların yapısal bütünlüğünü korur ve sinir sinyallerinin iletilmesinde rol oynar. Tip IV ara filamentler, nöronların aksiyon potansiyellerinin iletiminde görev alan nörofilamentlerdir. Tip V ara filamentler, bazı özel hücre türlerinde ve dokularda bulunan az bilinen filamentlerdir. Bu tip IF'lerin işlevleri ve özellikleri henüz detaylı bir şekilde açıklanmamıştır.
IF'ler, ortak yapısal özelliklere sahiptirler. Tüm IF’lerde amino-terminal baş domaini, merkezi α-helikal rod domaini ve karboksiterminal kuyruk domaini bulunur. Bu proteinlerin lif benzeri yapıları ve merkezi α-helikal rod domainleri IF'lerin dördüncül yapısında dayanıklılık ve esneklik sağlar. Baş ve kuyruk domainlerdeki değişkenlik, farklı ara filament proteinleri arasındaki moleküler ağırlık farkına yol açar.
Desmin, 53 kDa molekül ağırlığına sahip tip III IF olup sarkoplazmada Z bandında bulunur. Memelilerde, tek bir DES tarafından kodlanır ve 2q35'te bulunur. DES, 9 ekson ve sekiz introndan oluşur. Kas dokusundaki temel IF olan Desmin'in yanı sıra, kas hücrelerinde Vimentin ve Nestin gibi diğer ara filamentler de bulunabilir. Desmin'in başlıca işlevi, miyofibril Z bandının etrafında bir karkas oluşturmaktır. Bu karkas, tüm kasılmayı düzenleyen mekanizmayı sağlar ve subsarkolemmal hücre iskeletine bağlanarak bir ağ oluşturur. Ayrıca, bu protein, çekirdek ve mitokondri gibi organellerin konumlandırılmasında kritik bir rol oynar. Desmin, çizgili kas hücrelerinin Z diskleri etrafında uzunlamasına bağlantılar oluşturur. İskelet kasında miyotendinous ve nöromüsküler bağlantılarda, kalp kasında ise kardiomyositleri birbirine bağlayan interkale disklerde yer alır. Memelilerde, kalp kası hücrelerinde Desmin miktarı iskelet kası hücrelerinden daha yüksektir (sırasıyla toplam proteinin %2'si ve %0,35'i).
Miyogenez farklılaşma sürecinde miyogenik bir belirteç olarak tanınan Desmin, miyogenez sırasında ortaya çıkan en erken proteinlerden biridir. Desmin, farklılaşmış kas hücrelerinde (miyotüplerde) yüksek düzeyde ifade edilirken, çoğalan miyoblastlarda ve satellit hücrelerinde minimal düzeyde bulunur. Desmin ifadesi, embriyonik gelişimin erken aşamalarında, özellikle fare embriyolarının 7.5. gün civarındaki prekardiyak bölgelerinde başlar. Daha sonra, 9. gün civarında miyotomlar ve düz kas hücrelerinde gözlenir.
DES'teki hastalık ile ilişkili varyasyonlar, hem iskelet hem de kalp kaslarını etkileyen bir dizi hasara (alternatif olarak desminopatiler olarak adlandırılır) neden olur. Desminopatiler veya Desmin ile ilişkili miyopatiler (DRM) klinik ve genetik olarak çeşitlilik gösteren Miyofibriller Miyopatiler'in (MFM) bir alt türü olarak da bilinir. Farklılık, Desmin için pozitif protein birikimlerinin varlığı ve miyofibrillerde görülen dejeneratif değişikliklerle belirlenir.
Ailevi desminopatilerde, kalıtım modeli genellikle otozomal dominant veya otozomal resesif olarak sınıflandırılır. Ancak, birçok vakada, de novo DES mutasyonlarıyla ilişkilendirilen ailevi bir arka plan bulunmamaktadır. Hastalığın başlangıç yaşı ve seyri, kalıtım modeline ve etkilenen protein domainlerine bağlı olarak değişebilir.
Desminopati genellikle yaşamın orta dönemlerinde (üçüncü ila dördüncü on yıllarında) ortaya çıkar ve belirtiler MFM1'e göre daha erken yaşlarda görülür. Kalp yetmezliği sıkça rastlanan bir durumdur ve desminopati vakalarında oranları %40 ila %90 arasında değişmektedir. Kasların distrofik durumu genellikle yavaş ilerler. Hastalığın erken evrelerinde, distal kasları daha çok etkilerken, proksimal kaslar ve özellikle alt ekstremiteler, üst ekstremitelere göre daha fazla etkilenir. Proksimal kas distrofisi, ileri evrelerde belirgin hale gelebilir. Distrofi düzeyi, aynı aileye mensup bireyler arasında bile önemli ölçüde değişebilir.
c.1289-2A>G mutasyonu, daha önce grubumuz tarafından bildirilen, Desmin'in kuyruk domaininde bulunan homozigot bir splice site mutasyonudur. Bu mutasyon, Desmin’in Lamin B bağlama domainine 16 amino asit eklemiş ve etkilenen bireylerde MFM1 hastalığının gelişimine yol açmıştır. Otozomal resesif kalıtıma sahip Desmin mutasyonları genellikle erken başlangıçlı belirtiler (ortalama beş yaşta başlar) ve ağır miyopati ve kardiyomiyopati ile karakterize bir seyir gösterir. Resesif kalıtıma sahip mutasyonlar sadece birkaç hastada tanımlanmış olmasına rağmen, c.1289-2A>G mutasyonunu taşıyan bireylerde kardiyomiyopati içermeyen geç başlangıçlı semptomlar ortaya çıkmıştır. Bu mutasyon, mutant Desmin'in ifade düzeyinde azalmaya neden olmamıştır. İskelet kası liflerinin hücre iskeleti ağında herhangi bir anormalliğe neden olmaz. Hasta bireylerin kas kesitlerinde yapılan araştırmalarda çekirdek ve mitokondri gibi zara sahip organellerin konumunda anormal değişiklikler bulunmamıştır. Bununla birlikte, sol gastroknemius kasından alınan biyopsi örneklerinde, kas liflerinin boyutunda farklılık ve lif boyunca gözlenen çekirdeklerin yanısıra internal çekirdeklerin varlığı da tespit edilmiş ve distrofik özellikler belirlenmiştir. Hasta hücrelerinde mekanotransdüksiyon hasarı öngörülmüş olsa da, hastalığın kesin nedeni halen bilinmemektedir. Literatürde yaygın olarak görülen desminopati patolojisi bulunmasa da, bu hastalarda Desmin-Lamin B etkileşiminin eksikliğinin hastalığın gelişimine yol açabileceği düşünülmektedir.
Desmin ve Lamin B'nin birbirleriyle fiziksel etkileşime girerek çekirdek ve sitoplazma arasında bir iletişim ağı oluşturduğunu gösteren araştırmalar bulunmaktadır. Bu etkileşim, zebra balığı kas dokusunda yapılan eş-immün çöktürme deneyleri ile doğrulanmıştır. Ayrıca, Desmin'in Torpedo marmorata elektrik hücresinin postsinaptik membranında Lamin B ile etkileştiğini tanımlayan başka bir çalışma da mevcuttur.
Farklı çalışmalardan elde edilen bulgular, Lamin dışındaki diğer ara filamentlerin çekirdeğe yerleşebileceğini gösteriyor. Bu durumda, hücre iskeleti elemanlarının çekirdeğin transkripsiyon ile ilgili süreçlerini dinamik olarak etkileyebileceği düşünülüyor.
Elde ettiğimiz ön veriler, Desminin çekirdekte yerleşmemesinin, kaslarda mekanotransdüksiyon hasarına ve uzun süreli mekanik stres altında kas dejenerasyonuna yol açabileceğini öne sürmektedir. Bu tez çalışmasındaki hipotezimiz, çizgili kas hücrelerinde mekanik gerilimin Desmin proteininin çekirdeğe yerleşimini arttırdığı ve bunun sonucunda aday genlerin ifade seviyelerinde doğrudan veya dolaylı olarak değişikliklere yol açtığı yönünde oluşmuştur. Bu tezin temel amacı ise, Desmin'in mekanik stres koşullarında çekirdekte yerleşiminin anlaşılmasına katkı sağlamak ve Desmin'in regülasyon yolaklarındaki rolünü araştırmaktır.
Bu doğrultuda, Desmin'in hücre içindeki konumunu araştırmak ve mekanik gerilimin Desminin hücredeki yerleşimi üzerinde olan etkisini değerlendirmek için immünfloresan boyama çalışmaları gerçekleştirildi. Desmin'i tanıyan antikorun yanı sıra hücre germe deneyleri için pozitif kontrol olarak T-YAP'i, çekirdek belirteci olarak ise DAPI ve Lamin B'yi tanıyan antikorlar kullanıldı. Hücre germe deneyinden sonra, Pearson Korelasyon Katsayısı (PCC) kullanarak piksel tabanlı analiz yoluyla iki kanal arasındaki örtüşme derecesi (Desmin/DAPI, Desmin/Lamin B ve Desmin/T-YAP) ve dolayısıyla proteinlerin eş-yerleşim miktarı kantitatif olarak ölçüldü. İmmünofloresan boyama işleminden sonra, farklı gerilim seviyelerine maruz kalan hücre grupları arasındaki eş-yerleşim değerleri istatistiksel olarak analiz edildi. Kontrol grubu ile çeşitli gerilmeye maruz kalan gruplar arasında anlamlı bir PCC değeri artışı gözlendi (p < 0.01). Eş-yerleşim analizi, Desmin'in çekirdek içinde bulunduğunu ve Lamin B ve DAPI gibi çekirdek belirteçleriyle aynı konumda yer aldığını ortaya koydu. Bu durum özellikle, statik gruplara göre gerilime maruz kalan hücrelerde belirgin bir şekilde artış gösterdi.
Desmin'in çekirdek yerleşimini doğrulamak için, protein fraksiyonu deneyleri gerçekleştirildi. Bu fraksiyonun kalite kontrolü, çekirdek (Lamin B) ve sitoplazmik (GAPDH) belirteçler kullanılarak değerlendirildi. Ardından, aynı hücresel fraksiyonlar, Desmin'e özgü bir antikorla immünoblot analizine tabi tutuldu. Sonuçlar, Desmin'in hem sitoplazmik hem de çekirdek fraksiyonunda varlığını doğruladı.
Son zamanlarda yapılan çalışmalar, Desmin'in regülatör işlevi, hücresel yerleşimi ve çekirdek-sitoplazma arasındaki taşınımı üzerine odaklanmıştır. Bu çalışmalar Desmin'de iki potansiyel çekirdek yerleşim sinyal dizisi (NLS) ve bir çekirdek dışına taşınım sinyali dizisi (NES) bulunduğunu göstermiştir. Bu sinyal dizilerinin silindiği mutant diziler içeren transfeksiyon çalışmaları, her iki NLS'nin işlevselliğini göstermiş ve Desmin'in çekirdek-sitoplazma arasındaki taşınımındaki potansiyel rolünü güçlendirmiştir.
Mekanik stres altında çekirdekteki Desmin miktarında bir artış gözlenmesine rağmen, Desmin'in çekirdek içindeki özgün rolleri henüz netleştirilmemiştir. Çekirdekte bulunan Desmin'in regülatör rollerinin aydınlatılması öncelikli hedef olarak belirlendiği için, tez kapsamındaki araştırmalar standart fizyolojik koşullar altında sadece statik grupta yürütüldü. Genellikle, mekanik uyarıcılar proteinlerin regülatör işlevlerini tetikleyici olmaktan ziyade yanıtı arttırıcı ve hızlandırıcı bir etkiye sahiptirler. Benzer senaryolar diğer mekanosensitif proteinlerde de gözlenmiştir. Ancak, gelecekteki çalışmalar bu koşulları dikkate almalı, uygun bir deneysel çerçeve oluşturmalı ve farklı fizyolojik koşulları ayrıntılı bir şekilde incelemelidir. Bu bulgular, mekanik gerilim koşulları altında Desmin ve çekirdek bileşenleri arasındaki potansiyel mekanistik etkileşimler hakkında değerli ipuçları sunmaktadır.
Desmin'in çekirdeğe taşınımının önemi, özellikle Desmin'in eksik olduğu embriyonik kök hücreler üzerinde yapılan in vitro çalışmalarla vurgulanmıştır. Bu çalışmalar, Desmin'in düz kasın gelişimi üzerindeki kritik rolünü ve miyogenez sırasında çekirdek işlevleri üzerindeki etkisini ortaya koymaktadır. Desmin ifadesinin RNAi aracılığıyla baskılanması, kas işlevine özgü genlerin ifadesinin bozulması gibi belirgin sonuçlara yol açmaktadır. Desmin'i hedef alan antisens çalışmaları, RNA taşınımındaki rolünü ve MyoD ve myogenin gibi farklılaşma faktörlerinin transaktivasyonunu etkileyebileceğini öne sürmektedir. Ancak, Desmin gibi bir hücre iskeleti proteininin transkripsiyon faktörlerinin denge durum (steady-state) seviyelerini nasıl etkilediği hala bilinmemektedir.
Gen ifadesinin regülasyonu; proliferasyon, farklılaşma, hücre ölümü, hücre büyümesinin durması ve stres yanıtı gibi çeşitli hücresel olaylar sırasında; RNA transkripsiyonu, transkripsiyon sonrası RNA işlenmesi ve modifikasyonları, RNA taşınımı, translasyon ve mRNA/protein stabilitesi gibi farklı aşamalarda gerçekleşir. Desmin hangi regülasyon adımında rol almaktadır?
Gen ifadesinin düzenlenmesindeki tüm adımları ikiye ayırabiliriz. Doğrudan DNA'ya bağlanarak ve dolaylı olarak gen ifadesini düzenleyerek. Bu nedenle, çekirdekte bulunan Desmin'in kromatinle doğrudan etkileşimini araştırmak için ChIP deneyi gerçekleştirildi. Aday olarak seçilen genlerin (MyoD, Nkx2.5 ve MYOG) 3'-UTR bölgelerindeki Desmin varlığı, IgG ile ve antikor olmadan yapılan IP'ler aracılığıyla değerlendirildi. Kat değişim yöntemini kullanarak hesaplanan kat değişim değerlerini karşılaştırdığımızda, ilgili aday genlerin 3’-UTR bölgelerinde Desmin’in doğrudan kromatine bağlanması tespit edilemedi.
Desmin'in potansiyel çekirdek işlevini araştırmak için, zebra balığı verilerine ve literatürdeki mevcut RNA-Seq/proteomik verileri kullanarak işlevsel anotasyon analizleri gerçekleştirildi. Bu çalışma kapsamında özellikle, transkriptom ve proteomun Des KO fareler ile yabanıl tip fareler arasında karşılaştırıldı. Hem transkriptomik hem de proteomik veriler için moleküler işlev üzerine G.O. analizi yapıldığında, özellikle ribozom veya mRNA bağlanması ile ilişkilendirilen istatistiksel olarak anlamlı (P < 0.001) 10 terim belirlendi. Desmin'in regülatör rolü ile ilişkilendirilen 12 terim arasından yalnızca iki terimin Desmin'in doğrudan DNA'ya bağlanarak gen ifadesini etkileyebileceği istatistiksel olarak anlamlı bulundu (P < 0.01); bu terimler tek zincirli DNA bağlanması ve genel transkripsiyon başlatma faktörü bağlanması ile ilişkilendirilmiştir. Bunun yanı sıra, daha önceki araştırmamızda zebra balığı kas dokusunda gerçekleştirilen Desmin IP deneylerinden ve ardından yapılan kütle spektrometrisi analizi ile elde edilen proteomik veriler üzerinde G.O. analizi gerçekleştirildi. İlginç bir şekilde, fare ve zebra balığı örneklerinde yürütülen G.O. analizlerinde Desmin'in regülatör rolü ile ilişkilendirilen dört terim her iki model organizmada da ortak olarak tespit edildi. Sonuç olarak elde edilen veriler, Desmin'in çekirdekteki potansiyel rolünün özellikle mRNA ve ribozom etkileşimleri üzerinden olabileceğini ortaya çıkardı.
Desmin'in mRNA üzerinden gen ifadesini nasıl etkilediğini araştırmak amacıyla, hedef transkriptlerin mRNA stabilitesi ölçüldü. Hücreler içinde mRNA stabilitesini dolaylı olarak değerlendirmenin bir yöntemi, transkripsiyonu inhibe ettikten sonra mRNA yarı ömrünü analiz etmeyi içerir. Bu amaçla, transkripsiyonun inhibe edilmesi için act-D kullanıldı. Hedef genlerin mRNA yarı ömürlerini değerlendirmek için Desmin'in siRNA ile susturulduğu ve kontrol gruplarının kullanıldığı deneyler yapıldı. Transfeksiyonun 72. saatinde transkripsiyonu inhibe etmek için kontrol ve siRNA ile transfekte edilen gruplara 1.7 μM Act-D eklendi. Belirtilen zamanlarda total RNA izole edildi ve hedef transkriptlerin miktarı qRT-PCR ile ölçülerek mRNA yarı ömürleri hesaplandı. Sonuçlar, Desmin'in baskılandığı grupta hem MyoD (39.85'ten 20.62 dakikaya) hem de MYOG (59.65'ten 29.44 dakikaya) için yarı ömürde bir azalma tespit edildi. Hedef transkriptlerin translasyonu üzerinde Act-D'nin etkisini değerlendirmek için qRT-PCR için kullanılan deneysel kurulumu tekrarlandı ve total RNA yerine total protein izole edildi. Ardından gerçekleştirilen Western blot analizi, Desmin'in susturulduğu örneklerde aday proteinlerin translasyon süreci üzerinde herhangi bir inhibisyon etkisinin olmadığını gösterdi. Bu bulgular, Desmin'in etkisinin transkripsiyon veya translasyon süreçlerine doğrudan katılımdan ziyade, mRNA sentezinden sonra meydana gelen süreçlerde daha belirgin olduğu hipotezini desteklemektedir. Translasyon sonrası modifikasyonlar, protein yıkım hızları ve diğer regülatör mekanizmaların RNA stabilitesinden bağımsız olarak protein seviyeleri üzerinde etkili olduğuna dikkat çekilmesi önemlidir. Bununla birlikte, Desmin'in spesifik transkriptlerin translasyon süreçleri üzerindeki olası etkilerinin daha kapsamlı bir şekilde araştırılması gerekmektedir. Bu tez çalışması kapsamında aday olarak seçilen MyoD ve MYOG, miyojenik regülatör faktörler olarak tanımlanır ve miyoblastların proliferasyonundan terminal farklılaşmasına geçiş sürecini ve miyotüplerin birleşmesini düzenleyen kritik transkripsiyon faktörleridir. Bu faktörler, kas öncül hücrelerinin farklılaşma süreci boyunca ilerlemesini kontrol ederek, miyojenik programın başlatılmasından hücrelerin füzyonuna kadar olan evreleri düzenlerler. Myogenin KO farelerde miyoblast oluşumundaki eksiklikler, işlevsel iskelet kasının oluşmamasına ve bu nedenle ciddi bir fenotipe sebep olmaktadır. Bu durum, myogenin'in miyojenik farklılaşmanın ileri aşamalarındaki kritik rolünü teyit etmektedir. Diğer yandan, bu KO fareler, neredeyse normal seviyelerde MyoD ifade ediyor olmalarına rağmen, çok çekirdekli hücre oluşumlarında ve çekirdek yoğunluğunda belirgin bir azalma göstermektedir ki bu da kas kütlesinde kayda değer bir düşüşe neden olmaktadır. Ancak, bu hücrelerde miyojenik farklılaşma belirteçlerinin, MyHC ve Aktin de dahil olmak üzere, eksikliği gözlenmektedir. Bu bulgular, myogenin'in farklılaşma sürecindeki hayati önemini vurgulamaktadır. Bu kritik farklılaşma regülatör genlerin mRNA yarı ömürlerindeki artışlar, C2C12 hücrelerinin farklılaşmasının başlangıç aşamasını belirgin bir şekilde hızlandırmaktadır. Bu bilgiler doğrultusunda Desmin’in susturulduğunda ve MyoD ve MYG’un stabilitesindeki değişikliklerin kasların farklılaşma üzerindeki morfolojik etkileri incelendi. Desmin'in susturulduğu hücrelerin miyojenik potansiyelini değerlendirmek için öncelikle transfeksiyonun yapıldığı hücrelerde Desmin proteininin ifade örüntüsü incelendi. Sonuçlar, farklılaşma sonrası beşinci güne kadar Desmin proteininin ifade düzeyinin bazal seviyelerde kaldığını gösterdi. Ancak, yedinci gün Desmin ifadesinde bir artış gözlendi. Hücrelerin canlılığı ise hiçbir grupta önemli ölçüde değişmedi. Farklılaşmanın beşinci gününde, çok çekirdekli MyHC pozitif miyotüplerin miyojenik potansiyelinin değerlendirilmesi için altı parametre dikkate alındı. Myotüp oluşumunun kapsamlı bir değerlendirmesi için, susturulan hücreler ve kontrol hücreleri arasında farklılaşma ve füzyon oranının yanı sıra dallanma noktalarının sayısı, miyotüp alan yüzdesi, ortalama miyotüp çapı ve çekirdeklerin oluşturduğu küme sayısı gibi altı parametre nicel bir analizle karşılaştırıldı. Sonuçlar, farklılaşmanın başlatılmasından beş gün sonra Desmin'in susturulduğu hücrelerde bu parametrelerde kontrol grubuna göre önemli bir azalma olduğunu gösterdi. Elde edilen veriler, MyHC ifade eden hücre sayısının transfekte hücrelerde önemli bir azalma göstermemesine rağmen, miyojenik farklılaşmada, özellikle miyotüp olgunlaşma aşamasında, füzyon sürecinin hücrelerin ikili çekirdek pozisyonunda özellikle duraksadığını göstermektedir. Elde edilen bulgular, Desmin'in çekirdekte yerleşim göstermeyen MFM1 hastalarından elde edilen hücrelerde, Desminin susturulduğu hücrelerde gözlenen farklılaşma bozukluğu ile benzer sonuçlara yol açmıştır. Desmin ifadesinin %80 oranında başarılı bir şekilde baskılanmasına rağmen, geriye kalan %20'lik oran, normal miyogenezin sürdürülmesi için yetersiz kalmıştır. Ancak, miyojenik potansiyelin azalması ve farklılaşmış hücrelerin morfolojisindeki değişimler, yalnızca miyogenezin temel regülatörlerindeki mutasyonlarla sınırlı olmayıp, aynı zamanda çeşitli kas distrofilerinde kritik bir faktör olarak kabul edilen hücre iskeleti bileşenlerindeki mutasyonlardan da etkilenebilir. Miyogenezin temel regülatörlerinin RNA stabilitesindeki azalma ve hasarlı miyojenik farklılaşma sürecinin ortaya çıkması, mekanik uyarıcıların olmadığı durumlarda bile Desmin'in regülatör rolünün varlığına işaret etmektedir. Mekanosensitif proteinler doğrudan mekanik kuvvetleri algılamak ve hücresel yanıtları başlatmak için tasarlanmış olmalarına rağmen (mekanoregülatör işlev), bunların çoğu, mekanik uyarıcılar olmaksızın da biyokimyasal sinyaller tarafından aktifleştirilebilir. Örnek olarak, fokal adhezyon kinazı (FAK) olarak bilinen bir protein verilebilir. FAK, hücrenin adezyon, göç, proliferasyon ve hayatta kalmasını düzenleyen sinyal iletim yolaklarında rol alan bir proteindir. FAK'ın fokal adezyonları üzerinde etki gösteren mekanik kuvvetler tarafından aktifleştirildiği bilinmesine rağmen, aynı zamanda mekanik uyarıcılardan bağımsız olarak biyokimyasal sinyaller tarafından da aktifleşebilir. Örneğin, epidermal büyüme faktörü (EGF) gibi büyüme faktörleri, FAK'ı tirozin kinaz sinyal iletim yolları aracılığıyla aktifleştirerek hücresel yanıtlara yol açabilir. Bu nedenle, FAK, doğrudan mekanik uyarım olmaksızın bile hücresel süreçleri regüle edebilir. Benzer şekilde, bazı mekanosensitif proteinler, hücre içi sinyalleşmede rol oynar ve farklı uyarıcılara yanıt olarak tetiklenebilirler. Bir örnek, mekanosensitif proteinler tarafından hücre içi kalsiyum sinyalinin regülasyonudur. Bu proteinler, hücre zarındaki mekanosensitif kanallar aracılığıyla hücre dışı ortamdan mekanik stresi algılayabilir ve buna yanıt olarak hücreye kalsiyum iyonlarının akışını tetikleyebilir. Ancak, bu proteinler aynı zamanda hücre içi sinyalleşme moleküllerinin aktivasyonunu da düzenleyebilirler. Bu nedenle, mekanik uyarıcılar olmamasına rağmen, bu proteinler hücresel sinyal iletimine katkıda bulunabilirler.
Sonuç olarak, bu tez, iskelet kası hücrelerinde Desmin'in çok yönlü rolüne dair değerli veriler sunmaktadır. Elde edilen sonuçlar, Desmin'in iskelet kası üzerindeki etkisini kontrol eden karmaşık moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak için gelecekteki araştırmalara temel oluşturacak ve kas ile ilgili hasarlara yönelik terapötik çalışmalara zemin oluşturacaktır. Ancak Desmin'in bir ara filament proteini olarak monomer, dimer ve tetramer şeklinde farklı aşamalardan geçerek sonunda filamentler oluşturması göz önünde bulundurulmalı ve çekirdekte bulunan Desmin'in hangi yapıda olduğu araştırılması gereken konular arasında yer alır. Çekirdekte bulunan Desmin'in yapısını incelemek, homodimer oluşturup oluşturmadığını veya başka proteinlerle heterodimerik bir durumda olup olmadığını belirlemek son derece önemlidir. Bu bulgu, yalnızca Desmin'in çekirdeğe taşınımı altında yatan mekanizmaları değil, aynı zamanda Desmin'in çekirdek içinde farklı rollerini de ortaya çıkarabilir. Bu roller, RNA veya proteinler için bir taşıyıcı olarak hizmet etmekten, bir sinyal kaskadının bir parçası olmaya veya çekirdek içinde tamamen yapısal bir rol üstlenmeye kadar çeşitli olabilir. Bunun yanında dikkate alınması gereken bir diğer konu, farklı fizyolojik koşullar altında, örneğin mekanik stres altında, ChIP-Seq aracılığıyla daha detaylı bir araştırmanın yapılmasıdır. Bu yöntem, DNA ile ilişkili proteinlerin etkileşim bölgelerinin belirlenme şansını artırabilir. Bu yöntemle, Desmin'in global bağlanma bölgeleri kapsamlı bir şekilde haritalanabilir, böylece farklı hücresel durumlarda söz konusu etkileşimleri hakkında kapsamlı bir fikir sağlayabilir. Ayrıca, Desmin'in transkripsiyon faktörlerinin denge durumlarını nasıl etkilediği konusundaki kesin mekanizma henüz spekülatif niteliktedir. Gelecek çalışmalar, Desmin'in mRNA ile ilişkisini dikkate almalı ve gen ifadesini düzenleyen karmaşık ağlardaki rolünün daha geniş bağlamını araştırmalıdır.
Miyojenik farklılaşma üzerinde Desmin'in regülatör etkisinin moleküler mekanizmaları ve sinyal yolaklarını aydınlatmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Özellikle, miyogenezde rol oynayan önemli regülatör proteinlerle Desmin arasındaki etkileşimi araştırmak, iskelet kası gelişimini düzenleyen karmaşık moleküler olaylar hakkında önemli bilgi sağlayabilir. Ayrıca, Desmin'in mekanik stres veya büyüme faktörleri gibi dış uyarıcılara karşı oluşan hücresel yanıtların düzenlenmesindeki rolünü araştırmak, regülatör işlevi ile ilişkili olan yeni yolakları ortaya çıkarabilir. Dahası, Desmin'in çekirdek bileşenleriyle etkileşim dinamiklerini, özellikle transkripsiyon faktörleri ve kromatin modifiye edici enzimlerle olan etkileşimlerini incelemek, miyojenik farklılaşma sırasında transkripsiyonel regülasyondaki katkısını aydınlatabilir. Desmin’in ifade olmadığı durumlarda farklı fizyolojik koşullar altında ChIP-Seq ve RNA dizileme gibi ileri tekniklerden elde edilen verilerin entegrasyonu, iskelet kası hücrelerinde Desmin'in regülatör ağı hakkında kapsamlı bilgi sunabilir. Genel olarak, Desmin'in moleküler etkileşimlerinin ve sinyal kaskatlarının daha derinlemesine incelenmesi, miyojenik farklılaşmadaki kesin rolünün açığa çıkarılması ve kas ile ilgili hasarlar için hedefe yönelik terapötik stratejilerin geliştirilmesi umut verici görünüyor. | tr_TR |
| dc.contributor.department | Tıbbi Biyoloji | tr_TR |
| dc.embargo.terms | 6 ay | tr_TR |
| dc.embargo.lift | 2024-09-09T11:22:46Z | |
| dc.funding | TÜBİTAK | tr_TR |
